周 康， 殷 音， 彭 毅， 楊 徐

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，石河子，新疆 832000)

研究報(bào)告

二脒那秦在肺動(dòng)脈高壓模型大鼠中的預(yù)防和治療作用

周 康， 殷 音， 彭 毅， 楊 徐

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，石河子，新疆 832000)

目的 探究二脒那秦(DIZE)對(duì)肺動(dòng)脈高壓(PAH)模型大鼠的預(yù)防及治療作用。方法 采用左肺葉切除聯(lián)合野百合堿(MCT)腹壁皮下注射建立PAH大鼠模型，100只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組(A組)、DIZE對(duì)照組(B組)、PAH模型組(C組)、DIZE處理PAH模型組(D組)和(DIZE+C-16)處理PAH模型組(E組)，利用活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)、血清IL-6及IL-8水平，并測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI)，計(jì)算中膜厚度與肺動(dòng)脈外徑的比例(WT)、內(nèi)膜增生評(píng)分，并通過(guò)彈力纖維染色分析肺血管病變。結(jié)果 RVHI、ACE2酶活性、WT及內(nèi)膜增生評(píng)分比較：與A組比較，C組、D組和E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組和E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。五個(gè)組在各個(gè)指標(biāo)整體分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 二脒那秦可以提高ACE2酶活性，并有效降低mPAP、RVHI和WT，同時(shí)減輕肺動(dòng)脈中膜肥厚，并抑制肺小動(dòng)脈內(nèi)膜增生。該研究結(jié)論為二脒那秦治療人類PAH提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

二脒那秦；野百合堿；肺動(dòng)脈高壓；大鼠

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一組由異源性疾病和不同發(fā)病機(jī)制引起的以肺血管阻力持續(xù)增高為特征的臨床病理生理綜合征。其主要特征為肺動(dòng)脈阻塞引起肺血管阻力及肺動(dòng)脈壓力漸進(jìn)性升高，伴隨不可逆的肺血管重構(gòu)，最終導(dǎo)致右心衰竭而死亡[1]。目前雖發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑、前列腺素類、內(nèi)皮素受體拮抗劑、特定種類干細(xì)胞等具有舒張血管功能藥物及細(xì)胞，可以緩解或治療高血壓病[2-5]，但對(duì)高發(fā)病率、高死亡率的PAH卻效果較差，急需尋找一種新的藥物來(lái)提高療效。二脒那秦是以對(duì)硝基苯甲酸、對(duì)甲苯磺酰胺為原料經(jīng)復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)合成的化學(xué)試劑，曾一直用來(lái)治療大型家畜的焦蟲(chóng)和錐蟲(chóng)??；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)通過(guò)形成舒血管物質(zhì)可以對(duì)血壓、心臟、腎臟、呼吸及其他系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)解，是心血管功能重要的調(diào)節(jié)器[6]。有研究指出兩者之間存在關(guān)系，即二脒那秦作為ACE2的激活劑，在改善高血壓方面具有重要的作用[7]。為探討二脒那秦對(duì)ACE2的作用及對(duì)高血壓預(yù)防及治療效果，本研究利用二脒那秦在肺動(dòng)脈模型大鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

動(dòng)物：健康成年雄性Wistar 大鼠100只，體質(zhì)量(190～210)g，平均(198.6±2.6)g，由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(新)2011-0001；動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK(新)2011-0003；新疆省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)文號(hào)：20141022-015。

試劑：MCT由Sigma公司生產(chǎn)；二脒那秦購(gòu)自濟(jì)南偉都化工有限公司；Trizol試劑由Vitrogen Life公司生產(chǎn)；ACE2抑制劑(C-16)購(gòu)自Cayman Chemical；Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH和賴諾普利由美國(guó)RD System公司生產(chǎn)；IL-6和IL-8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；其余試劑為分析純。

1.2 顯微鏡和攝像系統(tǒng)及圖片分析測(cè)量軟件信息

光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)來(lái)自日本Nikon公司，型號(hào)HB-10101AF；Medlab-E生物信號(hào)系統(tǒng)設(shè)備來(lái)自南京美易科技有限公司；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)自成都泰盟科技有限公司，型號(hào)BL-420E；Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)來(lái)自美國(guó)Media Cybemeties公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立

分組：將100只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，每組20只：空白對(duì)照組(A組)、DIZE對(duì)照組(B組)、PAH模型組(C組)、DIZE處理PAH模型組(D組)和(DIZE+C-16)處理PAH模型組(E組)。除A組B組外，均按下法建立PAH模型。

各組實(shí)驗(yàn)：正常對(duì)照組對(duì)Wistar大鼠腹壁皮下注射等量生理鹽水，并給予生理鹽水灌胃5 mL/d；DIZE對(duì)照組對(duì)Wistar 大鼠腹壁皮下注射等量生理鹽水，并給予二脒那秦灌胃0.25 mg/kg·d；PAH模型組對(duì)PAH大鼠給予生理鹽水灌胃5 mL/d；DIZE處理PAH模型組對(duì)PAH大鼠予以二脒那秦灌胃0.5 mg/kg·d；(DIZE+C-16)處理PAH模型組對(duì)PAH大鼠予以二脒那秦灌胃0.5 mg/kg·d，C-16溶于生理鹽水，濃度為20 μg/mL，加入容積為200 μL的微滲透泵，植入背部皮下，以0.25 mL/h(100 μg/d)的速度持續(xù)皮下注射。所有各組均連續(xù)28 d到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和右心肥厚指數(shù)測(cè)定

參照劉杰等[9]方法，將10 cm 長(zhǎng)硬膜外導(dǎo)管末端1～1.5 cm 加熱拉伸，并使其彎曲成魚(yú)鉤狀，用注射器注水成功表示肺動(dòng)脈導(dǎo)管通暢。到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后將大鼠取出，12%烏拉坦(劑量為 8 mL/kg)對(duì)大鼠行腹腔注射，麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，術(shù)中持續(xù)面罩給氧。分離大鼠右側(cè)頸外靜脈，將充滿肝素鹽水的右心導(dǎo)管后插入，一端連接換能器另一端與監(jiān)護(hù)儀相連，當(dāng)置入導(dǎo)管進(jìn)入右心室穩(wěn)定后記錄其右室收縮壓 (RVSP)，監(jiān)護(hù)儀出現(xiàn)肺動(dòng)脈波形時(shí)，待其穩(wěn)定后記錄平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)。高鉀注射處死大鼠，剪開(kāi)胸腔取出心肺，用20 mL注射器收集大鼠全血并分離右室(RV)和左室加室間隔(LV+S)鹽水洗凈，濾紙抽干后稱重，將(RV)/(LV+S)作為右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。

1.5 血清IL-6、IL-8水平檢測(cè)

將到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死后收集到的大鼠全血4℃下靜置60 min，收集血清。按照ELISA法參照試劑盒說(shuō)明利用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中IL-6、IL-8水平。

1.6 肺組織ACE2酶活性檢測(cè)

參照譚宇等[10]采用活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法檢測(cè)ACE2酶活性。利用ACE2可以水解熒光肽底物Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH產(chǎn)生兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)，在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移(即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移)的原理，將到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死后收集到的大鼠肺組織勻漿，按照1∶10比例稀釋，50 μg/L濃度加入賴諾普利阻斷ACE2的作用，45 μL勻漿液與10 μmol熒光底物充分混合后，采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(美國(guó)TriSep-2100型)，以310 nm(激發(fā)波長(zhǎng))和420 nm(發(fā)射波長(zhǎng))進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 肺組織病理學(xué)觀察

收集獲得的肺組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片Verhoeff-鐵蘇木素染色，參照吳思婧等[11]人的操作步驟，利用Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)觀察肺動(dòng)脈的病變情況。沒(méi)有內(nèi)膜增生記0分、內(nèi)膜增生<50%記1分，>50%記2分；100～200 μm肺動(dòng)脈以中膜肥厚為主要的病理改變，計(jì)算中膜厚度與肺動(dòng)脈外徑的比例 (wall thickness, WT%)。分析比較增生程度的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 二脒那秦對(duì)肺組織ACE2酶活性的影響

肺組織ACE2酶活性比較結(jié)果：經(jīng)單因素方差分析，5個(gè)組整體分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來(lái)看：與A組比，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組、E組顯著降低(P<0.05)，D組顯著升高(P<0.05)；與D組、E組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

2.2 二脒那秦對(duì)mPAP和RVHI的影響

血液動(dòng)力學(xué)和RVHI比較結(jié)果：方差分析顯示，5個(gè)組整體分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合數(shù)據(jù)來(lái)看：與A組比，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組、D組和E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與D組比，E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

2.3 二脒那秦對(duì)中膜肥厚和內(nèi)膜增生的影響

5個(gè)組整體分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較：與A組WT及內(nèi)膜增生評(píng)分比，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組、D組和E組增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與D組比，E組評(píng)分明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

顯微鏡下染色切片結(jié)果顯示C組、E組大鼠肺小動(dòng)脈外側(cè)彈力纖維間距明顯增寬，管壁厚度增加，表現(xiàn)為中膜肥厚；C組、E組大鼠肺小動(dòng)脈內(nèi)彈力纖維被破壞，內(nèi)層管壁厚度增加，內(nèi)膜增生分?jǐn)?shù)值增加；D組內(nèi)膜增生分?jǐn)?shù)值較C組、E組下降，見(jiàn)圖1。

2.4 二脒那秦對(duì)血清中IL-6、IL-8水平的影響

血清中IL-6、IL-8水平比較結(jié)果：5個(gè)組整體分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來(lái)看：與A組比較，B組、D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與D組比，E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表4。

表1 二脒那秦對(duì)肺組織ACE2酶活性的影響

注：RFU表示相對(duì)熒光單位。與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. RFU represents the relative fluorescence units. Compared with group A,*P<0.05; compared with group D,#P<0.05

表2 二脒那秦對(duì)mPAP和RVHI的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. Compared with group A,*P<0.05; compared with group D,#P<0.05.

表3 二脒那秦對(duì)WT及內(nèi)膜增生評(píng)分的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. Compared with the group A,*P<0.05; compared with the group D,#P<0.05.

表4 二脒那秦對(duì)血清中IL-6、IL-8水平的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. Compared with the group A,*P<0.05; compared with the group D,#P<0.05.

注：PAH大鼠100～200 μm直徑肺動(dòng)脈主要表現(xiàn)為中膜肥厚，50～100 μm直徑肺動(dòng)脈主要表現(xiàn)為內(nèi)膜增生；C組表現(xiàn)為中膜肥厚和內(nèi)膜增生；D組二脒那秦灌注后中膜肥厚和內(nèi)膜增生明顯減輕；E組C-16注射后，表現(xiàn)和C組類似。圖1 不同組別大鼠動(dòng)脈中膜肥厚及內(nèi)膜增生情況(標(biāo)尺=100 μm)Note. The pulmonary arteries in diameter of 100-200 μm showed mainly media hypertrophy. The pulmonary arteries in diameter of 50-100 μm showed mainly intimal hyperplasia in the PAH rats. The group C showed media thickening and intimal hyperplasia, and the medial thickening and intimal hyperplasia were significantly alleviated in the group D after perfusion of diminazene. After injected with C-16, the performance of group E was similar to that of group C.Fig.1 The thickening of arterial media and intima hyperplasia of rats in different groups (Bar=100 μm).

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是由心、肺或肺血管本身疾病等多種原因引起的一種病理生理狀態(tài)，臨床表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓異常升高。最新血流動(dòng)力學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在海平面、靜息狀態(tài)下，右心導(dǎo)管測(cè)量平均動(dòng)脈壓≥25 mmHg[12,13]。野百合堿誘導(dǎo)大鼠PAH制備PAH動(dòng)物模型已成為研究的常用方法。其主要原理可能是MCT自身并無(wú)生物活性，經(jīng)吸收入血后，在肝臟代謝成為含五元雜環(huán)的吡咯野百合堿具有生物活性，吡咯野百合堿隨血流經(jīng)過(guò)肺時(shí)損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管屏障功能受損。血液中彈性蛋白酶、凝血酶等蛋自酶外滲，觸發(fā)單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在受累動(dòng)脈周圍浸潤(rùn)，繼發(fā)平滑肌細(xì)胞增生等肺血管重構(gòu)件改變[14]。

本研究為探討二脒那秦對(duì)PAH的作用機(jī)制，利用MCT制備大鼠PAH模型，選擇0.25 mg/kg·d的二脒那秦用量，探討對(duì)PAH大鼠模型的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，C組、D組和E組在肺組織ACE2酶活性方面有不同，D組加入二脒那秦與C組比較ACE2酶活性提高，而加入C-16(一種ACE2抑制劑)后ACE2酶活性降低，表明二脒那秦在一定程度上可提高ACE2的活性。此外，與D組比較，E組在肺組織ACE2酶活性、血液動(dòng)力學(xué)、RVHI、WT、內(nèi)膜增生評(píng)分方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05)，表明ACE2表達(dá)量的增加可以降低mPAP、RVHI和WT，同時(shí)減輕肺動(dòng)脈中膜肥厚，并抑制肺小動(dòng)脈內(nèi)膜增生。ACE2是一種鋅依賴性金屬蛋白酶。它可降解 Ang II羧基端的苯丙氨酸，生成 Ang-(1-7)，同時(shí)也可降解 Ang I 的羧基末端，轉(zhuǎn)化成 Ang-(1-9)。Ang-(1-7)、Ang-(1-9)參與血管張力的調(diào)節(jié)，還通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，降低肺動(dòng)脈壓力。ACE2是心血管方面重要的調(diào)節(jié)器，在人體心臟、腎臟、肺臟、睪丸、胃腸、血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜、胰腺和卵巢等處均有表達(dá)[15]。有研究結(jié)果表明PAH模型中ACE2 酶活性水平的降低與肺血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生和遷移增加有關(guān)[16]。當(dāng)肺過(guò)度表達(dá)ACE2或使用ACE2激活劑激活A(yù)CE2過(guò)表達(dá)時(shí)，不僅能抑制血管壁增厚，還能減弱血管肌化程度，從而改善PAH中的肺血管重構(gòu)。龔晶婧等[17]將重組ACE2的慢病毒與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ACE2能通過(guò)下調(diào)AT1受體的表達(dá)，通過(guò)抑制STAT3磷酸化從而抑制平滑肌細(xì)胞增生。以上研究均表明ACE2在調(diào)節(jié)PAH方面的重要作用。

本研究結(jié)果顯示:與A組血清中IL-6、IL-8水平比較，B組、D組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組、E組差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與D組血清中IL-6、IL-8水平比較，E組差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究結(jié)果表明使用二脒那秦后，PAH大鼠模型IL-6、IL-8炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量下降。多數(shù)研究結(jié)果證實(shí)PAH的發(fā)生涉及細(xì)胞、體液介質(zhì)和分子遺傳等多個(gè)方面[18]。PAH觸發(fā)單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在受累動(dòng)脈周圍浸潤(rùn)，繼發(fā)平滑肌細(xì)胞增生等肺血管重構(gòu)件改變。而缺氧、自身免疫性抗體、病原微生物等多種因素可以導(dǎo)致促炎癥因子表達(dá)升高，激活炎癥細(xì)胞和下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路啟動(dòng)增殖過(guò)程和炎性病變。研究發(fā)現(xiàn)PAH患者叢樣肺血管病灶中有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥在PAH發(fā)病中起重要作用[19]，但PAH中IL-8標(biāo)志物水平變化未見(jiàn)報(bào)道。大鼠炎性細(xì)胞因子的分泌降低，炎癥細(xì)胞和下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路啟動(dòng)增殖過(guò)程和炎性病變受到抑制，對(duì)治療PAH大鼠肺血管方面意義重大。本研究結(jié)論與相關(guān)報(bào)道結(jié)論類似，表明IL-6、IL-8炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平的下降與PAH治療有重要關(guān)系[20]。

綜上所述，使用二脒那秦可以提高ACE2酶活性，并有效降低mPAP、RVHI和WT，同時(shí)減輕肺動(dòng)脈中膜肥厚，并抑制肺小動(dòng)脈內(nèi)膜增生。本研究為化學(xué)藥物治療人類PAH提供了一種思路。

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Preventive and therapeutic effect of diminazene in the rat model of pulmonary arterial hypertension

ZHOU Kang, YIN Yin, PENG Yi, YANG Xu

(Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi, Xinjiang 832000, China)

Objective To explore the preventive and therapeutic effects of diminazene (DIZE) on pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats. Methods Left pulmonary lobectomy combined with injection of monocrotaline was used to establish a rat model of pulmonary arterial hypertension. One hundred adult male Wistar rats were randomly divided into blank control group (group A, n=20), DIZE control group (group B, n=20), PAH model group (group C, n=20), PAH model plus DIZE group (group D, n=20) and PAH model plus DIZE and C-16 group (group E, n=20). Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), IL-6 and IL-8 levels were determined by fluorescence resonance energy transfer (FRET) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the mean pulmonary arterial pressure (mPAP) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) were measured. The wall thickness (WT) and intimal hyperplasia score were calculated, and the pulmonary vascular lesions were analyzed using elastic fiber staining. Results RVHI, ACE2 enzyme activity and WT in the group A were significantly different from those of the groups C, D and E (P<0.05). Those of the group D and E were significantly different (P<0.05). The five groups showed significant differences in the overall analysis of each index (P<0.05). Conclusions Diminazene can increase the ACE2 enzyme activity, and decrease the mPAP, RVHI and WT, while reducing the pulmonary arterial medial hypertrophy, and inhibit intimal hyperplasia of pulmonary arterioles. The results of this study provide an experimental basis for the use of diminazene in the treatment of human pulmonary hypertension.

Diminazene; Monocrotaline; Pulmonary hypertension; Rat

周康(1969-)，男，副主任醫(yī)師、副教授，從事心血管內(nèi)科方面的研究。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0034-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.006

2016-11-14