李 旺，黃 焱，田新華，李良成，穆軍博，童俊江

(1. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廈門，福建 361002；2.福建醫(yī)科大學(xué)，福州，福建 350122；3.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廈門，福建 361004；4.廈門大學(xué)藥學(xué)院，廈門，福建 361102 )

研究報(bào)告

雙熒光標(biāo)記的膠質(zhì)瘤原位移植瘤模型的建立

李 旺1，黃 焱2，田新華3，李良成4，穆軍博1，童俊江2

(1. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廈門，福建 361002；2.福建醫(yī)科大學(xué)，福州，福建 350122；3.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廈門，福建 361004；4.廈門大學(xué)藥學(xué)院，廈門，福建 361102 )

目的 建立一種穩(wěn)定、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的膠質(zhì)瘤原位移植瘤裸鼠模型。方法 用帶有熒光素酶(luciferase-Luc)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein-GFP)基因的慢病毒感染U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，流式細(xì)胞儀篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP-Luc熒光的細(xì)胞系，并通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、Transwell腫瘤遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)等評(píng)價(jià)熒光細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力是否改變；將細(xì)胞接種至裸鼠大腦尾狀核，建立膠質(zhì)瘤原位移植瘤模型，利用小鼠活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腦內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，并通過(guò)石蠟切片，HE染色評(píng)價(jià)細(xì)胞在裸鼠腦內(nèi)的病理特征及成瘤能力。結(jié)果 成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP熒光和luciferase熒光的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及動(dòng)物模型，慢病毒整合并未改變細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力；模型生長(zhǎng)周期適中，成瘤率高，瘤體在顱內(nèi)生長(zhǎng)穩(wěn)定，HE切片符合人膠質(zhì)瘤特征。結(jié)論 雙熒光標(biāo)記的膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比于傳統(tǒng)細(xì)胞更有利于膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究；U251-GFP-Luc膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠模型，其腫瘤生長(zhǎng)和病理特性與人膠質(zhì)瘤相似，且可實(shí)時(shí)觀察腫瘤生長(zhǎng)，可作為膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)研究的理想動(dòng)物模型。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；熒光；活體成像；模型，動(dòng)物；原位移植

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤之一，因其高死亡率受到神經(jīng)外科醫(yī)師的關(guān)注，雖然手術(shù)、放療、化療技術(shù)不斷改進(jìn)，但復(fù)發(fā)率高，預(yù)后仍然很差[1]。究其原因在于未能闡明膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，特別在腫瘤生長(zhǎng)階段難以實(shí)時(shí)觀測(cè)其顱內(nèi)生長(zhǎng)狀況，因此建立一種無(wú)創(chuàng)的、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，是研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和探索治療方法的必要所在[2]。

目前，顱內(nèi)腫瘤的監(jiān)測(cè)一般需CT、MRI、PET等影像學(xué)設(shè)備，操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴，不適合樣本量較大的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，隨著生物示蹤技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，GFP和luciferase基因標(biāo)記的雙熒光系統(tǒng)標(biāo)記的細(xì)胞在腫瘤動(dòng)物模型的研究中顯示出安全性高、操作方便、價(jià)格低廉、可實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)等巨大的優(yōu)勢(shì)已成功應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[3-8]。本研究選取常用的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，并采用GFP-luciferase基因標(biāo)記后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，建立一種無(wú)創(chuàng)的、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

細(xì)胞和小鼠 U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。BALB/c裸小鼠12只，購(gòu)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(滬) 2012-0002】，體重18～20克，鼠齡6～8周，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境【SYXK(閩)2013-0006】,所做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：DMEM培養(yǎng)基和PBS緩沖液購(gòu)于Hyclone公司；胚胎牛血清FBS購(gòu)于Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；Transwell試劑盒購(gòu)自美國(guó)Corning公司；熒光素酶底物購(gòu)自美國(guó)Gold Biotechnology公司。

1.2.2 儀器：倒置熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Carl Zeiss 公司，小鼠腦立體定向儀購(gòu)于安徽正華生物儀器有限公司，Hamilton微量注射器、微量注射泵購(gòu)于保定蘭格公司，IVIS Lumina Ⅱ小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 慢病毒的生產(chǎn)：轉(zhuǎn)染前1 d將293FT細(xì)胞按50%～70%匯合度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前將完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基。將5質(zhì)粒(pHCMV-G, pHCMV-gag-pol, pHCMVRev, pcDNA-Tat以及pHIV1SDmCMVeGFP2Aluc)與polyethylenimine (PEI)試劑按1∶5體積比混勻后加入293FT細(xì)胞中，4 h后棄上清液，并換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(48～72) h后取病毒上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，收慢病毒于-80℃保存。

1.3.2 細(xì)胞感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的篩選： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，待匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，用收集的慢病毒感染細(xì)胞，感染24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的表達(dá)情況，評(píng)估慢病毒感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效率，并用流式細(xì)胞儀篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP-Luc的U251單細(xì)胞克隆，將其命名為U251-GFP-Luc。

1.3.3 U251-GFP-Luc細(xì)胞的體外發(fā)光檢測(cè)：將熒光細(xì)胞倍比稀釋于96孔板中，細(xì)胞數(shù)目依次為：1×106，5×105，2.5×105，1.25×105，6.25×104，3.12×104個(gè)，將未帶熒光標(biāo)記的細(xì)胞以相同的稀釋倍數(shù)作為對(duì)照。加入熒光素酶底物(150 μg/mL)，10～15 min后將該板置于活體發(fā)光成像系統(tǒng)中檢測(cè)各孔的發(fā)光強(qiáng)度, 以每秒光子量(photons/s)表示，并采用一元線性回歸分析法分析發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性。

1.3.4 U251-GFP-Luc細(xì)胞與U251-Control細(xì)胞生物學(xué)特性的比較:

1.3.4.1 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔2000個(gè)細(xì)胞，每孔含100 μL培養(yǎng)基，并于鋪板后的第0 h、24 h、48 h、72 h每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃孵育2～3 h后測(cè)其450 nm處A值并繪制增殖曲線。

1.3.4.2 細(xì)胞周期檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心棄上清液，PBS洗后加入預(yù)冷70%甲醇，4℃固定過(guò)夜。第二日，將細(xì)胞離心棄甲醇后用PBS洗兩次，加入PI工作液(含0.05 mg/mL 碘化丙啶，0.02 mg/mL RNase A)室溫避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Modfit軟件進(jìn)行周期分析。

1.3.4.3 Transwell細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)：Matrigel膠和DMEM按1∶8的比例稀釋后取100 μL鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育過(guò)夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞, 用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升1×105個(gè)，取細(xì)胞200 μL接種于Transwell上室，下室加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液600 μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，固定、染色、干燥后顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)除不用鋪膠外，其余步驟相同。

1.3.5 體內(nèi)膠質(zhì)瘤模型的建立及生物發(fā)光活體成像：稱量裸鼠的體重，建立基礎(chǔ)體重曲線。5%水合氯醛8 μL/g麻醉，將麻醉的裸鼠固定在小鼠腦立體定向儀上，酒精消毒后延矢狀縫剪開頭皮1 cm，在矢狀縫和冠狀縫焦點(diǎn)(前囟)偏右3 mm，靠上1 mm處(定位于尾狀核)鉆骨窗，直徑約0.5 mm，將U251和U251-GFP-Luc細(xì)胞分別用PBS制備細(xì)胞懸液，每只裸鼠1×106個(gè)細(xì)胞通過(guò)微量注射泵緩慢注射入腦內(nèi)(從骨窗處進(jìn)針3.5 mm，退針1 mm，注射20 min，注射完停針5 min后緩慢退出)。用骨蠟封好骨窗，并縫合好頭皮，碘伏消毒。

定期觀察裸鼠的后期反應(yīng)。分別于移植后的第0、7、14、21、28 天，腹腔注射熒光素酶底物10～15 min(底物濃度15 mg/mL，10 μL/g)，在小動(dòng)物活體成像儀上進(jìn)行顯像，并利用活體成像分析軟件分別記錄在接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞后的的熒光圖像及熒光強(qiáng)度值。

1.3.6 腫瘤的生長(zhǎng)以及小鼠生存率的評(píng)估：記錄小鼠的生存狀態(tài)。每天觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，每周稱量1次小鼠體重。

1.3.7 病理切片：瀕死的裸鼠經(jīng)10%的水合氯醛5 μL/g麻醉后，暴露胸腔，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流至軀體發(fā)白，取出腦組織，浸泡在4%多聚甲醛中24 h，梯度脫水后石蠟包埋、切片、HE染色，在鏡下觀察腫瘤情況。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較用t-檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier 曲線法，生存曲線的比較用Log-rank test。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反之為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 帶熒光細(xì)胞的分選

經(jīng)慢病毒感染細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察感染效率均在90%以上，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選且長(zhǎng)期培養(yǎng)后熒光信號(hào)并無(wú)明顯衰減(圖1)。

2.2 病毒感染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測(cè)和評(píng)估

由圖2可見，細(xì)胞在96孔板中經(jīng)倍比稀釋后其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)了良好的相關(guān)性(R2=0.992)(圖2)。

2.3 細(xì)胞生物學(xué)特性

圖3A的增殖曲線表明：細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后其增殖能力無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞周期檢測(cè)：GFP-Luc 組與對(duì)照組均以G0/G1期細(xì)胞為主，各期細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3 B,C)；遷移實(shí)驗(yàn)中，GFP-Luc 組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)分別為353.8±12.07，355.8±10.43，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖3 D,E)；侵襲實(shí)驗(yàn)中，GFP-Luc 組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)分別為344.4±11.59，348.4±13.5，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3 F,G)。

2.4 膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠原位模型的評(píng)價(jià)

2.4.1 Balb/c裸鼠膠質(zhì)瘤原位移植模型的建立：所有裸鼠都成功接種，術(shù)后均恢復(fù)良好。

2.4.2 裸鼠的生存狀況：兩組均在第16～20天開始出現(xiàn)覓食、飲水減少；第27～29天開始出現(xiàn)身體消瘦，皮膚彈性下降，反應(yīng)遲鈍；32～34 d出現(xiàn)明顯顱內(nèi)高壓癥狀，眼球突起，軀體向一側(cè)偏癱，精神極度委靡，軀體枯瘦如柴，呈現(xiàn)瀕死狀態(tài)，中位生存期為32 d，分別繪制其生存曲線，經(jīng)比較兩組生存曲線差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( Log-rank test,P>0.05)(圖4)。

2.5 裸鼠生物發(fā)光活體成像

U251-GFP-Luc組在接種第1周后即可檢測(cè)到腦部熒光信號(hào)，且隨著時(shí)間的推移，所有可檢測(cè)到的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，在第4周時(shí)信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到飽和(圖5)。

2.6 腦組織形態(tài)及病理檢測(cè)

如圖6所示：肉眼觀可見腦組織在右側(cè)尾狀核部位呈現(xiàn)圓形黃綠色區(qū)域，并可見明顯中線左移，HE切片顯示腫瘤區(qū)無(wú)明顯包膜，與正常腦組織界限清楚，核異形性顯著，大小不均一。

3 討論

近年來(lái)，隨著人們對(duì)膠質(zhì)瘤研究的逐步深入，各種治療的新思路、新方法陸續(xù)投入到臨床前及臨床實(shí)踐應(yīng)用中，但效果不太理想，大量在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功而臨床評(píng)價(jià)較差的經(jīng)驗(yàn)說(shuō)明動(dòng)物模型并沒有反應(yīng)出患者腫瘤真實(shí)的生理學(xué)特性，因此建立一種可靠的、穩(wěn)定的膠質(zhì)瘤原位移植模型是科研工作者急需解決的問(wèn)題。

成功建立膠質(zhì)瘤原位移植模型的關(guān)鍵在于能夠?qū)崟r(shí)、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確地觀測(cè)腫瘤在腦內(nèi)的發(fā)生發(fā)展情況，熒光示蹤技術(shù)正是解決這一問(wèn)題的良好途徑。熒光示蹤技術(shù)分為生物發(fā)光和激發(fā)熒光兩種。激發(fā)熒光技術(shù)是指應(yīng)用GFP或者RFP等熒光蛋白標(biāo)記目的細(xì)胞，利用紫外光激發(fā)使細(xì)胞發(fā)散出相應(yīng)波長(zhǎng)的光，再通過(guò)熒光成像裝置進(jìn)行顯像[9-11]。激發(fā)熒光需要激發(fā)光照射，在活體成像上動(dòng)物的皮毛、肌肉、內(nèi)臟等都會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的背景光干擾[12, 13]。但GFP操作簡(jiǎn)單、易觀測(cè)、成像不需要注射底物。生物發(fā)光技術(shù)是將熒光素酶基因(Luc)整合到細(xì)胞DNA中，在觀測(cè)前通過(guò)腹腔或者靜脈注射熒光素底物，經(jīng)過(guò)熒光素酶的催化反應(yīng)再進(jìn)行熒光顯像[14]。生物發(fā)光因其是體內(nèi)的酶促反應(yīng)，不需要外源性的激發(fā)光源，所以排除了背景光的干擾，且光強(qiáng)度與熒光細(xì)胞數(shù)成呈線性相關(guān)，大大提高了影像學(xué)上的精確性[15, 16]。Jessamy等[3]證明GFP和Luc的表達(dá)具有良好的線性關(guān)系(r2=0.9819)，從而可以利用GFP熒光進(jìn)行GFP-Luc穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選，使體外實(shí)驗(yàn)更易進(jìn)行。然而目前國(guó)內(nèi)膠質(zhì)瘤領(lǐng)域應(yīng)用熒光示蹤技術(shù)甚少，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)構(gòu)建的并且應(yīng)用于活體成像的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系大多只是C6-GFP在大鼠上的移植瘤模型，由于GFP有較強(qiáng)的背景干擾，其敏感性和精確度都大大降低，且C6是鼠源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，腫瘤并不能完全模擬人膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特征[17]。U251細(xì)胞系是由Poten及其團(tuán)隊(duì)在從一位75歲惡性膠質(zhì)瘤男性患者腦腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)建立的[18]。在過(guò)去的幾十年中，U251已經(jīng)廣泛應(yīng)用于皮下及原位移植模型中，可以模擬大部分膠質(zhì)瘤患者的生物學(xué)特性[19]。因此本研究選取人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞并用GFP-Luc雙熒光系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了兩種發(fā)光系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。

注：A，熒光鏡下GFP的表達(dá)(標(biāo)尺=50 μm)；B，白光下細(xì)胞形態(tài)(標(biāo)尺=50 μm)； C，疊加光下細(xì)胞形態(tài)(標(biāo)尺=50 μm)圖1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系U251-GFP-Luc表達(dá)GFP情況Note. A. Expression of GFP in the U251 cells observed under a fluorescent microscope. Bar=50 μm. B. Microscopic morphology of cells seen under the white light.(Bar=50 μm. C. The superposition graph of A and B. Bar=50 μm.Fig.1 The expression of GFP in U251-GFP-Luc cells stably expressing fluorescence

圖2 U251-GFP-Luc體外熒光素酶活性與細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性Fig.2 Correlation between the number of U251-GFP-Luc cells and luciferase activity in vitro

注：A. 兩組細(xì)胞增殖曲線的比較，P>0.05；B,C.兩組細(xì)胞周期分布檢測(cè)，各期細(xì)胞數(shù)P>0.05；D,E.兩組細(xì)胞遷移能力比較 (標(biāo)尺=100 μm)，P>0.05；F,G.U251-GFP-Luc 與 U251-control細(xì)胞侵襲能力的比較 (標(biāo)尺=100 μm)，P>0.05。圖3 U251-GFP-Luc 與 U251-Control細(xì)胞生物學(xué)功能的比較ote. A. Comparison of cell proliferation curves between the two groups，P>0.05. B,C. Detection of cell cycle distribution between the two groups，P>0.05. D,E. Transwell migration assay of the two groups. Bar=100 μm, P>0.05. E,G. Transwell invasion assay of the two groups. Bar=100 μm，P>0.05.Fig.3 Comparison of the biological function between U251-GFP-Luc cells and U251-control cells

圖4 U251-GFP-Luc組與U251-Control組裸鼠生存曲線Fig.4 Survival curves of the nude mice in U251-GFP-Luc group and U251-Control group

圖5 U251-GFP-Luc組與U251-Control組裸鼠原位移植模型活體成像Fig.5 The in vivo images of nude mouse models of orthotopic transplantated glioma in the U251-GFP-Luc and U251-control groups

大量的細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，GFP-Luc雙熒光標(biāo)記的膠質(zhì)瘤細(xì)胞同時(shí)還具備以下優(yōu)勢(shì)：(1)有利于體外實(shí)驗(yàn)研究，GFP熒光可以直接在熒光顯微鏡下觀察，更利于鏡下分析，如在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行慢病毒感染效率的考察，陽(yáng)性細(xì)胞的比重以及純化情況。(2)可在早期監(jiān)測(cè)腫瘤模型是否制作成功，在接種后當(dāng)天進(jìn)行Luc生物發(fā)光活體成像檢測(cè)，如果在腦室或者椎管中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，多表明細(xì)胞誤注入腦室中進(jìn)入腦脊液循環(huán)擴(kuò)散到其它位置，該模型是不符合實(shí)驗(yàn)要求的。早期剔除實(shí)驗(yàn)不僅可以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，同時(shí)也避免了不必要的時(shí)間和資金浪費(fèi)。

本實(shí)驗(yàn)中，U251-Luc-GFP裸鼠模型成瘤率高，載瘤裸鼠的生存期穩(wěn)定，活體成像結(jié)果顯示隨時(shí)間推移，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，顯示與腫瘤體積有良好的線性關(guān)系，證明腫瘤在逐漸長(zhǎng)大。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明U251裸鼠模成瘤時(shí)間適中，小鼠生存期穩(wěn)定，重復(fù)性好，是一種理想的膠質(zhì)瘤原位移植瘤模型，并且為將來(lái)膠質(zhì)瘤進(jìn)一步研究提供了良好的可視化工具,同時(shí)也可以為研究膠質(zhì)瘤的起源、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、血管生成以及評(píng)估基因治療療效方面提供了強(qiáng)大的可視化監(jiān)測(cè)工具擁有廣泛的應(yīng)用前景[20-23]。

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Establishment of a nude mouse model of glioma orthotopic xenograft with double-fluorescent labeling

LI Wang1, HUANG Yan2, TIAN Xin-hua3, LI Liang-cheng4,MU Jun-bo1, TONG Jun-jiang2

(1. Medical College of Xiamen University, Xiamen 361002, China; 2. Fujian Medical University, Fuzhou 350122;3. Zhongshan Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004;4. School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen 361002)

Objective To establish a stable and real-time monitorable nude mouse model of orthotopic glioma xenograft. Methods U251 glioma cell line was infected by a lentiviral vector containing green fluorescent protein (GFP) and luciferase (Luc) gene. Cells stably expressing fluorescence of GFP and Luc were sorted by flow cytometry. CCK-8 test and Transwell tumor invasion and migration assay were used to compare the biological features between the cells stably expressing GFP-Luc fluorescence and cells without fluorescence. Then the cells were implanted intracranially in the right caudate nucleus of athymic Balb/c nude mice to establish the tumor model. The growth of intracerebral tumor was monitored over time by a bioluminescence imaging (BLI) system. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to evaluate the histopathological features and tumorigenicity of the transplanted glioma cells in the brain of nude mice. Results U251 glioma cell line with stably expressing GFP-Luc fluorescence and the corresponding orthotopic xenograft model were successfully established. There was no statistically significant difference in the proliferation, invasion and migration abilities between the cells with stably expressing GFP-Luc fluorescence and the control cells. This model showed a high tumor formation rate and stable tumor growth, and takes a moderate time to establish this model. Conclusions Compared with the traditional glioma cells, GFP-Luc-transfected human glioma cells are more feasible for the studies of glioma in vivo. The tumor growth and pathological characteristics in this U251-GFP-Luc glioma model are similar to human glioma, and the growth of this tumor can be real-time monitored. It can be used as an ideal animal model for experimental studies of glioma.

Glioma; Fluorescence; In vivo imaging; Nude mouse models; Orthotopic xenograft

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：30970733)。

李旺(1990-)，男，研究方向：膠質(zhì)瘤。E-mail: whatliwang@qq.com。

田新華(1965-)，男，研究方向:神經(jīng)外科腫瘤。E-mail: txhmd@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0001-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.001

2016-12-14