韋榮飛，郭 靜，李夢媛，朱瑞敏，楊星九，高 苒

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

研究報告

慢病毒介導穩(wěn)定敲低Smurf1細胞株的構建及對細胞遷移的影響

韋榮飛，郭 靜，李夢媛，朱瑞敏，楊星九，高 苒

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

目的 構建慢病毒介導穩(wěn)定敲低Smurf1的HeLa和A549細胞株并檢測敲低Smurf1細胞遷移的影響。方法 將包裝好的Smurf1敲低慢病毒感染HeLa和A549細胞，7 d后進行嘌呤霉素抗性篩選陽性細胞，Western blot和qPCR檢測敲低效果，并進行Transwell檢測Smurf1敲低對細胞遷移的影響。結果 利用干擾慢病毒系統(tǒng)成功構建穩(wěn)定敲低Smurf1的HeLa和A549細胞株，穩(wěn)定敲低Smurf1抑制細胞的遷移速率。結論 敲低Smurf1抑制細胞遷移。

Smurf1；慢病毒；RNA干擾；細胞遷移

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，其參與眾多的生物學過程，在器官的代謝平衡調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用。泛素-蛋白酶體途徑是泛素在泛素激活酶(ubiquitin-activing enzyme，E1)[1]、泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)[2]和泛素連接酶(ubiquitin ligase，E3)[3]的酶促級聯(lián)反應中對蛋白質(zhì)進行標記并使其被蛋白酶體所識別、最終完成降解的過程。泛素-蛋白酶體途徑的異常與多種疾病密切相關，包括惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病及自身免疫性疾病等[4,5]。目前已有超過600個E3被發(fā)現(xiàn)，這些E3主要分為RING(really interesting new gene)鋅指結構域類和HECT(homologous to E6AP C-terminus)結構域類[3,6,7]。Smurf1(SMAD ubiquitylation regulatory factor-1)是HECT類泛素連接酶Nedd4家族的重要成員[8,9]。Smurf1在TGF-beta信號通路的調(diào)控中至關重要，其主要通過靶向泛素化降解TGF-beta信號通路中的多個蛋白來發(fā)揮其生物學功能，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5等[10-12]。前期研究報道揭示，Smurf1在眾多生物學過程中發(fā)揮重要的功能，包括調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)[13,14]、肺動脈高壓[15,16]_ENREF_5、神經(jīng)元軸突生長[17,18]、細胞極性[19,20]及腫瘤的發(fā)展[21]等。近期，Xiaoning Li等揭示Smurf1通過靶向降解DAB2IP蛋白調(diào)控細胞的遷移，DU145和MCF7細胞中敲低Smurf1后，細胞遷移明顯受到抑制[22]。為了深入研究Smurf1在細胞遷移及小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中的重要功能，本研究制備干擾慢病毒介導的Smurf1穩(wěn)定敲低的HeLa和A549細胞株，為進一步研究Smurf1在腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 干擾慢病毒和細胞系:Smurf1干擾慢病毒為本實驗室設計的siRNA序列(表1)提供給上海吉凱基因公司合成包裝；HeLa和A549細胞系為本實驗室所凍存。

表1 Smurf1 siRNA干擾序列

1.1.2 主要試劑:胎牛血清、DMEM、胰酶購自美國Gibco公司；puromycin、結晶紫、RIPA裂解液購自美國Sigma公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白marker及發(fā)光底物購自Thermo公司；Transwell實驗相關試劑購自BD公司；Polybrene購自美國Santa Cruz公司；Smurf1抗體購自Abcam公司；GAPDH抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3 qPCR所用引物序列：qPCR所使用的引物見表2。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染HeLa和A549細胞系：HeLa和A549細胞以每孔8×104的細胞量接種于6孔板中，18 h后，每孔加入6×105的病毒量，且每孔添加終濃度為10 μg/mL的Polybrene，8 h后更換新鮮DMEM (10% FBS，1%雙抗)培養(yǎng)基。感染3～6 d后觀察綠色熒光強度，并添加嘌呤霉素進行陽性細胞篩選2～3 d，隨后富集陽性細胞并擴大培養(yǎng)，通過qPCR和Western blot檢測Smurf1的mRNA和蛋白水平，確定Smurf1干擾慢病毒的敲低效率，得到Smurf1穩(wěn)定敲低細胞株。

1.2.2 qPCR檢測：收集Smurf1穩(wěn)定敲低的HeLa和A549細胞株，利用Trizol法提取RNA，根據(jù)Thermo公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，qPCR檢測Smurf1的mRNA水平，反應條件如下：95℃，1 min；95℃，15 s，60℃，30 s，40個循環(huán)；95℃，15 s，60℃，1 min，95℃，15 s。

1.2.3 Western blot檢測：收獲穩(wěn)定細胞株，RIPA細胞裂解液冰上裂解10 min，加入等體積的2× loading buffer，沸水煮15 min，得到蛋白樣品。將制備好的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳；100 mA恒流，3 h，將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；TBST溶液配制的5%脫脂奶粉室溫封閉45 min；Smurf1抗體(1∶1000稀釋)和GAPDH抗體(1∶5000稀釋)4℃孵育過夜；TBST溶液洗3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h；TBST溶液洗3次，每次10 min；ECL顯色系統(tǒng)顯影檢測目的蛋白。

1.2.4 Transwell檢測細胞轉(zhuǎn)移：在Transwell專用24孔板里(下室)加入500 μL含10%血清的完全培養(yǎng)基(下層培養(yǎng)液)；細胞計數(shù)后，將一定量的細胞用200 μL的無血清培養(yǎng)基(上層培養(yǎng)液)重懸，加入Transwell小室(上室)中；24 h后，吸棄上層培養(yǎng)基，并用棉簽輕輕擦拭除去上層細胞，剪下小室底膜置于載玻片上(底面朝上放置)，PBS洗1次，甲醇國定，0.1%的結晶紫染色，觀察，拍照。

2 結果

2.1 穩(wěn)定干擾細胞株的建立

將攜帶Smurf1特異性干擾序列的慢病毒顆粒和對照病毒顆粒感染HeLa和A549細胞，感染6天后，鏡下觀察幾乎80%的細胞可見綠色熒光，說明慢病毒顆粒已成功感染細胞(圖1)。隨后，利用嘌呤霉素篩選陽性細胞，富集細胞繼續(xù)培養(yǎng)，得到穩(wěn)定干擾細胞株。

注：上圖(上部分)為對照、shSmurf1 1#和2#慢病毒顆粒感染HeLa細胞3天和6天后細胞的綠色熒光強度觀察結果；下圖(下部分)為對照、shSmurf1 1#和2#慢病毒顆粒感染A549細胞3天和6天后細胞的綠色熒光強度觀察結果。圖1 干擾慢病毒顆粒感染HeLa和A549細胞Fig.1 Green fluorescence micrographs of HeLa (A) and A549 cells (B) at 3 and 6 days after lentivirus infection for Smurf1 silencing.

2.2 qPCR鑒定干擾效果

將上述6種感染病毒顆粒的細胞分別提取總RNA后，qPCR檢測Smurf1的mRNA水平。結果如圖2所示，Smurf1的兩條特異性干擾序列均能有效下調(diào)Smurf1的mRNA水平，約下調(diào)90%。

注：上圖分別為對照、shSmurf1 1#和2#穩(wěn)定干擾HeLa (A)和A549 (B)細胞株中，Smurf1 mRNA水平的qPCR檢測結果。圖2 qPCR檢測細胞株中Smurf1的mRNA水平Fig.2 The mRNA level in the HeLa (A) and A549 cells (B) of control and with stably shSmurf1 1# and 2# silencing by lentivirus infection, detected by qPCR.

2.3 Western blot鑒定干擾效果

同樣，收集上述6種感染病毒顆粒的細胞，提取細胞總蛋白，Western blot檢測Smurf1的蛋白水平。結果如圖3所示，Smurf1的兩條特異性干擾序列均能有效下調(diào)Smurf1的蛋白水平。

注：上圖分別為對照、shSmurf1 1#和2#穩(wěn)定干擾HeLa(A)和A549(B)細胞株中，Smurf1蛋白水平的Western blot檢測。圖3 Western blot檢測細胞株中Smurf1的mRNA水平Fig.3 The mRNA level of Smurf1 in the HeLa (A) and A549 cells (B) stably lentivirus-infected for Smurf1 silencing, detected by Western blot.

2.4 干擾慢病毒穩(wěn)定敲低Smurf1抑制細胞的遷移

通過Transwell檢測Smurf1敲低后對細胞遷移的影響。結果如圖4所示，與對照組相比，干擾慢病毒穩(wěn)定敲低HeLa細胞中的Smurf1后，穿過基底膜的細胞明顯減少(圖4A)，統(tǒng)計結果顯示，敲低Smurf1明顯降低細胞的遷移速率(圖4B)。

注：上圖為Transwell檢測對照、shSmurf1 2#穩(wěn)定干擾HeLa細胞遷移，400×顯微鏡拍照(A)和統(tǒng)計學分析結果(B)。圖4 Transwell檢測敲低Smurf1對細胞遷移的影響Fig.4 Knockdown of Smurf1 leads to defective migration, detected by Transwell assay. A. Pictures were taken from a representative field, 400×; B. Cell number counted from five random fields.

2.5 Smurf1已知底物蛋白水平的驗證

通過Western blot，檢測干擾慢病毒穩(wěn)定敲低HeLa細胞中Smurf1已知底物Smad1、Smad5和細胞遷移相關蛋白DAB2IP的蛋白水平。結果如圖5所示，Smurf1敲低后，Smad1/5和DAB2IP的蛋白水平均明顯上調(diào)，該結果與前期相關報道一致，說明通過干擾慢病毒已有效敲低HeLa細胞中的Smurf1。

注：上圖為Western blot檢測對照、shSmurf1 1#穩(wěn)定干擾HeLa細胞中Smurf1已知底物的蛋白水平。圖5 Smurf1已知底物Smad1、Smad5和DAB2IP的蛋白水平檢測Fig.5 Western blot detection of protein levels of the known substrates of Smurf1 in HeLa cells stably transfected with virus for Smurf1 silencing. The protein levels of Smad1, Smad5 and DAB2IP are up-regulated in the HeLa cells transfected with shSmurf1 1# lentivirus.

3 討論

泛素-蛋白酶體途徑參與眾多的生物學過程，其異常導致多種疾病的發(fā)生，包括神經(jīng)退行性疾病、惡性腫瘤及骨質(zhì)疏松等。在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中最重要的酶為泛素連接酶，它決定底物的特異性，也是蛋白質(zhì)降解研究領域的熱點。目前，關于泛素連接酶E3與腫瘤的關系，已有較多研究發(fā)現(xiàn)很多RING類E3為腫瘤抑制因子或致癌因子。Nedd4家族與腫瘤的關聯(lián)研究，相關報道較少，已知報道揭示了該家族中與Smurf1同源性高達80%的成員Smurf2，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切，證明了Smurf2是一個腫瘤抑制因子，并闡釋具體作用機制[23]。關于Nedd4家族成員與腫瘤的關系，研究揭示，40%的前列腺癌和乳腺癌中均能檢測到WWP1 mRNA和蛋白水平的上調(diào)[24,25]；Nedd4在前列腺癌和膀胱癌中高表達；Smurf2在食管癌中高表達，Smurf1在胰腺癌中有mRNA水平的擴增[26]。前期部分研究提示Smurf1能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，然而，其具體的作用機制尚不明確。關于Smurf1在調(diào)控腫瘤細胞遷移過程的生物學功能有待深入研究。

在研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細胞遷移的過程中，基因沉默是常規(guī)的研究手段。目前，關于基因沉默的方法有多種，包括傳統(tǒng)意義上的RNA干擾、帶有短發(fā)夾RNA (short hairpain RNA，shRNA)的質(zhì)?；虿《据d體介導的RNA干擾等方法。慢病毒載體感染能夠同時感染分裂期和非分裂期的細胞，能夠長期表達外源基因，穩(wěn)定性好，且較安全[27]。本研究針對人源Smurf1設計了2條干擾序列，采用的慢病毒載體可以同時表達GFP和Puro抗性，病毒感染HeLa和A549細胞，經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見GFP表達，且經(jīng)嘌呤霉素篩選得到陽性細胞，qPCR和Western blot檢測揭示Smurf1 mRNA和蛋白水平的明顯下調(diào)，說明我們已經(jīng)成功構建干擾慢病毒介導的Smurf1穩(wěn)定敲低的HeLa和A549細胞株。同時，我們揭示了Smurf1的敲低明顯抑制細胞遷移的速率，提示Smurf1在腫瘤細胞遷移過程中的重要功能。通過檢測Smurf1已知底物Smad1/5和細胞遷移相關蛋白DAB2IP的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)shSmurf1 1#穩(wěn)定干擾的HeLa細胞中，Smad1/5和DAB2IP的蛋白水平均明顯上調(diào)，進一步證實我們已成功構建干擾慢病毒介導的Smurf1穩(wěn)定敲低的HeLa細胞株。

目前，關于Smurf1調(diào)控細胞遷移的作用機制有待進一步深入研究，或者其降解底物有待進一步挖掘，建立干擾慢病毒介導的Smurf1穩(wěn)定敲低的HeLa和A549細胞株，能夠為進一步的基礎研究和臨床應用奠定基礎。

[1] Schulman BA, Harper JW. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways [J]. Nature Rev Mol cell Biol, 2009, 10(5): 319-331.

[2] Ye Y, Rape M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work [J]. Nature Rev Mol cell Biol, 2009, 10(11): 755-764.

[3] Deshaies RJ, Joazeiro CA. RING domain E3 ubiquitin ligases [J]. Annu Rev Biochem, 2009, 78: 399-434.

[4] Reinstein E, Ciechanover A. Narrative review: protein degradation and human diseases: the ubiquitin connection [J]. Ann Intern Med, 2006, 145(9): 676-684.

[5] Dahlmann B. Role of proteasomes in disease [J]. BMC Biochem, 2007, 8(Suppl 1): S3.

[6] Hatakeyama S, Nakayama KI. U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 302(4): 635-645.

[7] Rotin D, Kumar S. Physiological functions of the HECT family of ubiquitin ligases [J]. Nature Rev. Mol Cell Biol, 2009, 10(6): 398-409.

[8] Cao Y, Zhang L. A Smurf1 tale: function and regulation of an ubiquitin ligase in multiple cellular networks [J]. Cell Mol Life Sci, 2013, 70(13): 2305-2317.

[9] Cao Y, Zhang L. Pharmaceutical perspectives of HECT-type ubiquitin ligase Smurf1 [J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(18): 3226-3233.

[10] Cao Y, Wang C, Zhang X, et al. Selective small molecule compounds increase BMP-2 responsiveness by inhibiting Smurf1-mediated Smad1/5 degradation [J]. Sci Rep, 2014, 4: 4965.

[11] Sangadala S, Metpally RP, Reddy BV. Molecular interaction between Smurf1 WW2 domain and PPXY motifs of Smad1, Smad5, and Smad6—modeling and analysis [J]. J Biomol Struct Dyn, 2007, 25(1): 11-23.

[12] Alexandrova EM, Thomsen GH. Smurf1 regulates neural patterning and folding in Xenopus embryos by antagonizing the BMP/Smad1 pathway [J]. Dev Biol, 2006, 299(2): 398-410.

[13] Yamashita M, Ying SX, Zhang GM, et al. Ubiquitin ligase Smurf1 controls osteoblast activity and bone homeostasis by targeting MEKK2 for degradation [J]. Cell, 2005, 121(1): 101-113.

[14] Zhang Y, Wang C, Cao Y, et al. Selective compounds enhance osteoblastic activity by targeting HECT domain of ubiquitin ligase Smurf1 [J]. Oncotarget, 2016. DOI: 10.18632/oncotarget.10648. [Epub ahead of print]

[15] Murakami K, Mathew R, Huang J, et al. Smurf1 ubiquitin ligase causes downregulation of BMP receptors and is induced in monocrotaline and hypoxia models of pulmonary arterial hypertension [J]. Exp Biol Med (Maywood), 2010, 235(7): 805-813.

[16] Rothman AM, Arnold ND, Pickworth JA, et al. MicroRNA-140-5p and SMURF1 regulate pulmonary arterial hypertension [J]. J Clin Invest, 2016, 126(7): 2495-2508.

[17] Kannan M, Lee SJ, Schwedhelm-Domeyer N, et al. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth [J]. Development, 2012, 139(19): 3600-3612.

[18] Cheng PL, Lu H, Shelly M, et al. Phosphorylation of E3 ligase Smurf1 switches its substrate preference in support of axon development [J]. Neuron, 2011, 69(2): 231-243.

[19] Ozdamar B, Bose R, Barrios-Rodiles M, et al. Regulation of the polarity protein Par6 by TGFbeta receptors controls epithelial cell plasticity [J]. Science, 2005, 307(5715): 1603-1609.

[20] Lee MG, Jeong SI, Ko KP, et al. RASSF1A directly antagonizes RhoA activity through the assembly of a Smurf1-mediated destruction complex to suppress tumorigenesis [J]. Cancer Res, 2016, 76(7): 1847-1859.

[21] Xie P, Zhang M, He S, et al. The covalent modifier Nedd8 is critical for the activation of Smurf1 ubiquitin ligase in tumorigenesis [J]. Nat Commun, 2014, 5: 3733.

[22] Li X, Dai X, Wan L, et al. Smurf1 regulation of DAB2IP controls cell proliferation and migration [J]. Oncotarget, 2016. 7(18):26057-26069

[23] Blank M, Tang Y, Yamashita M, et al. A tumor suppressor function of Smurf2 associated with controlling chromatin landscape and genome stability through RNF20 [J]. Nature Med, 2012, 18(2): 227-234.

[24] Chen C, Sun X, Guo P, et al. Ubiquitin E3 ligase WWP1 as an oncogenic factor in human prostate cancer [J]. Oncogene, 2007, 26(16): 2386-2394.

[25] Chen C, Zhou Z, Ross JS, et al. The amplified WWP1 gene is a potential molecular target in breast cancer [J]. Int J Cancer, 2007, 121(1): 80-87.

[26] Zhu H, Kavsak P, Abdollah S, et al. A SMAD ubiquitin ligase targets the BMP pathway and affects embryonic pattern formation [J]. Nature, 1999, 400(6745): 687-693.

[27] Whitehead KA, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery [J]. Nat Rev Drug Discov, 2009, 8(2): 129-138.

Establishment of two human tumor cell lines with lentivirus-mediated stably Smurf1 silencing and their effect on cell migration

WEI Rong-fei, GUO Jing, LI Meng-yuan, ZHU Rui-min, YANG Xing-jiu, GAO Ran

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

Objective To establish lentiviral expression vectors for Smurf1 silencing and assess the effects of Smurf1 silencing on cell migration. Methods HeLa and A549 cells were infected with lentiviral expression vectors for Smurf1 silencing respectively. After 7 days, the stable cell lines with Smurf1 silencing were obtained after puromycin-resistance screening, enrichment and expansion. The intracellular gene and protein levels of Smurf1 were detected by qPCR and western blot. Transwell assay was used to assess the effect of Smurf1 silencing on cell migration. Results The stable cell lines with Smurf1 silencing are constructed successfully. Silencing of Smurf1 down-regulated cell migration rate detected by Transwell assay. Conclusion Smurf1 promotes cell migration.

Smurf1; lentivirus; RNA interference; Cell migration

協(xié)和青年基金資助，中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助(3332016077)，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所基本科研業(yè)務費專項資助(2016ZX310033)。

韋榮飛(1990-)，女，助理研究員，研究方向：免疫與腫瘤。E-mail: weirongfei2010@163.com。

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤學、免疫學。E-mail: gaoran26@Hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0046-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.008

2016-11-26