李輝然

(山東醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,山東 臨沂 276000)

研究報告

尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的保護作用

李輝然

(山東醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,山東 臨沂 276000)

目的 探討尼莫地平對過氧化氫(H2O2)誘導的PC12細胞凋亡的保護作用。方法 PC12細胞隨機分為正常組，模型組(200 μmol/L H2O2)，尼莫地平低、中、高濃度組(1、10、100 μmol/L尼莫地平+200 μmol/L H2O2)。MTT法檢測各組細胞活力，Hoechst染色各組細胞凋亡情況，比色法檢測天冬氨酸蛋白水解酶(caspase 3)，caspase 9及超氧化物歧化酶(SOD)活性與丙二醛(MDA)含量，western blot分析B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)及p53蛋白。結(jié)果 與正常組比較，模型組中細胞活力下降，細胞凋亡率提高，caspase 3及caspase 9提高，SOD活性降低，MDA含量降低，Bcl-2表達量下降，Bax及p53表達量上升，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平低、中、高濃度組細胞活力提高，細胞凋亡率降低，caspase 3及caspase 9活性降低，SOD活性提高，MDA含量提高，Bcl-2蛋白表達量提高，Bax及p53表達量降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論 尼莫地平可通過調(diào)控細胞凋亡相關蛋白表達，從而抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡。

尼莫地平；PC12細胞；過氧化氫；凋亡

帕金森氏病、阿爾茲海默癥、亨廷癥等神經(jīng)退行性疾病常發(fā)于老年人，并伴隨著全球老齡化進程，發(fā)病率呈逐年上升，給患者及社會帶來沉重負擔[1]。研究顯示氧化應激與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生及發(fā)展密切相關，在發(fā)病過程中氧自由基大量生成，使細胞膜發(fā)生過氧化損傷，DNA斷裂，最終導致細胞凋亡[2-5]。因此抑制氧化應激所導致的神經(jīng)細胞凋亡對于神經(jīng)退行性疾病的治療具有重要意義。鈣通道阻滯劑，又稱之為鈣拮抗劑，主要是通過阻斷Ca2+內(nèi)流，降低細胞內(nèi)Ca2+濃度而廣泛應用于心腦血管疾病及呼吸系統(tǒng)疾病的治療[6]。尼莫地平是第二代的二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，脂溶性高，易于通過血腦屏障進入腦組織，保護腦細胞，因此被廣泛的應用于腦出血，蛛網(wǎng)膜下腔出血等腦血管疾病的治療當中[7]。但是尼莫地平對于退行性疾病的研究報道較少，目前已知尼莫地平對于低氧誘導的PC12細胞毒性，氧糖剝奪及谷氨酸誘導的PC12細胞凋亡具有顯著的抑制作用[8, 9]，提示尼莫地平對于神經(jīng)細胞損傷具有一定保護作用。因此本研究將在此基礎上進一步探討尼莫地平對于過氧化氫(H2O2)誘導的PC12細胞凋亡的保護作用及具體機制。

1 材料

1.1 細胞

大鼠PC12細胞購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 儀器

Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀購自瑞士Tecan集團公司；迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；AF6000熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 藥品及試劑

尼莫地平片，批號120859，購于山東健康藥業(yè)有限公司。BCA法蛋白定量試劑盒，Hoechst染色試劑盒，caspase 3及caspase 9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)，BCA檢測試劑盒，SOD活性檢測試劑盒，MDA含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；兔抗Bax，Bcl-2，p53，GAPDH單克隆抗體購自美國Epitmics公司；達爾伯克(氏)必需基本培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。

2 方法

2.1 實驗分組[9-11]

將處于生長對數(shù)期的PC12細胞為5組，正常組，模型組，尼莫地平低、中、高濃度組；其中正常組加不含任何藥物的DMEM培養(yǎng)基，模型組加含200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基，尼莫地平低、中、高濃度組分別加入含1、10、100 μmol/L 尼莫地平及200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基。

2.2 細胞活力檢測

將處于生長對數(shù)期的PC12細胞接種于96孔板，培養(yǎng)48 h。按“2.1”分組及給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入終濃度為5 mg/mL 的MTT 20 μL，4 h后，每孔加入二甲亞砜150 μL，10 min后，酶標儀570 nm處測定A值。

2.3 Hoechst染色檢測細胞凋亡

將處于生長對數(shù)期的PC12細胞消化接種于6孔板，培養(yǎng)48 h。按“2.1”分組及給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，后按照Hoechst染色試劑盒說明書進行操作，染色，固定，顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)并拍照，并通過Image J軟件對熒光強度進行統(tǒng)計。

2.4 比色法檢測細胞中Caspase 3及Caspase 9的活性

將處于生長對數(shù)期的PC12細胞接種于6孔板，培養(yǎng)48 h。按“2.1”分組及給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，后按照caspase 3及caspase 9試劑盒說明書檢測其活性，酶標儀405 nm處測定A值。

2.5 比色法檢測細胞上清液中SOD活性及MDA含量

將處于生長對數(shù)期的PC12細胞接種于6孔板，培養(yǎng)48 h。按“2.1”分組及給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，并分別嚴格按照試劑盒說明書檢測SOD活性及MDA含量。

2.6 western blot檢測細胞中Bax，Bcl-2及p53蛋白表達

將處于生長對數(shù)期的PC12細胞接種于6孔板，培養(yǎng)48 h。按“2.1”分組及給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，加入細胞裂解液，裂解30 min，離心，收獲蛋白。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品煮沸變性10 min，上樣，進行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜30～40 min。一抗(兔抗Bax，Bcl-2，p53單克隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋濃度皆為1∶100)孵育，4℃過夜；二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)，稀釋濃度為1:200)室溫孵育1-2 h。滴加化學發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity One”軟件統(tǒng)計各抗體條帶灰度值。

2.7 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞活力的影響

A：正常組；B：模型組；C：尼莫地平低濃度組；D：尼莫地平中濃度組；E：尼莫地平高濃度組注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖2 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的影響Note. A: Normal group; B: Model group; C: Low-dose nimodipine group; D: Moderate-dose nimodipine group; E: High-dose nimodipine group.**P<0.01, Compared with the normal group. ##P<0.01, compared with the model group.Fig.2 Effect of nimodipine on the cell apoptosis induced by H2O2

如圖1所示，與正常組(0.69±0.06)%比較，模型組(0.34±0.03)%細胞活力顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平低、中、高濃度組[(0.42±0.04)%，(0.53±0.05)%，(0.66±0.06)%]細胞活力顯著上升(P<0.01)。

A：正常組；B：模型組；C：尼莫地平低濃度組；D：尼莫地平中濃度組；E：尼莫地平高濃度組與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖1 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞活力的影響Note. A: Normal group; B: Model group; C: Low-dose nimodipine group;D: Moderate-dose nimodipine group; E: High-dose nimodipine group.**P<0.01, compared with the normal group.##P<0.01, compared with the model group.Fig.1 Effect of nimodipine on cell viability induced by H2O2

3.2 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的影響

Hoechst染色結(jié)果所示，與正常組(3.50±0.30)%比較，模型組(38.49±4.59)%細胞凋亡率顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平低、中、高濃度組[(30.05±3.12)%，(18.43±1.76)%，(7.84±0.76)%]細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見圖2。

3.3 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞中caspase 3及caspase 9活性的影響

與正常組比較，模型組caspase 3及caspase 9活性顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平低、中、高濃度組caspase 3及caspase 9活性顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞中caspase 3及caspase 9活性的影響

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

Note. Compared with the normal group,**P<0.01; Compared with the model group,##P<0.01.

表2 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞上清液中SOD活性及MDA含量的影響

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

Note.**P<0.01, compared with the normal group;##P<0.01, compared with the model group.

3.4 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞上清液中SOD活性及MDA含量的影響

與正常組比較，模型組SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平低、中、高濃度組SOD活性顯著提高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

3.5 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞中Bax及Bcl-2蛋白表達量的影響

與正常組比較，模型組中Bcl-2表達量降低(P<0.01)，Bax表達量提高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平低、中、高濃度組中Bcl-2表達量提高(P<0.01)，Bax表達量降低(P<0.01)。見圖3。

A：正常組；B：模型組；C：尼莫地平低濃度組；D：尼莫地平中濃度組；E：尼莫地平高濃度組與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖3 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞中Bax及Bcl-2蛋白表達量的影響Note. A: Normal group; B: Model group; C: Low-dose nimodipine group; D: Moderate-dose nimodipine group; E: High-dose nimodipine group. **P<0.01, compared with the normal group. ##P<0.01, compared with the model group.Fig.3 Effect of nimodipine on expressions of Bax and Bcl-2 protein in PC12 cells induced by H2O2

3.6 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞中p53蛋白表達量的影響

與正常組比較，模型組中p53表達量提高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平低、中、高濃度組中p53表達量降低(P<0.01)。見圖4。

A：正常組；B：模型組；C：尼莫地平低濃度組；D：尼莫地平中濃度組；E：尼莫地平高濃度組與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖4 尼莫地平對H2O2誘導的PC12細胞中p53蛋白表達量的影響Note. A: Normal group; B: Model group; C: Low-dose nimodipine group; D: Moderate-dose nimodipine group; E: High-dose nimodipine group. **P<0.01, compared with the normal group. ##P<0.01, compared with the model group.Fig.3 Effect of nimodipine on expressions of p53 protein in PC12 cells induced by H2O2.

4 討論

PC12細胞是來源于大鼠腎上腺嗜絡細胞瘤的一種細胞，因其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生化功能與神經(jīng)元非常的類似，所以常常被用來作為研究神經(jīng)細胞生長、凋亡、發(fā)育及功能的細胞培養(yǎng)模型[12, 13]。H2O2作為氧自由基中的一種，也常作為研究細胞氧化應激模型的誘導劑，所以本研究首先結(jié)合相關報道[10, 11]及MTT預實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 μmol/L H2O2能使50%左右的PC12細胞凋亡，能顯著抑制PC12細胞活力，因此本研究選用此濃度作為作為PC12細胞氧化應激模型的誘導劑量。

尼莫地平屬于二氫吡啶類的鈣離子拮抗劑，能通過阻斷Ca2+電壓依賴性的鈣通道進入細胞內(nèi)，降低細胞內(nèi)Ca2+濃度，同時也能抑制細胞內(nèi)的Ca2+濃度釋放，使細胞內(nèi)的Ca2+濃度維持在一定濃度。尼莫地平具有很強的脂溶性，易于通過血腦屏障，進入腦組織，發(fā)揮腦組織保護作用。臨床上尼莫地平常用于腦部疾病的治療，近些年來體外實驗還證實尼莫地平對于低氧誘導的PC12細胞毒性，氧糖剝奪及谷氨酸誘導的PC12細胞凋亡具有顯著的抑制作用，從而提示尼莫地平能顯著的保護神經(jīng)細胞[7-9]。所以本研究在此基礎上通過MTT法及Hoechst法檢測尼莫地平對于H2O2誘導的細胞活力及細胞凋亡率的影響，結(jié)果表明尼莫地平能顯著的提高H2O2誘導的細胞活力，降低細胞凋亡率，與Bork等[8]，Rahbar-Roshandel等[9]結(jié)果一致，提示尼莫地平對于氧化應激誘導的PC12細胞損傷具有保護作用。

細胞凋亡由細胞凋亡基因嚴格控制，其中研究最為廣泛的Bcl-2蛋白家族，Bax及Bcl-2是Bcl-2家族常見促凋亡蛋白及抑凋亡蛋白，二者能形成異源二聚體，進而作用于線粒體膜上，促使caspase進行級聯(lián)反應，最終誘導細胞凋亡。Caspase在正常情況下是以無活性酶原形式存在于細胞內(nèi)，當受到上游凋亡信號刺激時，caspase的起始因子caspase 9被其它激酶所剪切或者自身發(fā)生切割作用后被激活，傳遞凋亡級聯(lián)信號，最終傳遞到caspase家族的執(zhí)行因子caspase 3，導致細胞凋亡。p53是種常見的抑癌基因，包括野生型及突變型兩種，前者能顯著的使細胞周期停止，后者對于細胞凋亡無任何影響。研究顯示H2O2能顯著的上調(diào)Bax及p53表達，下調(diào)Bax表達，并提高caspase 3及caspase 9活性，通過抑制此變化，能顯著的阻斷H2O2誘導的PC12細胞凋亡[14-16]。本研究繼續(xù)探討尼莫地平對于上述蛋白表達及活性的影響，結(jié)果表明尼莫地平能顯著降低Bax及p53表達量，提高Bax表達量，并抑制caspase 3及caspase 9的活性，從而提示尼莫地平能通過調(diào)控細胞凋亡相關蛋白表達，從而發(fā)揮其抵抗H2O2誘導PC12細胞凋亡的作用。

另外氧自由基的過度積累會直接導致細胞膜脂質(zhì)過氧化，其中MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化后的副產(chǎn)物，是細胞遭受氧化應激損傷的生物標志物。SOD是細胞內(nèi)主要的抗氧化酶，能夠清除細胞內(nèi)氧自由基，從而抵抗氧自由基損傷。所以本研究接著利用比色法檢測尼莫地平對于SOD活性及MDA含量的影響，結(jié)果表明尼莫地平能顯著的提高H2O2誘導的PC12細胞上清液中SOD活性，而降低MDA含量，進而提示尼莫地平能提高H2O2誘導的PC12細胞的抗氧化能力，進而發(fā)揮其細胞凋亡抑制作用。

綜上所述，尼莫地平能顯著的抵抗H2O2誘導PC12細胞凋亡，與上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax、p53表達，提高SOD活性并降低caspase 3，caspase 9活性及MDA含量有關。

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Protective effect ofnimodipineon PC12 cell apoptosis induced by H2O2

Li Hui-ran

(Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Shandong Medical College, Linyi, Shandong 276000, China)

Obejective To explore the protective effect of nimodipine on PC12 cell apoptosis induced by hydrogen peroxide (H2O2). Methods The cells were randomized into five groups: normal group, model group (200 μmol/L H2O2), nimodipine low-, medium- and high-dose groups (1, 10, 100 μmol/L nimodipne+200 μmol/L H2O2). Cell viability was measured by MTT assay. Cell apoptosis was assessed by Hoechst staining. The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (caspase 3), caspase 9 and superoxide dismutase (SOD), the level of malonic aldehyde (MDA) were measured bycolorimetry. The expression of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax) and p53 were detected by western blot. Results Compared with the normal group, the cell apoptosis rate, the activity of caspase 3 and caspase 9, the MDA level, and the expression of Bax and p53 were significantly increased, the cell viability, SOD activity, and expression of Bcl-2 were decreased in the model group (P<0.01). Compared with the model group, the cell apoptosis rate, the activity of caspase 3 and caspase 9, the level of MDA, and the expression of Bax were decreased; and the cell viability, SOD activity, and the expression of Bcl-2 were increased in the nimodipine low-, medium- and high-dose groups (P<0.01). Conclusions Nimodipine suppresses cell apoptosis induced by H2O2in PC12 cells, which may be related to regulation of expression of cell apoptosis-related proteins.

Nimodipine; PC12 cell line; Hydrogen peroxide; Apoptosis

李輝然(1974-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究發(fā)現(xiàn)方向：神經(jīng)外科腦出血及腦腫瘤， E-mail:13605398296 jmqf01@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0014-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.003

2016-11-20