王富平，龐亞妮，陳忠敏

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054)

研究與技術(shù)

絲素降解生成的低分子多肽對細(xì)胞生長性能的影響

王富平，龐亞妮，陳忠敏

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054)

分析絲素降解生成的低分子多肽(low-molecular-weight silk fibroin peptides，LMW-SF)對細(xì)胞生長的影響。LMW-SF通過中性蛋白酶酶解絲素蛋白(silk fibroin，SF)獲得，分別采用過濾除菌和高壓蒸汽滅菌處理后，在0.1～5.0 mg/mL體積濃度條件下，檢測LMW-SF對人正常肝細(xì)胞(L02)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)的生長影響，計算相對增殖率(relative growth rate，RGR)。結(jié)果顯示：當(dāng)LMW-SF體積濃度較低(0.1 mg/mL和0.5 mg/mL)時，LMW-SF對細(xì)胞生長影響較?。划?dāng)其體積濃度較高(2.5 mg/mL和5.0 mg/mL)時，RGR值最低至8.3%，呈強抑制細(xì)胞生長作用；高壓蒸汽滅菌處理后，RGR最高達(dá)227.4%，呈強促細(xì)胞生長作用。研究結(jié)果表明：高壓蒸汽處理可以使LMW-SF變性失活，并實現(xiàn)強促細(xì)胞生長作用，可成為蛋白類物質(zhì)應(yīng)用于組織工程支架時的必需工藝環(huán)節(jié)。

低分子絲素蛋白多肽；酶解；過濾除菌；高壓蒸汽滅菌；細(xì)胞生長

絲素蛋白(silk fibroin, SF)作為一種從蠶繭中提取的天然纖維蛋白質(zhì)，因其良好的生物相容性、生物降解性被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，如固定化酶材料[1]、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)[2]、藥物緩釋劑[3]、組織工程支架[4]等。絲素蛋白作為組織工程支架時，具有促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的黏附能力[5]。同時，在體內(nèi)生理環(huán)境下發(fā)生降解[6]，其中蛋白酶XIV起著非常關(guān)鍵的作用[7-8]，酶解產(chǎn)物以游離氨基酸和低分子多肽為主，可被細(xì)胞新陳代謝所利用，可促進(jìn)細(xì)胞增殖[9-10]，即經(jīng)過降解的絲素蛋白帶上了猶如生長因子的作用，在組織工程支架領(lǐng)域具備了優(yōu)異的特性。

有文獻(xiàn)對絲素蛋白促細(xì)胞生長機理進(jìn)行了探討，認(rèn)為其需經(jīng)過酶解后再被細(xì)胞利用[11]，因此，如果先將家蠶絲素酶解成低分子多肽(low-molecular-weight silk fibroin peptides，LMW-SF)，就可以提高細(xì)胞的利用效率，能更快速地促進(jìn)細(xì)胞生長。但是，部分研究指出，由于絲素蛋白中含有0.45%左右的半胱氨酸(Cys)[12]，當(dāng)絲素蛋白酶解至低分子多肽時，Cys可能會形成二硫鍵，多肽二級結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變，可能會使其具備活性[13-14]，而這類活性可能會對細(xì)胞生長造成負(fù)面影響。由此，在前期本課題組使用中性蛋白酶酶解獲得LMW-SF的基礎(chǔ)上，本文擬研究絲素蛋白水解為低分子多肽時其體積濃度的變化對細(xì)胞生長的影響。由于高壓蒸汽方法能造成絲素蛋白變性，本文即對比性地采用過濾除菌法和高壓蒸汽法來處理LMW-SF，研究處理后LMW-SF對細(xì)胞生長的影響，為絲素蛋白更廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料提供科學(xué)基礎(chǔ)依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料和試劑

繭殼(重慶市纖維織品檢驗所)，透析袋(USA進(jìn)口分裝，標(biāo)定截留分子量MW為8 000～14 000)，中性蛋白酶(南寧龐博生物有限公司，酶活力20×104U/g)，小鼠成纖維細(xì)胞L929(第三軍醫(yī)大學(xué))，人正常肝細(xì)胞L02、人肝癌細(xì)胞HepG2(上海中喬新舟生物科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、HyClone(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、MTT(北京Solarbio生物科技有限公司)，所用試劑Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、二甲亞砜(DMSO)等均為分析純(市售)。

1.2 制備低分子絲素蛋白多肽

按照文獻(xiàn)[15]的方法，采用鹽溶法經(jīng)透析、濃縮和冷凍干燥得到SF粉末，密封保存?zhèn)溆?，掃描電鏡檢測其線粒大小為20～50 μm。采用中性蛋白酶酶解法得到LMW-SF粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 過濾除菌法對LMW-SF體積濃度的影響

配制體積濃度適中的LMW-SF水溶液，使其峰值吸光度介于0.5～0.7，采用UV-29200型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)測定240～320 nm的吸光度，確定LMW-SF的峰值波長，并將此波長下吸光度數(shù)值在過濾(微孔濾器，220 nm，Millipore，Ireland)前后進(jìn)行對比。

1.4 細(xì)胞生長性能檢測

L02細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，HepG2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。配制體積濃度為5 mg/mL的LMW-SF水溶液，采用過濾除菌法(微孔濾器，220 nm，Millipore，Ireland)和高壓蒸汽法(高壓自動滅菌鍋，YXQ-LS-50G，上海博迅)處理，在處理后用完全培養(yǎng)基分別稀釋成0.1、0.5、2.5、5.0 mg/mL四種體積濃度。用血球計數(shù)板分別將兩種細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為2×105個/mL，以每孔100 μL加入到96孔板(Corning，USA)中，過夜待細(xì)胞貼壁后吸走孔內(nèi)液體，然后每孔加入200 μL制備好的含不同體積濃度的LMW-SF培養(yǎng)基，以只加完全培養(yǎng)基的孔作為空白對照組，每組試驗設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(FORMA3111,美國Thermo公司)中培養(yǎng)。分別于12、24、36、48、60 h后采用MTT法檢測兩種細(xì)胞的活性：每孔加入20 μL MTT，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去96孔板中的液體，每孔加入150 μL DMSO，使用酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國Thermo公司)震蕩10 min，然后檢測其在490 nm處的吸光值繪制細(xì)胞生長曲線，并按照下式計算相對增殖率RGR。

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 過濾除菌對LMW-SF吸光度影響

蛋白質(zhì)在紫外有兩個特征吸收峰，一是由于其含色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其分子內(nèi)部存在著共軛雙鍵，在280 nm處有一吸收峰；二是因肽鍵存在而引起的，在200～220 nm處有一吸收峰，此兩處吸收峰都可用于蛋白質(zhì)的定量測定，但以前者為常用。經(jīng)檢測LMW-SF在275 nm時存在最大吸收峰，220 nm微孔濾器過濾后使得LMW-SF濃度略有減低(圖1)，峰值吸光度從0.644減低至0.623，減低至96.7%，顯示過濾對NSF濃度影響較小。

2.2 過濾除菌處理后LMW-SF對細(xì)胞生長影響

220 nm微孔濾器過濾后，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為保證細(xì)胞生長的安全性，在完全培養(yǎng)基中加入了1%雙抗，LMW-SF對L02、HepG2細(xì)胞生長的影響如圖2所示。當(dāng)LMW-SF體積濃度較低(0.1 mg/mL和0.5 mg/mL)時，LMW-SF對兩種細(xì)胞生長影響較??；當(dāng)LMW-SF體積濃度較高(2.5 mg/mL和5.0 mg/mL)時，LMW-SF對兩種細(xì)胞生長存在抑制作用。以5.0 mg/mL為例，L02、HepG2細(xì)胞生長的RGR值分別為23.83%±0.92%、8.03%±0.91%，呈強抑制細(xì)胞生長作用，同時隨著體積濃度的增加，對細(xì)胞生長抑制作用越強。

LMW-SF是酶解產(chǎn)物，呈水溶性，可溶解分散于細(xì)胞培養(yǎng)基中。由于中性蛋白酶酶切位點無特定性，LMW-SF的產(chǎn)物即屬于復(fù)雜的多肽、游離氨基酸混合物。過濾除菌法是一種物理過濾的方法，不會影響到LMW-SF的結(jié)構(gòu)特性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LMW-SF在高體積濃度條件下對細(xì)胞呈現(xiàn)出強抑制的作用，而游離氨基酸對細(xì)胞應(yīng)是具有營養(yǎng)價值，具有促生長作用的。這說明在LMW-SF的混合物中存在某一種或者某些組分，會隨著體積濃度的提高而抑制細(xì)胞生長，而且該作用具有濃度依賴性，當(dāng)其濃度達(dá)到最低有效作用濃度時，就會對細(xì)胞呈抑制作用。這個結(jié)果顯示，酶解后的絲素蛋白在應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域生物支架制備時，其含量需要深入研究。

2.3 高壓蒸汽處理后LMW-SF對細(xì)胞生長影響

LMW-SF在高壓蒸汽處理后對L02、HepG2細(xì)胞生長的影響如圖3所示。當(dāng)LMW-SF體積濃度較低(0.1 mg/mL和0.5 mg/mL)時，LMW-SF對兩種細(xì)胞的生長存在微弱促進(jìn)作用；LMW-SF體積濃度較高(2.5 mg/mL和5.0 mg/mL)時，LMW-SF對人種細(xì)胞L02、HepG2呈強促細(xì)胞生長作用，RGR分別為227.4%±8.35%、145.2%±4.77%，且細(xì)胞生長呈濃度依賴性。

圖2 過濾除菌后LMW-SF對細(xì)胞生長的影響Fig.2 The effect of LMW-SF on cell growth after filtration sterilization

圖3 高壓蒸汽滅菌后LMW-SF對細(xì)胞生長的影響Fig.3 The effect of LMW-SF on cell growth after high-pressure steam sterilization

2.4 兩種處理方式下的相對增殖率對比

如圖4所示，經(jīng)過過濾除菌后的LMW-SF，在較高體積濃度條件下存在著抑制細(xì)胞生長的活性物質(zhì)組分；當(dāng)其經(jīng)過高壓蒸汽處理后，LMW-SF呈現(xiàn)出強促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，對細(xì)胞生長產(chǎn)生了截然相反的作用效果，且存在細(xì)胞差異。分析認(rèn)為，由于高壓蒸汽處理法中蒸汽潛熱大、穿透力強，容易使蛋白質(zhì)LMW-SF變性或凝固，就可能破壞了LMW-SF混合性組分中具有生物活性效能分子的結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)LMW-SF應(yīng)用于生物材料基材時，需要經(jīng)過高壓蒸汽處理，而高壓蒸汽處理工藝也正是材料滅菌時可以采用的方法。

圖4 兩種滅菌方式下的相對增殖率比較Fig.4 The comparison of RGR under two types of sterilization

3 結(jié) 論

中性蛋白酶酶解絲素蛋白后，形成了游離氨基酸和多肽的混合性物質(zhì)，其中存在著具有抑制細(xì)胞生長的組分，且該組分可通過高壓蒸汽處理法使其變性失活，變抑制為顯著促進(jìn)細(xì)胞生長。因此，在將酶解后的絲素蛋白應(yīng)用于組織工程支架時，高壓蒸汽滅菌法是必需的工藝環(huán)節(jié)。

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Effect of low-molecular-weight silk fibroin peptides on cell growth property

WANG Fuping, PANG Yani, CHEN Zhongmin

(College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

The main purpose of this paper is to analyze the effects of low-molecular-weight silk fibroin peptides (LMW-SF) on cell growth characteristics. Firstly, LMW-SF was achieved from silk fibroin enzymolysis by neutral protease. Secondly, LMW-SF was sterilized by filtration and high-pressure steam, respectively. Finally, the effects of LMW-SF on the growth of human normal liver cell (L02) and human liver cancer cell (HepG2) were tested under the volume concentration of 0.1～5.0 mg/mL, and the relative growth rate (RGR) was calculated. The results show that LMW-SF have slight effect on cell growth at low concentration (0.1 mg/mL and 0.5 mg/mL); when the volume concentration is high (2.5 mg/mL and 5.0 mg/mL), the lowest value of RGR is 8.3%, indicating a strong inhibition effect on cell growth. RGR is up to 227.4% after high-pressure steam sterilization, showing a strong promotion effect on cell growth. It is obvious that LMW-SF have a strong effect on promoting cell growth after high-pressure steam sterilization, and high-pressure steam sterilization could be a necessary process when protein is applied in tissue engineering scaffolds.

low-molecular-weight silk fibroin peptides; enzymolysis; filtration sterilization; high-pressure steam sterilization; cell growth

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.04.001

2016-06-15;

2017-03-13

重慶市科委(csct2014jcyja10018)；重慶市教委(KJ1400916)

王富平(1982-)，男，副教授，博士，主要從事生物醫(yī)用材料的研究。

R318.08

A

1001-7003(2017)04-0001-04 引用頁碼:041101