陳 彧，喻 歡，秦 瑤，程樹軍，談偉君

(1. 廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2. 廣東藥科大學(xué),廣東 廣州；3. 廣州市華代生物科技有限公司,廣東 廣州 510623)

技術(shù)方法

基于THP-1細(xì)胞的皮膚致敏體外檢測方法

陳 彧1,2，喻 歡1,3，秦 瑤3，程樹軍1，談偉君2

(1. 廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2. 廣東藥科大學(xué),廣東 廣州；3. 廣州市華代生物科技有限公司,廣東 廣州 510623)

目的 建立基于人細(xì)胞系的替代皮膚致敏動物實驗的體外檢測方法(h-CLAT)，并對化學(xué)品、日用化學(xué)產(chǎn)品和化妝品植物原料進(jìn)行皮膚致敏性檢測。方法 體外培養(yǎng)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)，不同濃度受試物與細(xì)胞共孵育24 h，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和CD54活化的差異，并對11種已知皮膚致敏化學(xué)物質(zhì)和9種未知樣品進(jìn)行皮膚致敏性預(yù)測。同時對未知樣品進(jìn)行豚鼠局部封閉涂皮法驗證。結(jié)果 使用h-CLAT方法準(zhǔn)確區(qū)分了11種參考物質(zhì)的皮膚致敏性，9種受試樣品中，7種樣品被判斷為陰性皮膚致敏物質(zhì)，2種植物提取物被確認(rèn)為皮膚致敏疑似物質(zhì)。9種樣品的預(yù)測結(jié)果與動物實驗一致。結(jié)論 h-CLAT體外檢測方法可以代替部分動物測試，用于可溶性皮膚致敏物質(zhì)的預(yù)測。

皮膚致敏；THP-1細(xì)胞；h-CLAT；替代方法;接觸性過敏性皮類；致敏化學(xué)物；化妝品終產(chǎn)品

接觸性過敏性皮炎是一種由外源物質(zhì)引發(fā)的皮膚IV型過敏反應(yīng)，皮膚致敏試驗是化學(xué)品分類標(biāo)識的要求，也是化妝品、日用化學(xué)品、醫(yī)療器械等皮膚接觸產(chǎn)品毒性評價的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)動物實驗使用豚鼠最大化法或Buehler法測試，優(yōu)化后的小鼠局部淋巴結(jié)實驗(LLNA)以淋巴結(jié)T細(xì)胞增生定量測定代替皮膚臨床癥狀觀察，提高了動物福利標(biāo)準(zhǔn)[1，2]。在化妝品非動物測試法規(guī)的影響和有害結(jié)局通路(AOP)測試概念的指導(dǎo)下，許多體外皮膚致敏篩查實驗逐步得到開發(fā)和被法規(guī)認(rèn)可。近1年來，列入世界經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織( OECD)測試指南TG442的皮膚致敏替代方法包括直接多肽結(jié)合試驗(DPRA)、KeratinosenTM法和人細(xì)胞活化實驗(h-CLAT)[3-5]。本研究通過建立h-CLAT方法，并將其應(yīng)用于市售商品的皮膚致敏性檢測和評價，為下一步建立替代方法的組合策略提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源和培養(yǎng)方法：人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)由安利(上海)研發(fā)中心饋贈(ATCC號：TIB-202)。采用含25 mmol/L HEPES、0.05 mmol/L β-巰基乙醇、10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于5% CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和檢測試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、β-巰基乙醇(Gibco)、鏈霉素、青霉素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、二甲基亞砜(DMSO)和牛血清白蛋白(BSA)均購自Sigma公司；校準(zhǔn)珠、球蛋白阻斷劑、7-氨基放線菌素-D(7AAD)、FITC標(biāo)記的小鼠單克隆CD86抗體、PE標(biāo)記的小鼠單克隆CD54抗體、FITC標(biāo)記的小鼠IgG1、PE標(biāo)記的小鼠IgG1均購自BD公司。

1.1.3 實驗動物及飼養(yǎng):健康豚鼠190只，雌雄各半，清潔級，實驗動物開始時體重(381±24)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(粵)2013-0002。動物實驗在廣東檢驗檢疫技術(shù)中心進(jìn)行，使用許可證為 SYXK(粵)2013-0086。

1.1.4 參考物質(zhì)和測試樣品:十二烷基磺酸鈉(SLS)(CAS:151-21-3)、乳酸(CAS：50-21-5)、肉桂醇(CAS:104-54-1)、丁香酚(CAS:97-53-0)、檸檬醛(CAS:5392-40-5)、肉桂醛(CAS:104-55-2)、苯乙醛(CAS:122-78-1)、沒食子酸丙酯(CAS:121-79-9)、馬來酸酐(CAS:108-31-6)、苯醌(CAS:106-51-4)、二硝基氯苯(CAS:97-00-7)均購自Sigma公司；待測樣品：松茸提取物、微乳卸妝液、當(dāng)歸提取物、黃芩提取物、人參果提取物、積雪草提取物、金縷梅提取物、馬齒筧提取物和綠茶提取物由廣州市華代生物科技有限公司體外實驗室饋贈，根據(jù)受試物的特性選擇生理鹽水或DMSO作為受試物溶劑。

1.1.5 主要儀器:全波長酶標(biāo)儀(Thermo Scientific 公司)、流式細(xì)胞儀(FACS Canto II，美國BD公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)、高速離心機(jī)(Sigma公司)和自動細(xì)胞計數(shù)儀(廣州商特儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和表面標(biāo)志穩(wěn)定性檢測:復(fù)蘇THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度接近1×106個/mL時進(jìn)行傳代，每2～3 d常規(guī)換液傳代1次，建議復(fù)蘇后的THP-1細(xì)胞使用期限為2個月或不超過30代，同時每次實驗以4～4.5 μg/mL DNCB和2 500～3 000 μg/mL乳酸進(jìn)行表面標(biāo)志穩(wěn)定性檢測。

1.2.2 化合物細(xì)胞毒性測定:吸取500 μL濃度為2×106個/mL的細(xì)胞懸液至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔添加500 μL受試物，每組受試物3個平行。每種受試物按照2倍稀釋系數(shù)測試8個濃度，加有不同濃度受試物的培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。暴露結(jié)束后從24孔細(xì)胞培養(yǎng)板收集細(xì)胞分別移入1 mL EP管中，離心(250 r/min，5 min，4℃)收集細(xì)胞，用FACS緩沖液(PBS + 0.1%的BSA)清洗后再次離心收集細(xì)胞。每支EP管中添加100 μL染料(20 μL 7AAD + 80 μL FACS緩沖液)，常溫、暗室下當(dāng)染色10 min。用FACS緩沖液清洗2次和使用500 μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞后移入5 mL流式管中。一次流式進(jìn)樣約需10 000個細(xì)胞，計算IC50(使50%細(xì)胞活性抑制的受試物濃度)和CV75(使75%細(xì)胞存活受試物濃度)。

1.2.3 化合物暴露和細(xì)胞表面標(biāo)志物測定:THP-1細(xì)胞如上述進(jìn)行24孔鋪板，CV75的濃度作為最高試驗濃度，然后以1.2～1.8為系數(shù)稀釋5個濃度。每次實驗需要設(shè)置3組對照，分別為培養(yǎng)基對照、DMSO對照和DNCB陽性對照。添加相應(yīng)濃度的受試物與細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中共同孵育24 h。隨后按照上述步驟離心收集細(xì)胞，將離心獲得的細(xì)胞進(jìn)行蛋白阻斷。將上述細(xì)胞平均分配至4支1 mL的EP管中，每管中大約含有3×105個細(xì)胞。CD86(FITC-CD86抗體)和CD54(PE-CD54抗體)，對應(yīng)的同型對照FITC-IgG1和PE-IgG1，以及活率測試所用的7AAD分別根據(jù)推薦測試濃度進(jìn)行配制，可根據(jù)實驗具體情況對抗體進(jìn)行梯度稀釋，每支EP管添加50 μL含有抗體的FACS緩沖液，2-8℃環(huán)境和暗室條件下染色30 min，隨后使用FACS緩沖液清洗2次，再用500 μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞并移入5 mL流式管，使用流式細(xì)胞儀檢測蛋白標(biāo)志物。

1.2.4 豚鼠局部封閉涂皮法試驗:具體實驗操作參照2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》的皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗。

1.2.5 結(jié)果分析:流式細(xì)胞檢測得到相對熒光強度(relative fluorescence index, RFI)，并計算有效作用濃度(effective concentration, EC)，F(xiàn)ITC-CD86使用EC150(當(dāng)CD86的RFI達(dá)到150時受試物的最低有效濃度)；PE-CD54使用EC200(當(dāng)CD54的RFI達(dá)到200時受試物的最低有效濃度)。

計算EC150和EC200需分兩種情況：

首先，當(dāng)陽性值出現(xiàn)時，從最低濃度開始計算，滿足陽性標(biāo)準(zhǔn)的第一個濃度設(shè)置為A濃度，隨后根據(jù)下述原則選擇下一個濃度為B濃度：第二個濃度的RFI值比第一個濃度的RFI值至少高10%，否則用第三個濃度的RFI值，直到符合大于10%的標(biāo)準(zhǔn)。

(2) 如果測試所得A濃度和B濃度的RFI值均大于150或200，那么公式為：

1.2.6 預(yù)測模型：每組化學(xué)物質(zhì)至少重復(fù)兩次實驗。在細(xì)胞活率大于50%前提下，如果RFICD86≥150和/或RFICD54≥200，則該物質(zhì)可判斷為皮膚致敏陽性物；否則判斷為陰性物質(zhì)。另外，細(xì)胞在受試物各濃度作用下皆無細(xì)胞毒性情況下，都不滿足上述的陽性結(jié)果判斷，則可判斷為皮膚致敏陰性物質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)情況：THP-1細(xì)胞培養(yǎng)如圖1，細(xì)胞密度適中，部分呈現(xiàn)集中生長，形態(tài)一致，無過多碎片或折光差異較大的細(xì)胞集團(tuán)，無特殊突起和觸角，無貼壁舒展情況出現(xiàn)。經(jīng)測試所用細(xì)胞平均倍增時間為37.89±3.93 h，在正常生長THP-1細(xì)胞倍增時間43 h±12 h的范圍內(nèi)。在細(xì)胞特性方面保證了實驗的穩(wěn)定可比性。

(左圖：第5代細(xì)胞，40×；右圖：細(xì)胞倍增曲線)圖1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)控(Left: The fifth generation of cells, 40×; Right: Cell multiplication curves)Fig.1 THP-1 cell culture and quality control

受試物SamplesIC50(μg/mL)CV75(μg/mL)非致敏物(Non-sensitizer)十二烷基磺酸鈉(SLS)80.13±3.4862.32±5.37乳酸(Lactate)3778.35±180.842901±150.17弱致敏物(Weaksensitizer)肉桂醇(Cinnamicalcohol)495.8±12.51358.8±14.61丁香酚(Eugenol)406.2±13.94305.9±14.18中等致敏物(Mildsensitizer)檸檬醛(Citral)44.24±2.8126.2±2.47肉桂醛(Cinnamaldehyde)26.5±4.8320.4±3.84苯乙醛(Phenylacetaldehyde)41.7±4.5120.2±5.18強致敏物(Strongsensitizer)沒食子酸丙酯(Propylgallate)366.8±21.84124.25±10.51馬來酸酐(Maleicanhydride)947.47±38.14651.24±30.81極強致敏物(Extremesensitizer)苯醌(Benzoquinone)8.3±1.59 5.7±1.56二硝基氯苯(DNCB)9.32±0.315.75±0.15樣品(Unknownsamples)微乳卸妝液(mg/mL)(Microemulsionmakeupremover)3.31±0.45 1.3±1.07松茸提取物(mg/mL)(Tricholomamat-sutakeextract)554.2±20.07235.71±14.42當(dāng)歸提取物(vol.%)(Angelicaextract)38.16±7.4730.21±6.41黃芩提取物(vol.%)(ScutellariabaicalensisGeorgiextract)8.43±1.257.05±1.13人參果提取物(vol.%)(Ginsengfruitex-tract)24.31±4.5719.84±5.71積雪草提取物(vol.%)(Centellaasiaticaextract)87.18±15.7364.78±9.44金縷梅提取物(vol.%)(Witchhazelex-tract)250.77±36.81190.44±47.18馬齒筧提取物(vol.%)(Purslaneherbex-tract)97.44±24.7880.87±22.41綠茶提取物(vol.%)(Greenteaextract)127.21±19.44110.34±19.87

2.2 受試物細(xì)胞毒性檢測

11種化學(xué)品和樣品的細(xì)胞毒性結(jié)果見表1。

2.3 CD54和CD86表達(dá)檢測

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征性指標(biāo)結(jié)果：根據(jù)細(xì)胞毒性結(jié)果分別對11種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)暴露THP-1細(xì)胞后的表面標(biāo)志物CD54和CD86的變化進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2。細(xì)胞活率大于50%時，隨著受試物濃度增加，細(xì)胞活率整體呈現(xiàn)遞減趨勢，不同化合物的CD54和CD86兩條RFI曲線呈現(xiàn)不同規(guī)律。兩個致敏陰性物質(zhì)SLS和乳酸的RFI遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于兩條參考值標(biāo)線。兩種被LLNA劃分為弱致敏性的丁香酚和肉桂醇，CD86和CD54兩個值在某個濃度情況下都超過了臨界值，沒食子酸丙酯和馬來酸酐這兩種強致敏物并非兩個指標(biāo)都超過規(guī)定閾值。

2.3.2 陽性參考物質(zhì)的最低有效作用濃度：表2顯示9種皮膚致敏陽性參照物質(zhì)引起THP-1細(xì)胞CD86和CD54表達(dá)時的最低有效作用濃度，表明化合物在該濃度下，可引起THP-1細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的顯著性增加，并超出預(yù)測模型設(shè)定的EC150(CD86)和EC200(CD54)閾值。

2.3.3 未知樣品檢測：幾種水溶性樣品的細(xì)胞活性測試結(jié)果見表1，根據(jù)細(xì)胞毒性結(jié)果分別檢測其暴露細(xì)胞后特征標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3，微乳卸妝液、松茸提、人參果、積雪草、金縷梅、馬齒筧和綠茶等7種提取物對應(yīng)的CD86和CD54的RFI值沒有超過限定閾值。當(dāng)歸提取物引起THP-1細(xì)胞的CD86(EC150=23.54±7.84%)和CD54(EC200=15.37±4.61%)兩個指標(biāo)的RFI都超過了限定閾值，黃芩提取物只引起THP-1細(xì)胞CD54(EC200=2.66±0.74%)的RFI高于閾值。根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)歸和黃芩提取物可能具有皮膚致敏性。在豚鼠局部封閉涂皮法試驗(BT測試)中，采用0.2%(W/V)2,4-二硝基氯苯作為陽性參照物，生理鹽水作為陰性參照物；受試物為9種植物提取物。在致敏后1 h和24 h,各組動物皮膚均未見明顯紅斑和水腫等過敏反應(yīng);激發(fā)給藥后24 h,各組均未出現(xiàn)明顯的皮膚過敏反應(yīng)；激發(fā)給藥后48 h,陽性對照組2只動物(2/10例)出現(xiàn)輕微紅斑,1只動物(1/10例)出現(xiàn)中度紅斑、輕度水腫,3只動物(3/10例)出現(xiàn)輕度紅斑、輕度水腫；當(dāng)歸提取物組1只動物(1/20)出現(xiàn)輕微紅斑,1只動物(1/20)出現(xiàn)中度水腫；黃芩提取物組2只動物(1/20)出現(xiàn)輕微紅斑和輕度水腫；其它受試的植物提取物相應(yīng)組別為陰性。

表2 陽性物質(zhì)引起細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的有效濃度

圖2 11種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測結(jié)果Fig.2 Results of sensitization tested from 11 standard materials

圖3 4種樣品細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)測定結(jié)果Fig.3 Results of sensitization from 4 samples

3 討論

外源化合物引起的皮膚致敏是多細(xì)胞共同參與的復(fù)雜過程，其中朗格漢斯細(xì)胞起著承上啟下的作用。從皮膚原代分離朗格漢斯細(xì)胞或從外周血分離樹突狀細(xì)胞都非常困難，且供體穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。THP-1細(xì)胞是一種來源于急性單核細(xì)胞性白血病患者的細(xì)胞系，具有類似于皮膚樹突狀細(xì)胞的標(biāo)志。研究表明是體外細(xì)胞水平篩查致敏物質(zhì)的理想模型[6-7]。

由于THP-1細(xì)胞容易在培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)化成其他樹突狀細(xì)胞，其穩(wěn)定性對于致敏物篩查非常關(guān)鍵，本研究采用DNCB和乳酸常規(guī)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和CD54，對細(xì)胞定期進(jìn)行質(zhì)控，減少因為細(xì)胞問題影響結(jié)果的穩(wěn)定[8]。

本研究選擇OECD指南442E方法研究中推薦的11種皮膚致敏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立了基于THP-1細(xì)胞的皮膚致敏篩查方法[9]，并將2種非致敏物質(zhì)和9種致敏物質(zhì)正確地區(qū)分開來。h-CLAT方法以CD86和CD54的表達(dá)變化為判定指標(biāo)，研究表明，多數(shù)致敏物質(zhì)可同時引起兩種分子表達(dá)的變化，有一些化合物只引起其中一種標(biāo)志物變化。本研究同樣證實，2種強致敏物馬來酸酐和沒食子酸丙酯，只引起了CD54表達(dá)的增加，而CD86的表達(dá)未達(dá)到陽性閾值。CD86為共刺激分子，CD54為細(xì)胞粘附分子，在誘發(fā)機(jī)制上存在差異，不同類型的致敏化合物可能誘導(dǎo)不同機(jī)制的細(xì)胞分子表達(dá)差異。如果只以CD54的分子表達(dá)差異為判定依據(jù)(如利用U937細(xì)胞建立的U-SENS方法)，則部分致敏物質(zhì)的特征可能會預(yù)測不到。

h-CLAT方法雖然能計算出受試物的最低有效作用濃度EC150(CD86)和EC200(CD54)，但尚不能以此作為評判受試物質(zhì)皮膚致敏潛力的依據(jù)，還需要其它數(shù)據(jù)支持，如正辛醇-水分配系數(shù)、巰基反應(yīng)性、組織代謝過程模擬等。尤其是當(dāng)測試物為混合物時，還應(yīng)包括各個組份的成份、比例和溶劑等信息[10]。

本研究對未知致敏特性樣品的細(xì)胞活化檢測結(jié)果與動物實驗結(jié)果一致，均顯示當(dāng)歸提取物和黃芩提取物被認(rèn)為存在可疑致敏成分。當(dāng)歸提取物主要活性成分為阿魏酸、藁本內(nèi)脂、正丁烯酰內(nèi)脂和煙酸等[11]。黃芩提取物的主要成份為黃芩苷，屬于黃酮類化合物，本身具有抗炎和抗過敏的作用，據(jù)報道黃芩苷可能存在人群皮膚致敏性[12]。h-CLAT經(jīng)過驗證對于已知的單一化學(xué)物質(zhì)的皮膚致敏預(yù)測性達(dá)到80%以上，當(dāng)聯(lián)合多種其他皮膚致敏檢測方法后，相應(yīng)的預(yù)測能力更加穩(wěn)健[13]。同樣地，針對復(fù)雜的化合物和植物提取物，相應(yīng)的體外皮膚致敏檢測方法需要進(jìn)一步探索。本研究中9種植物提取物經(jīng)過h-CLAT的檢測，發(fā)現(xiàn)了兩種受試物的致敏性，在植物提取物成分復(fù)雜和各個組分含量不明確的基礎(chǔ)上，仍然通過該方法檢測出皮膚致敏性，很大程度上可以認(rèn)為該物質(zhì)存在皮膚致敏能力，而相反的，出現(xiàn)陰性結(jié)果的物質(zhì)仍然需要進(jìn)一步驗證皮膚致敏性[14]。

本方法建立的原理是基于AOP皮膚致敏的關(guān)鍵細(xì)胞事件，還有針對該通路其它組件的替代方法，如針對分子啟始事件的直接多肽反應(yīng)試驗(DPRA)、針對角質(zhì)細(xì)胞關(guān)鍵事件的ARE - Nrf2熒光素酶檢測方法(KeratinoSens)同樣已被OECD認(rèn)可為指南方法，其他與AOP相關(guān)的替代方法還有U-SENS、Lusens 等處于驗證過程中。這些方法的開發(fā)在一定程度上替代了動物實驗，但實現(xiàn)最終替代動物實驗的目標(biāo)，還應(yīng)采用整合測試評估策略(IATA)，合并減少體外方法的數(shù)量、確定不同方法的權(quán)重，以及建立判定決策樹。

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An in vitro skin sensitization test based on THP-1 cell line

CHEN Yu1,2，YU Huan1,3，QIN Yao3，CHENG Shu-jun1，TAN Wei-jun

Objective To establish an in vitro skin sensitization test, human cell line activation test ( h-CLAT), based on THP-1 cell line (a human acute monocytic leukemia cell line), and to assess the sensitizing potency of plant raw materials of chemical and cosmetic products by this in vitro skin sensitization test. Method THP-1 cells were cultured in vitro and exposed to 11 reference skin sensitization chemicals and 9 samples, by monitoring the cell viability, cell surface marker CD54 /CD86 and relative fluorescence intensity of cells surface after the cells was exposures to the substances, and to discover whether there is a positive reaction. At the same time, Buehler test was used to validate the results of samples tested by h-CLAT. Results 11 reference chemicals were distinguished correctly by h-CLAT. Among the 9 samples tested, 7 samples were recognized as negative sensitizer and 2 plant extracted substances were identified as suspicious skin sensitizer. The qualitative classification of the 9 samples by h-CLAT test was consistent with the results obtained by animal test. Conclusions The h-CLAT-in vitro test can be used to replace some animal tests for the prediction of soluble skin sensitizing substances.

Skin sensitization; THP-1 cell Line; Human cell line activation test, h-CLAT; Alternative methods; Contact dermatitis; Sensitizing chemicals; Cosmetic products

廣東省科技計劃項目(2015A030402005)。

陳彧(1989-)：男，碩士研究生，研究方向：皮膚致敏替代方法研究與驗證, 郵箱: cy94776@163.com。

程樹軍(1971-)：男，研究員，從事替代方法研發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)化，郵箱：chengsj@126.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0094-09

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.016

2016-07-31