孟 盼，朱 青，張秀麗，向 韻，王宇紅，楊 蕙，雷 昌

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長沙 410208；3.湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410013；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

研究報(bào)告

海馬內(nèi)微量注射K252a對(duì)大鼠行為學(xué)及抑郁樣經(jīng)典指標(biāo)的影響

孟 盼1,2，朱 青3，張秀麗1,2，向 韻1,2，王宇紅1,2，楊 蕙4，雷 昌1,2

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長沙 410208；3.湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410013；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

目的 海馬內(nèi)微量注射K252a，研究其對(duì)大鼠行為學(xué)及抑郁樣經(jīng)典指標(biāo)的影響，擬建立一種新型抑郁癥動(dòng)物模型。方法 SD大鼠隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、假手術(shù)組、慢性應(yīng)激抑郁模型組、海馬內(nèi)微量注射K252a組、海馬內(nèi)微量注射K252a聯(lián)合慢性應(yīng)激組。采用Open field 實(shí)驗(yàn)、糖水消耗實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮測定大鼠行為學(xué)的影響，ELISA法檢測大鼠血清單胺遞質(zhì)含量的變化，放射免疫法觀察大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量的變化，Western blotting觀察大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，CUMS組大鼠的活動(dòng)量、糖水消耗量、學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低(P<0.05或P<0.01)，HPA軸功能亢進(jìn)(P<0.01)，血清單胺遞質(zhì)水平降低(P<0.01)，BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達(dá)下調(diào)(P<0.01或P< 0.05)，而DMSO組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與DMSO比較，K252a組、K252a+CUMS組活動(dòng)量、糖水消耗量、學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降(P<0.01或P< 0.05)，血清單胺遞質(zhì)水平下降(P<0.01或P< 0.05)，HPA軸功能顯著上升(P<0.01或P< 0.05)，海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達(dá)顯著下降(P<0.01或P< 0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠上述指標(biāo)差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠上述指標(biāo)差異無顯著性。結(jié)論 從行為學(xué)、血液學(xué)、分子生物學(xué)的不同角度分析表明，此模型與經(jīng)典的慢性應(yīng)激抑郁模型在表面效度、結(jié)構(gòu)效度、功能效度上具有極大的相似性，可為病因研究和抗抑郁藥物篩選提供一個(gè)可供選擇的研究技術(shù)平臺(tái)。

抑郁癥；模型，動(dòng)物；K252a；神經(jīng)營養(yǎng)障礙

抑郁癥( depression) 是一種嚴(yán)重危害人類身心健康的全球性的疾病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快，抑郁癥的發(fā)病率逐年增長，因此防治抑郁癥的創(chuàng)新藥物研發(fā)已成為醫(yī)藥科學(xué)發(fā)展的重要內(nèi)容。近年來，抑郁癥基礎(chǔ)研究已經(jīng)超出經(jīng)典的“單胺類遞質(zhì)”及“下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)軸”假說，并進(jìn)行受體后機(jī)制及神經(jīng)營養(yǎng)障礙機(jī)制研究[1]。這些研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白或靶基因?qū)τ谘芯恳钟舭Y的發(fā)病機(jī)制及抗抑郁藥物的研發(fā)具有重要的價(jià)值[2]，其中最重要的就是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，BDNF通過酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase，TrkB)信號(hào)影響抑郁癥的病理生理結(jié)構(gòu)和神經(jīng)可塑性的改變已得到廣泛公認(rèn)[3]。

動(dòng)物模型模擬人類疾病狀態(tài)的程度以及評(píng)價(jià)方法的可靠性和準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的價(jià)值[4]?，F(xiàn)有的抑郁癥動(dòng)物模型創(chuàng)新性地融合了比較行為學(xué)及其經(jīng)典的發(fā)病機(jī)制，然而目前尚未見基于“神經(jīng)營養(yǎng)障礙”假說的抑郁癥相關(guān)動(dòng)物模型，為該假說的深入研究及挖掘帶來了障礙。基于此，本實(shí)驗(yàn)采用海馬微量注射BDNF受體阻斷劑K252a，研究其對(duì)大鼠行為學(xué)及抑郁樣經(jīng)典指標(biāo)的影響，并與經(jīng)典的慢性溫和不可預(yù)測性應(yīng)激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)抑郁模型進(jìn)行比較，旨在得到一種新型的抑郁癥動(dòng)物模型。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，240～280g, 50只，由湖南斯萊科景達(dá)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2012-0004，動(dòng)物合格證號(hào)：HNASLKJ20140814。在光/暗周期為12h/12h(光照時(shí)間7:00～19:00)的條件下飼養(yǎng)于籠中，自由獲得飼料和飲水(使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2013-0005)。

1.2 試劑

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP response element binding protein，CREB)一抗購自于(英國Abcam公司)；胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、抑凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)一抗購自于(美國Proteintech公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋公司)；Protein marker(美國MBI Fermentas公司)；NC膜(美國Millipore公司)；羊抗兔IgG-HRP二抗(北京中杉金橋公司)；皮質(zhì)醇(cortisol，CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)放射免疫試劑盒(南京建成有限公司)；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物有限公司)。

1.3 儀器

超純水儀(德國密理博公司)；三用電熱恒溫箱(余姚市東方電工儀器廠)；開野視頻跟蹤系統(tǒng)、Morris 水迷宮(西班牙Panlab公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；ELX800SNT型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)；H6-1微型電泳槽(上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；小型濕轉(zhuǎn)儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組

所有大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，期間進(jìn)行1%蔗糖水訓(xùn)練，測定6 pm～9 am內(nèi)大鼠1%蔗糖水?dāng)z入量。選取糖水?dāng)z入量相近的50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即空白對(duì)照組(control)；慢性應(yīng)激抑郁模型組(CUMS)；假手術(shù)組即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)；海馬內(nèi)微量注射K252a; 海馬內(nèi)微量注射K252a聯(lián)合慢性應(yīng)激(K252a+CUMS)。

2.2 各組處理方式及給藥[5]

空白對(duì)照組每籠5只飼養(yǎng)，不給予任何刺激；CUMS組大鼠單籠孤養(yǎng)，每天隨機(jī)給予不同刺激復(fù)制抑郁模型大鼠，包括：停食(24 h)、停水(24 h)、傾籠45℃、夾尾(1 min)、4℃冰浴(15 min)、晝夜顛倒(24 h)、噪聲(5 min)，每天隨機(jī)安排1種，平均每種刺激使用3次，共計(jì)21 d。其它各組大鼠以Bregma點(diǎn)為中心，鎖定大鼠海馬的位置(AP-3.8mm, ML+/-2.5mm， DV-2.5mm)，埋入套管，用套管帽擰住，以備微量注射時(shí)注射器能夠插入，各組術(shù)后給予青霉素腹腔注射3 d，留待處理后的大鼠備用。埋入套管的動(dòng)物分別在實(shí)驗(yàn)的第1、7、14、21天海馬內(nèi)微量注射相應(yīng)藥物，與此同時(shí)CUMS也在實(shí)驗(yàn)的第1天開始。DMSO組大鼠海馬內(nèi)微量注射1 μL DMSO；K252a組大鼠海馬內(nèi)微量注射1 μL的K252a(10 μg/μL)，K252a由DMSO溶液進(jìn)行配置；K252a+CUMS組在大鼠海馬內(nèi)微量注射1 μL K252a(10 μg/μL)的同時(shí)聯(lián)合慢性應(yīng)激。

2.3 行為學(xué)檢測

2.3.1 Open field 實(shí)驗(yàn)：立方形敞箱，高40 cm，長寬80 cm，周壁、底面為黑色，用白線劃分，以大鼠在3 min 內(nèi)穿越底面塊數(shù)(四爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù))為水平(locomotor activity)得分，以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)(rearing)得分(動(dòng)物雙足離開底面至動(dòng)物雙足放下為一次活動(dòng))。測定動(dòng)物活動(dòng)量的變化。

2.3.2 糖水消耗實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物單籠孤養(yǎng)，一個(gè)瓶裝1%蔗糖水，一個(gè)瓶裝純凈水，禁水12 h后，測定6 pm～9 am內(nèi)大鼠1%蔗糖水?dāng)z入量。測定動(dòng)物糖水消耗量的變化。

2.3.3 Morris 水迷宮測試：

(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練試驗(yàn)：分別在試驗(yàn)的17～21 d進(jìn)行8次航行實(shí)驗(yàn)的練習(xí)，即從4個(gè)不同的象限將大鼠面向池壁放入水中，如果60 s內(nèi)大鼠未爬上平臺(tái)，則將其牽引至平臺(tái)處停留20 s，在試驗(yàn)的第22天進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：每天上、下午各做1次，于平臺(tái)正對(duì)的第二象限處，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的持續(xù)時(shí)間(escape latency)。

(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)：撤除平臺(tái)由同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄其穿越目標(biāo)象限的次數(shù)(crossing target)，目標(biāo)象限潛伏時(shí)間(Lat.T), 在目標(biāo)區(qū)域移動(dòng)的百分比D (%)。

2.4 HPA軸內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)測定

大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，動(dòng)物禁食24 h，10% 水合氯醛4 mL/kg腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，于肝素鈉管中收集，2 500 r/min離心15 min，取血漿入1.5 mL離心管中，-80℃冰箱保存。嚴(yán)格按照放免試劑盒說明書測定血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)含量。

2.5 血清單胺遞質(zhì)含量測定

大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，動(dòng)物禁食24 h，10% 水合氯醛4 mL/kg腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，于促凝管中收集，3 000 r/min離心10 min，取血清入1.5 mL離心管中，-80℃冰箱保存，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行NE、5-HT、DA的檢測。

2.6 腦標(biāo)本的采集

大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，然后取腦，剝離海馬組織于液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 Western-blotting 檢測相關(guān)蛋白

取海馬組織，按每mg組織5μL比例加入RIPA裂解液，冰上勻漿，4℃、12 000 r/min離心15 min后取上清液制備組織蛋白提取液，BCA法測定其蛋白含量，保存待用。按照Western-blotting實(shí)驗(yàn)方法分別檢測各組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達(dá)量，其中以β-actin為內(nèi)參。應(yīng)用ImageJ圖像處理軟件對(duì)條帶進(jìn)行掃描，測量灰度值，計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.8 數(shù)據(jù)分析

與空白組比較*P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對(duì)照組)；CUMS model(慢性應(yīng)激抑郁模型組)；DMSO(假手術(shù)組即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內(nèi)微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內(nèi)微量注射K252 a聯(lián)合慢性應(yīng)激)圖1 各組大鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)的變化±s，n=10)*P<0.05,vs. thecontrol group, **P<0.01,vs. thecontrol group; #P<0.05,vs. the DMSO group; ##P<0.01,vs. the DMSO group;▲P<0.05,vs. CUMS group,▲▲P<0.01,vs. theCUMS group; ■P<0.05, vs. thek252agroup;■■P<0.01, vs. the k252agroup.Fig.1 Changes of locomotor activity and rearing of the rats in each group

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測結(jié)果

3.1.1 Open field 測試結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，DMSO組大鼠的水平活動(dòng)量、垂直活動(dòng)量在第7、14、21天差異無顯著性，CUMS組大鼠的水平活動(dòng)量、垂直活動(dòng)量在第7天時(shí)開始下降(P<0.05)；與DMSO組比較，K252a、K252a+CUMS組大鼠的水平活動(dòng)量、垂直活動(dòng)量均在第7、14、21天下降(P<0.05或P<0.01)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的水平活動(dòng)量、垂直活動(dòng)量輕度下降，但差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠第21天的水平活動(dòng)量、垂直活動(dòng)量輕度下降，但差異無顯著性。結(jié)果見圖1，水平活動(dòng)量為A，垂直活動(dòng)量見B。

3.1.2 糖水消耗測試結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，DMSO組大鼠的糖水消耗量在第7、14、21天差異無顯著性，CUMS組大鼠的糖水消耗量在第14天時(shí)開始下降(P<0.05)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的糖水消耗量均在第14、21天下降(P<0.05或P<0.01)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的糖水消耗量輕度下降，但差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠的糖水消耗量輕度下降，而差異無顯著性。結(jié)果見圖2。

與空白組比較* P<0.05, ** P<0.01；與DMSO組比較，# P<0.05, ## P<0.01；與CUMS組比較，▲P﹤0.05, ▲▲P﹤0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對(duì)照組)；CUMS model(慢性應(yīng)激抑郁模型組)；DMSO(假手術(shù)組即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內(nèi)微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內(nèi)微量注射K252 a聯(lián)合慢性應(yīng)激)圖2 各組大鼠糖水消耗量的變化(*P<0.05,vs control group, **P<0.01,vs. the control group; #P<0.05,vs. the DMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group; ■P<0.05, vs. the k252a group;■■P<0.01, vs. the k252a group.)Fig.2 Changes of 1% sucrose intake of the rats in each group

與空白組比較, *P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對(duì)照組)；CUMS model(慢性應(yīng)激抑郁模型組)；DMSO(假手術(shù)組即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內(nèi)微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內(nèi)微量注射K252 a聯(lián)合慢性應(yīng)激)圖3 Morris 水迷宮測試各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs. the DMSO group,##P<0.01,vs.the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.3 The Morris water maze test of rats in each group

3.1.3 Morris 水迷宮測試結(jié)果：在第21天時(shí)，與空白對(duì)照組比較，DMSO組大鼠的escape latency、crossing target、Lat.T、D%差異無顯著性，CUMS組大鼠的escape latency、Lat.T 顯著上升(P<0.01)，crossing target、D%下降(P<0.05)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的escape latency、Lat.T 顯著上升(P<0.01)，crossing target、D%下降(P<0.01)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠escape latency下降而差異無顯著性，crossing target、Lat.T、D%差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠的escape latency、crossing target、Lat.T、D%差異無顯著性。結(jié)果見圖3。

與空白組比較, *P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對(duì)照組)；CUMS model(慢性應(yīng)激抑郁模型組)；DMSO(假手術(shù)組即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內(nèi)微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內(nèi)微量注射K252 a聯(lián)合慢性應(yīng)激)圖4 各組大鼠血清NE、5-HT、DA含量變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs the DMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.4 Changes of NE, 5-HT, DA levels in the serum of rats in each group

與空白組比較*P<0.05,**P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對(duì)照組)；CUMS model(慢性應(yīng)激抑郁模型組)；DMSO(假手術(shù)組即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內(nèi)微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內(nèi)微量注射K252 a聯(lián)合慢性應(yīng)激)圖5 各組大鼠血漿CORT、ACTH、CRH含量變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs. the DMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.5 Changes of CORT, ACTH, and CRH levels in the plasma of rats in each group

3.2 血清單胺遞質(zhì)含量的檢測結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，DMSO組大鼠血清NE、5-HT、DA水平差異無顯著性，CUMS組大鼠血清NE、5-HT、DA水平顯著降低(P<0.01)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的血清NE、5-HT、DA水平顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠血清NE、5-HT、DA水平差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠血清NE、5-HT、DA水平差異無顯著性。結(jié)果見圖4。

3.3 血漿HPA軸相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，DMSO組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平差異無顯著性，CUMS組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平顯著上升(P<0.01)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠的血漿ACTH、CRH、CORT水平顯著上升(P<0.01或P<0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠血漿ACTH、CRH、CORT水平差異無顯著性。結(jié)果見圖5。

3.4 Western-blotting檢測海馬相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，DMSO組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、Bcl-2的表達(dá)差異無顯著性，CUMS大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與DMSO組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與CUMS組比較，K252a組、K252a+CUMS組大鼠海馬BDNF、BCL-2的表達(dá)降低而差異無顯著性，CREB、ERK1/2的表達(dá)差異無顯著性；與K252a組比較，K252a+CUMS組大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達(dá)差異無顯著性。結(jié)果見圖6、7。

注：Con(空白對(duì)照組)；CU(慢性應(yīng)激抑郁模型組)；D(假手術(shù)組，即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜)；K(海馬內(nèi)微量注射K252a組); K +CU(海馬內(nèi)微量注射K252a聯(lián)合慢性應(yīng)激組)圖6 Western-blotting檢測海馬BDNF、CREB、BCL-2、ERK1/2的條帶圖Fig.6 Detection of hippocampal BDNF, CREB, BCL-2, and ERK1/2 of the western blot strip chart

4 討論

抑郁癥是情感性精神障礙的主要類型，是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合征，是發(fā)病率最高的精神疾病。據(jù)WHO公布的調(diào)查預(yù)計(jì)，到2020年抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾患，僅次于缺血性心臟病，將占全部疾病總負(fù)擔(dān)的6.4%[6],其對(duì)我國的國民健康及社會(huì)的危害正日益凸顯。

抑郁癥的機(jī)制研究和抗抑郁藥的新藥開發(fā)都離不開有效的抑郁癥動(dòng)物模型的建立，目前常用的動(dòng)物模型主要包括物理方法、化學(xué)方法、生物方法3大類，如，行為絕望模型、糖皮質(zhì)激素模型、單胺遞質(zhì)耗竭模型等；其中，CUMS模型可較好地模擬抑郁病癥，并用來探究各種病理、病因、分子機(jī)制等，是目前抑郁癥研究中應(yīng)用較普遍的一種模型[7]。但是上述模型的復(fù)制大部分是基于抑郁癥表觀行為學(xué)的改變或“單胺類遞質(zhì)”及“HPA軸”假說，隨著基礎(chǔ)研究的深入，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制已拓展至“神經(jīng)營養(yǎng)”假說，且其或?qū)⒊蔀閲鴥?nèi)外研究的熱點(diǎn)，因此開發(fā)一種基于該假說的新模型并在此基礎(chǔ)上開展研究具有重要的價(jià)值。

與空白組比較*P<0.05, **P<0.01；與DMSO組比較，#P<0.05, ##P<0.01；與CUMS組比較，▲P<0.05, ▲▲P<0.01；與k252a組比較，■P<0.05, ■■P<0.01注：Control(空白對(duì)照組)；CUMS model(慢性應(yīng)激抑郁模型組)；DMSO(假手術(shù)組即海馬內(nèi)微量注射二甲基亞砜)；K252a(海馬內(nèi)微量注射K252a)；K252a+CUMS(海馬內(nèi)微量注射K252 a聯(lián)合慢性應(yīng)激)圖7 各組大鼠海馬相關(guān)蛋白表達(dá)的含量變化(*P<0.05,vs. the control group,**P<0.01,vs. the control group;#P<0.05,vs. rheDMSO group,##P<0.01,vs. the DMSO group; ▲P<0.05,vs. the CUMS group,▲▲P<0.01,vs. the CUMS group;■P<0.05,vs. the k252a group;■■P<0.01,vs. the k252a group.)Fig.7 Protein levels in the rat hippocampus of each group.

行為學(xué)評(píng)價(jià)可以重現(xiàn)抑郁患者行為學(xué)的特征，在某種程度上可以很好的評(píng)價(jià)模型的表征改變?？旄腥笔且钟舭Y的核心癥狀，主要是以糖水偏好的程度作為參考指標(biāo)[8]。自主、探究活動(dòng)下降及緊張度增高是抑郁癥的重要表征，水迷宮法是一種關(guān)于場景和事件的學(xué)習(xí)記憶模式，亦是一種空間辨別性學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典檢測方法[9]。本文結(jié)果表明，海馬內(nèi)微量注射K252a可模擬抑郁狀態(tài)下的行為學(xué)改變，表現(xiàn)在活動(dòng)量、糖水消耗量、學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，故從表面效度而言與臨床抑郁癥患者表征的變化具有一致性。

“單胺遞質(zhì)假說”和“神經(jīng)內(nèi)分泌即說”是抑郁癥發(fā)病機(jī)制研究的核心假說?；颊唧w內(nèi)突觸間隙5-HT、DA、NE含量的降低可以導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生，而抑郁癥患者機(jī)體必然存在5-HT、DA、NE含量的耗竭[10]。抑郁癥患者血漿皮質(zhì)醇分泌過多，且分泌的晝夜節(jié)律亦有變化，即抑郁癥患者存在HPA軸功能障礙[11]。本文結(jié)果表明，海馬內(nèi)微量注射K252a可導(dǎo)致大鼠血清5-HT、DA、NE含量下降，血漿CRH、ACTH、CORT含量升高，即HPA軸功能高亢。故從結(jié)構(gòu)效度上而言與抑郁癥患者情緒障礙的生理學(xué)基礎(chǔ)，即神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的變化相同。

抑郁癥“神經(jīng)營養(yǎng)”假說認(rèn)為BDNF含量的降低會(huì)使神經(jīng)元營養(yǎng)障礙，導(dǎo)致海馬損傷，進(jìn)而誘發(fā)抑郁癥。BDNF是該假說的核心，而BDNF主要是通過Trk B調(diào)節(jié)其下游胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)變化。神經(jīng)元BDNF/TrkB信號(hào)的變化可導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[12]。BDNF通過激活TrkB和絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)影響細(xì)胞功能，其中ERK1/2是MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)中重要的蛋白，海馬內(nèi)ERK1/2水平的降低參與抑郁癥的發(fā)生[13]。BDNF/TrkB信號(hào)上游可受CREB的影響，下游可以調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元凋亡[14]。CREB 可調(diào)節(jié)腦內(nèi)多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與神經(jīng)元的興奮、發(fā)育、凋亡以及突觸可塑性等多個(gè)神經(jīng)過程[15]。Bcl-2是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵蛋白，其在海馬細(xì)胞凋亡損傷過程中起著重要作用[16]。本文結(jié)果表明，海馬內(nèi)微量注射K252a可以導(dǎo)致模型大鼠海馬BDNF、CREB、ERK1/2、BCL-2的表達(dá)降低，提示該模型海馬神經(jīng)元損傷，故從功能效度而言與抑郁癥“神經(jīng)營養(yǎng)障礙”的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及神經(jīng)元損傷相符。

綜上，海馬內(nèi)微量注射K252a可在行為、血液、分子生物學(xué)指標(biāo)等方面模擬CUMS大鼠的變化，并可分別從表面效度、結(jié)構(gòu)效度、功能效度等不同方面映證模型的可靠性，該模型的建立可為抑郁癥的基礎(chǔ)研究及抗抑郁藥物的篩選和研制提供一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)。

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(致謝：感謝中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室老師的協(xié)助及其在技術(shù)方面的支撐，并感謝實(shí)驗(yàn)室在儀器方面的幫助。在此一并致謝！)

Changes of behavior and depression-like classic indicators after hippocampal microinjection of K252a

MENG Pan1,2, ZHU Qing3, ZHANG Xiu-li1,2, XIANG Yun1,2, WANG Yu-hong1,2, Yang Hui4, LEI Chang1,2

(1. Hunan University of Traditional Chinese medicine, Changsha, 410208,China; 2.Training Base,Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry, Changsha, 410208; 3. Hunan Provincial Tumor Hospital, Changsha 410013;4.First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007)

Objective To study the changes of behavior and depression-like classic indicators after hippocampal microinjection of K252a, and to establish a new animal model of depression. Methods SD rats were randomly divided into five groups, namely the control group, sham group, chronic stress depression model group, hippocampal of K252a microinjection group, and hippocampal microinjection K252a plus chronic stress group. Open field experiments, sucrose consumption test, and Morris water maze behavioral assay were used to assess the behavioral changes in the rats. ELISA was used to detect the plasma monoamine neurotransmitter, radioimmunoassay was used to determine the plasma CRH, ACTH, CORT contents, and western-blotting was performed to observe the protein expression of BDNF, CREB, ERK1/2, and BCL-2 in the hippocampus. Results Compared with the control group, the amount of activity, sugar consumption, learning and memory abilities were decreased(P<0.05 orP<0.01), also the serum monoamine neurotransmitters were decreased (P<0.01), HPA axis function was improved (P<0.01), and the expression of BDNF, CREB, ERK1/2, BCL-2 decreased in the CUMS group(P<0.05 orP<0.01), but there was no significant difference in the DMSO group.Compared with the DMSO group, the activity, consumption of sucrose, learning and memory ability were significantly decreased(P<0.05 orP<0.01),while the HPA axis function was increased (P<0.05 orP<0.01),the serum monoamine neurotransmitters decreased(P<0.05 orP<0.01), and the BDNF, CREB, ERK1/2, BCL-2 expressions in the hypocampus were significantly decreased(P<0.05 orP<0.01) in the K252a group and K252a + CUMS group. Compared with the CUMS group,the K252a group and K252a + CUMS group did not show significant changes in these parameters. Compared with the K252a group, these indicators were not significantly changed in the K252a + CUMS group. Conclusions The results of behavior, hematology, and molecular biology analysis show that this model has a great similarity to the classical model of CUMS in surface validity, construct validity, and functional validity. It may provide an alternative investigative technology platform for basic research and antidepressant drug screening.

Depression; Models, animal; K252a;Neurotrophic disorders

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81403387);湖南省教育廳一般項(xiàng)目(14C0862;15C1038);湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2015DK3003);中醫(yī)內(nèi)科學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(ZYNK201503)。

孟盼(1987-)，女，博士，主要從事神經(jīng)精神疾病的機(jī)制研究及中醫(yī)藥防治。E-mail:mengpan0822@163.com。

王宇紅(1965-)，女，研究員，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥神經(jīng)藥理。E-mail: wyh107@126.com。

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】1671-7856(2017) 04-0026-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.005

2016-11-23