李 玲，李 斌，幸海燕，陳劍鴻（第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

·實驗研究·

缺氧條件下人卵巢癌細胞對順鉑耐藥與TLR9的關(guān)系研究Δ

李 玲＊，李 斌，幸海燕，陳劍鴻#（第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

目的：研究缺氧條件下人卵巢癌細胞（SKOV3）對順鉑耐藥與Toll樣受體9（TLR9）的關(guān)系。方法：采用免疫熒光法檢測破膜和未破膜SKOV3中TLR9的表達。取SKOV3，加入TLR9特異性激動劑CpG-ODN 2006（A組）及其同型對照CpG-ODN 2006 control（B組）作用6、12、24 h后，加入順鉑，以CCK-8法檢測細胞抑制率。取SKOV3或經(jīng)0（未加）、1、10、102、103μmol/LTLR9特異性拮抗劑氯喹預(yù)處理3 h后的SKOV3，加入SKOV3常氧（21%O2）、缺氧（1%O2）孵育6、12、24 h的細胞上清作用24 h后，加入順鉑，檢測細胞增殖抑制率，計算預(yù)處理細胞缺氧時藥物抑制率的降低倍數(shù)（HICR）；并采用Western blot法檢測常氧24 h細胞上清（C組）、缺氧24 h細胞上清（D組）、缺氧24 h細胞上清+10μmol/L氯喹（E組）條件下SKOV3中多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）的表達。結(jié)果：TLR9在SKOV3的細胞膜和細胞質(zhì)中均有表達。與A組比較，B組細胞增殖抑制率降低（P＜0.01）。與常氧細胞上清比較，缺氧細胞上清作用后細胞增殖抑制率降低（P＜0.05）。與未加氯喹比較，加入10、102μmol/L氯喹能明顯降低HICR（P＜0.01），其中缺氧24 h細胞上清+10μmol/L氯喹降低最明顯。與C組比較，D組細胞中MRP表達增強（P＜0.01）；與D組比較，E組細胞中MRP表達減弱（P＜0.01）。結(jié)論：TLR9受體在缺氧下可被激活，并可導(dǎo)致SKOV3對順鉑耐藥，該作用可能與上調(diào)MRP表達有關(guān)。

人卵巢細胞；缺氧；化療敏感性；Toll樣受體9；順鉑

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，目前除手術(shù)治療外，順鉑是治療卵巢癌的一線化療藥物。但卵巢癌細胞對順鉑的耐藥嚴重影響了其治療效果，因此，探索卵巢癌細胞耐藥相關(guān)因素及機制，尋找有效逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點，對卵巢癌的治療具有重要意義。

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族中的TLR9，是一種模式識別受體，可以識別微生物衍生的分子模式結(jié)構(gòu)（如：m tDNA），并引起受體的結(jié)構(gòu)性變化，然后通過銜接蛋白M yD88的募集反應(yīng)，促進激酶類有絲分裂原激活蛋白的磷酸化，激活相應(yīng)信號通路，調(diào)控相應(yīng)基因的表達。最初在肺癌和乳腺癌細胞系樣品中發(fā)現(xiàn)TLR9高表達與致癌作用相關(guān)。TLR9受到刺激后，可上調(diào)一些凋亡抑制基因，如Survivin、Bcl-xl等。另外，有研究證明，低氧可以導(dǎo)致實體瘤細胞對化療藥物敏感性降低，這也可能是鉑類耐藥的重要因素[1]。為此，本研究在觀察卵巢癌細胞對順鉑耐藥與TLR9受體的關(guān)系的同時，初步探究了二者在缺氧條件下的關(guān)系，以期為闡明卵巢癌細胞耐藥機制以及尋找新的化療增敏靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

低氧恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Ⅸ2-UCB激光共聚焦顯微鏡與CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

順鉑（批號：MKBV3446V，純度：≥99.9%）和氯喹（批號：085M 4098V，純度：≥98%）均購自美國Sigma公司；TLR9特異性激動劑CpG-ODN 2006（批號：3710-61）及其同型對照CpG-ODN 2006 control（批號：3801-02T）購自美國InvivoGen公司；辣根過氧化物酶（HRP）山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton）（中國碧云天生物技術(shù)有限公司）；猴抗鼠熒光二抗、猴抗兔熒光二抗（美國Thermo公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Bio-Rad公司）；TLR9抗體、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）抗體（美國Abcam公司）；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司，批號：GA611）。

1.3 細胞

人卵巢癌細胞株（SKOV3）購自American Type Culture Collection（ATCC）公司，細胞在37℃、5%CO2條件下的1640細胞培養(yǎng)基（高糖，含10%胎牛血清）中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細胞中TLR9的熒光表達

將SKOV3消化接種到爬片培養(yǎng)24 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛固定，分為破膜組和未破膜組。破膜組細胞先根據(jù)蛋白定位情況加入Triton破膜20min，然后兩組細胞均用PBS洗3次，血清封閉1 h；加入TLR9抗體，4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5min；加入帶有熒光標(biāo)記的二抗暗處孵育1 h，PBS洗3次，每次5m in；加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核15 min，PBS洗3次，封片。激光共聚焦顯微鏡采集圖像，觀察2組SKOV3中TLR9的熒光表達。

2.2 細胞對順鉑耐藥與TLR9的關(guān)系

將SKOV3（5×104m L－1）培養(yǎng)于96孔板，細胞貼壁后，分為A組（CpG-ODN 2006）和B組（CpG-ODN 2006 control），分別加入50μg/m L的CpG-ODN 2006或CpGODN 2006 control，作用6、12、24 h，棄培養(yǎng)基，加入3.5 μg/m L的順鉑培養(yǎng)24 h，再加入用培養(yǎng)基配制的10% CCK-8溶液，孵育3 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處光密度（OD），計算增殖抑制率，增殖抑制率＝（空白孔OD值－給藥孔OD值）/（空白孔OD值－對照孔OD值）× 100%。每個時間點平行3個復(fù)孔。

2.3 細胞對順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

將SKOV3置于缺氧（1%O2）和常氧（21%O2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12、24 h后，收集上清，離心去除細胞殘渣，用新鮮培養(yǎng)基稀釋制成缺氧細胞上清和常氧細胞上清。然后用含80%上述細胞上清的培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV3，每種細胞上清平行6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，按“2.1”項下方法加入順鉑后，測定OD值，計算增殖抑制率。

2.4 TLR9拮抗細胞對順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

分別用0、1、10、102、103μmol/L的氯喹預(yù)處理SKOV3 3 h后，再用“2.3”項下含80%細胞上清（低氧、常氧下培養(yǎng)6、12、24 h）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每種細胞上清平行6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，按“2.1”項下方法加入順鉑后，測定OD值，計算增殖抑制率。用“缺氧時藥物抑制率的降低倍數(shù)（HICR）”表示缺氧誘導(dǎo)的耐藥性，HICR＝（缺氧細胞上清的增殖抑制率－常氧細胞上清的增殖抑制率）/常氧細胞上清的增殖抑制率。

2.5 MRP表達與TLR9的關(guān)系

將SKOV3置于缺氧和常氧的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，制成80%的細胞上清。取SKOV3分為C組（常氧24 h細胞上清）、D組（缺氧24 h細胞上清）和E組（缺氧24 h細胞上清+10μmol/L氯喹），每組6個復(fù)孔，按相應(yīng)條件加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，采用Western blot法檢測TLR9、MRP蛋白表達。先提取細胞的總蛋白，測定蛋白濃度；待聚丙烯酰氨凝膠凝固后，電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉1～2 h，加入對應(yīng)的TLR9抗體（1∶500稀釋）、MRP抗體（1∶500稀釋）、β-actin抗體（內(nèi)參，1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜，曝光；Image Lab軟件分析圖片，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參比值評價目標(biāo)蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細胞TLR9的熒光表達

結(jié)果表明，TLR9在SKOV3的細胞膜和細胞質(zhì)中均有表達。2組SKOV3中TLR9表達的熒光圖見圖1。

3.2 細胞對順鉑耐藥與TLR9的關(guān)系

A組SKOV3在作用6、12、24 h后增殖抑制率分別為（47.97±0.49）%、（50.86±0.46）%、（53.09±0.70）%；B組分別為（51.19±0.90）%、（53.69±0.58）%、（55.13± 0.21）%（n＝6）。與B組比較，A組SKOV3對應(yīng)時間點的增殖抑制率明顯降低（P＜0.01）。

3.3 細胞對順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

圖1 2組SKOV3中TLR9表達的熒光圖Fig 1 Fluorescence diagram of TLR9 expression in SKOV3 of 2 groups

常氧6、12、24 h細胞上清作用后SKOV3增殖抑制率分別為（52.89±5.11）%、（56.17±4.19）%、（53.16± 4.10）%；缺氧6、12、24 h細胞上清作用后SKOV3增殖抑制率分別為（48.77±4.76）%、（48.54±3.28）%、（45.49± 4.84）%（n＝6）。與常氧細胞上清比較，相應(yīng)時間點的缺氧細胞上清作用后SKOV3增殖抑制率明顯降低（P＜0.05）。

3.4 TLR9拮抗細胞對順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

與未加氯喹（0μmol/L）比較，加入10、102μmol/L氯喹能明顯降低HICR（P＜0.01），其中缺氧24 h細胞+10 μmol/L氯喹處理后HICR降低最明顯。不同濃度氯喹預(yù)處理不同時間后SKOV3的HICR測定結(jié)果見表1。

表1 不同濃度氯喹預(yù)處理不同時間后SKOV3的HICR測定結(jié)果（±s，n＝6，%%）Tab 1 Determ ination results of HICR of SKOV3 after pretreated by different concentrations of ch loroquine at different tim e（±s，n＝6，%%）

表1 不同濃度氯喹預(yù)處理不同時間后SKOV3的HICR測定結(jié)果（±s，n＝6，%%）Tab 1 Determ ination results of HICR of SKOV3 after pretreated by different concentrations of ch loroquine at different tim e（±s，n＝6，%%）

注：與未加氯喹（0μmol/L）比較，＊P＜0.01Note：vs.notadded chloroquine（0μmol/L），＊P＜0.01

24 h 5.17±0.42 5.03±0.71 1.86±0.30＊2.04±0.19＊5.94±0.34氯喹濃度，μmol/L 011 0 1021036 h 1.52±0.24 1.01±0.49 0.37±0.62＊1.05±0.73 1.02±0.44 12 h 3.92±0.80 4.68±0.70 1.46±0.44＊2.07±0.44＊4.03±0.77

3.5 MRP表達與TLR9的關(guān)系

與C組比較，D組細胞中MRP表達增強（P＜0.01）；與D組比較，E組細胞中MRP表達減弱（P＜0.01）。3組SKOV3中MRP表達的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見圖3。

4 討論

TLR9受體是一種先天免疫系統(tǒng)的細胞DNA受體，廣泛表達于各種人類癌細胞及癌組織中，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、腎細胞癌、食管癌等[2-5]，其表達會影響腫瘤的免疫表型及化療，并在癌癥的預(yù)后中有重要作用。本研究選用了CpG-ODN 2006[6]和氯喹[7]分別作為TLR9的特異性激動劑和拮抗劑。筆者以SKOV3為研究對象，通過免疫熒光染色直觀觀察發(fā)現(xiàn)TLR9在SKOV3的細胞膜和細胞質(zhì)中均有表達，當(dāng)用CpG-ODN 2006刺激SKOV3后，細胞對順鉑的敏感性降低，不僅說明TLR9表達于SKOV3中，同時提示TLR9激活在腫瘤細胞的化療耐藥方面具有重要的功能。

圖2 3組SKOV3中MRP表達的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of MRP expression in SKOV3 of3 groups

圖3 3組SKOV3中MRP表達的測定結(jié)果Fig 3 Determ ination results of MRP expression in SKOV3 of 3 groups

由于實體瘤細胞的惡性增殖速度大于血管生成速度，造成細胞缺氧，最近的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)的旁分泌因素是癌細胞耐藥的關(guān)鍵因素。在肝癌細胞中，缺氧會誘導(dǎo)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和一些損傷相關(guān)分子（DAMPS）釋放[8]，進而降低細胞對環(huán)孢素和依托泊苷的敏感性[9]。因為DAMPS中的核酸類物質(zhì)可以激活TLR9受體，于是本文設(shè)計了用缺氧不同時間的細胞上清刺激細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SKOV3對順鉑的敏感性降低，即缺氧細胞上清可以提高腫瘤細胞的耐藥性，說明缺氧后細胞會釋放某種物質(zhì)引起細胞耐藥。TLR9特異性拮抗劑氯喹能明顯抑制缺氧細胞上清對順鉑耐藥性的增強作用，提示卵巢癌細胞在受到類似缺氧的刺激下，會導(dǎo)致細胞受損，釋放一些損傷相關(guān)分子，從而活化TLR9受體。

缺氧細胞上清刺激SKOV3后，在提高順鉑耐藥性的同時上調(diào)了MRP蛋白的表達，而加入氯喹則削弱了這一效應(yīng)，提示缺氧細胞上清對耐藥蛋白的上調(diào)效應(yīng)與TLR9有關(guān)。TLR9被活化可激活NF-κB、MAPK等信號通路，調(diào)控MRP蛋白的表達[10-11]。已有研究發(fā)現(xiàn)異長春花堿可通過降低MRP1的表達逆轉(zhuǎn)人鼻咽癌細胞對順鉑的耐藥[12]。所以在卵巢癌細胞對順鉑耐藥過程中，TLR9可能的作用機制是其活化導(dǎo)致了NF-κB、MAPK信號通路的激活，從而上調(diào)了MRP蛋白的表達，促使藥物外排增加，導(dǎo)致化療藥敏感性降低而出現(xiàn)耐藥。本研究從TLR9的角度為闡明卵巢癌的耐藥機制提供了新的依據(jù)，推測TLR9有望成為化療增敏的一個新靶點。

[1] 郭洋，吳密璐，趙君慧，等.肺癌低氧微環(huán)境與化療耐藥相關(guān)性研究進展[J].中國肺癌雜志，2014，17（3）：265-268.

[2] Sandholm J，Selander KS.Toll-like receptor 9 in breast cancer[J].Front Immunol，2014，doi：10.3389/fimmu.2014.00330.

[3] Vaisanen MR，Jukkola-Vuorinen A，Vuopala KS，etal.Expression of toll-like receptor-9 is associated w ith poor progression-free survival in prostate cancer[J].Oncol Lett，2013，5（5）：1659-1663.

[4] Fernandez-Garcia B，Eiro N，Gonzalez-Reyes S，etal.Clinicalsignificance of toll-like receptor 3，4，and 9 in gastric cancer[J].J Immunother，2014，37（2）：77-83.

[5] Zhang Y，Wang Q，Ma A，etal.Functionalexpression of TLR9 in esophageal cancer[J].Oncol Rep，2014，31（5）：2298-2304.

[6]GurselM，Gursel I.Developmentof CpGODN based vaccine adjuvant formulations[J].Methods Mol Biol，2016，doi：10.1007/978-1-4939-3389-1_20.

[7] Tuomela J，Sandholm J，Kauppila JH，et al.Chloroquine has tumor-inhibitory and tumor-promoting effects in triple-negative breast cancer[J].Oncol Lett，2013，6（6）：1665-1672.

[8]Liu Y，YanW，Tohme S，etal.Hypoxia induced HMGB1 and m itochondrial DNA interactions mediate tumor grow th in hepatocellular carcinoma through Toll-like receptor9[J].JHepatol，2015，63（1）：114-121.

[9] Brahim i-Horn MC，Ben-Hail D，Ilie M，etal.Expression of a truncated active form of VDAC1 in lung cancer associates w ith hypoxic cell survival and correlates w ith progression to chemotherapy resistance[J].Cancer Res，2012，72（8）：2140-2150.

[10] Zhu ZA，Zhu ZQ，CaiHX，etal.Reversion ofmultidrug resistance by SKI-Ⅱin SGC7901/DDP cells and exploration of underlying mechanisms[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（2）：625-631.

[11] Kwon YS，Chun SY，Nam KS，etal.Lapatinib sensitizes quiescent MDA-MB-231 breast cancer cells to doxorubicin by inhibiting the expression ofmultidrug resistance-associated protein-1[J].OncolRep，2015，34（2）：884-890.

[12] 韓建庚.異長春花堿對耐順鉑人鼻咽癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機制[J].中國藥房，2014，25（1）：19-21.

Study on the Relationship between Cisp latin-resistance of Human Ovarian Cancer Cell and TLR9 under Hypoxia

LI Ling，LIBin，XING Haiyan，CHEN Jianhong（Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital，Third M ilitary Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To study the relationship between cisplatin-resistant of human ovarian cancer cells（SKOV3）and Toll-like receptor 9（TLR9）under hypoxia.METHODS：Immunofluorescence method was used to detect the TLR9 expression in rupture and intactmembranes SKOV3.SKOV3 was taken，adding cisplatin，then CCK-8 was used to detect cell inhibition rate after 6，12，24 h of added into TLR9 specific agonists CpG-ODN 2006（group A）and its isotype control CpG-ODN 2006 control（group B）.SKOV3 or SKOV3 pretreated by 0（not added），1，10，102，103μmol/L TLR9 specific antagonist chloroquine for 3 h were taken，adding cisplatin，cell inhibition rate was detected after 24 h of added into SKOV3 normoxia（21%O2），hypoxia（1% O2）incubating 6，12，24 h，HICR under hypoxia in pretreatmentwas calculated.Western blotmethod was used to detect themultidrug resistance associated protein（MRP）expression in SKOV3 under the conditions of normoxia 24 h cell supernatant（group C），hypoxia 24 h cell supernatant（group D），hypoxia 24 h cell supernatant+10μmol/L chloroquine（group E）.RESULTS：TLR9 was expressed in both cellmembrane and cytoplasm of SKOV3.Compared w ith group A，cell inhibition rate in group B was decreased（P＜0.01）.Compared w ith normoxia cell supernatant，cell inhibition rate was decreased after hypoxia cell supernatant（P＜0.05）. Compared w ith not added chloroquine，adding 10，102μmol/L chloroquine can obviously decrease HICR（P＜0.01），and themost significant decrease was showed when using hypoxia 24 h cell supernatant+10μmol/L chloroquine.Compared w ith group C，MRP expression in group D was strengthened（P＜0.01）；compared w ith group D，MRP expression in group E was weakened（P＜0.01）.CONCLUSIONS：TLR9 receptors can be activated under hypoxia，and cause SKOV3 to cisplatin-resistance，the effectmay be related w ith up-regulating MRP expression.

Human ovarian cells；Hypoxia；Chemotherapy sensitivity；Toll-like receptor-9；Cisplatin

R361+.3

A

1001-0408（2017）13-1744-04

2017-01-13

2017-03-09）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金面上項目（No.30973493）

＊碩士研究生。研究方向：腫瘤化療耐藥。電話：023-68812151。E-mail：915934926@qq.com

#通信作者：主任藥師，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：腫瘤化療耐藥。電話：023-68812151。E-mail：chenjh-110@263.net

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.05