王博雅,王力,劉美如,葉仕根,黎睿君,李華,李強(qiáng)

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區(qū)的流行情況分析

王博雅,王力,劉美如,葉仕根,黎睿君,李華,李強(qiáng)

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

為解決近年來遼寧地區(qū)凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei病害頻發(fā)的問題,于2015年8月從遼寧省盤錦、營口地區(qū)26個發(fā)病的凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘中隨機(jī)采集病蝦樣本,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)和對蝦桃拉綜合征病毒(TSV),并用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplication, LAMP)技術(shù)檢測蝦肝腸胞蟲Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情況。結(jié)果表明:IHHNV和EHP的檢出率較高,分別為65.4%和34.6%,WSSV和TSV的檢出率分別為19.2%和7.7%;EHP的檢出率與對蝦體型大小密切相關(guān),在小蝦樣本中檢出的陽性率高達(dá)100%,而大蝦樣本中均未檢出;26份對蝦樣本中有7份樣本同時攜帶EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月遼寧地區(qū)凡納濱對蝦的主要流行病原,發(fā)病率可能與對蝦生長緩慢、個體大小差異明顯相關(guān)。

凡納濱對蝦;傳染性皮下及造血組織壞死病毒;白斑綜合征病毒;桃拉綜合征病毒;蝦肝腸胞蟲

近年來,隨著養(yǎng)蝦業(yè)的再次興旺,對蝦養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,但由于對蝦病害嚴(yán)重,給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,對蝦病毒已發(fā)現(xiàn)20多種[1-2],其中對對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重的主要為對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、桃拉綜合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)[3]。2009年發(fā)現(xiàn)的蝦肝腸胞蟲Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)是一種主要寄生于對蝦肝胰臟組織中的新病原,可導(dǎo)致對蝦生長阻滯,給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

盤錦、營口地區(qū)是遼寧省最大的兩個凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei養(yǎng)殖區(qū),目前對遼寧地區(qū)對蝦病害的研究報道大多集中在中國明對蝦及凡納濱對蝦暴發(fā)性病害的病原及病理研究方面[5-13],對暴發(fā)性死亡病例的病原分析[14]報道甚少。為此,本研究中,于2015年8月對遼寧省盤錦、營口地區(qū)26個對蝦養(yǎng)殖池凡納濱對蝦的WSSV、IHHNV、 TSV和EHP的流行情況進(jìn)行了調(diào)查和分析并給出防治建議,旨在為該地區(qū)對蝦養(yǎng)殖業(yè)的疾病綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 WSSV檢測 按照天根公司的基因組DNA提取試劑盒(TIAN amp Genomic DNA Kit)操作步驟提取各組待測樣本中基因組總DNA,于-20℃下保存?zhèn)溆?。按照OIE的《水生動物疫病診斷手冊》(2016版)[15]WSSV套式PCR檢測方法進(jìn)行樣品檢測。檢測WSSV所用引物為

146F1:5′ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG 3′;

146R1:5′TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA 3′; 146F2:5′GTAACTGCCCCT TCCATCTCCA 3′; 146R2:5′TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3′。

1.2.2 IHHNV檢測 各組待測樣本中基因組總DNA的提取方法同“1.2.1”。按照OIE的《水生動物疫病診斷手冊》[15]IHHNV的檢測方法進(jìn)行樣品檢測。檢測IHHNV所用引物為

1.2.3 TSV檢測 按照天根公司的總RNA提取試劑盒(RNA simple Total RNA Kit)操作步驟提取總RNA,于-80℃下保存?zhèn)溆?。以各組樣本總RNA為模板,使用全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照OIE的《水生動物疫病診斷手冊》[15]進(jìn)行TSV的RT-PCR檢測。檢測TSV所用引物為

1.2.4 EHP檢測 按照中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所EHP檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行EHP的LAMP檢測,反應(yīng)結(jié)束后直接觀察樣品反應(yīng)管中的顏色并與對照管顏色進(jìn)行比對,判定檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況與臨床癥狀

2015年8月,遼寧省盤錦、營口地區(qū)凡納濱對蝦未見暴發(fā)性發(fā)病或大量死亡,疾病呈現(xiàn)慢性發(fā)病特點,主要特征為生長緩慢,體型大小差異明顯,活力差,少數(shù)池塘的對蝦出現(xiàn)紅腿、空腸空胃、頭胸甲易剝離且有白斑等癥狀,偶見對蝦不吃料、增氧機(jī)下池底有少量蝦死亡的情況(表1)。

窖泥質(zhì)感與原料土的種類及生產(chǎn)過程中物質(zhì)的積累有關(guān)，窖泥制作原料選擇黏土，隨著時間延長，原料土的顆粒大小及組成形式會發(fā)生變化，加之腐殖質(zhì)、淀粉物質(zhì)等積累會形成窖泥特殊的質(zhì)感。

2.2 病原檢測結(jié)果

2.2.1 WSSV的PCR檢測 在26份樣品中,5份樣品WSSV檢測呈陽性,總檢出率為19.2%(表2),且主要在大蝦樣本中檢出(表3)。部分被檢病蝦樣品WSSV的PCR檢測結(jié)果如圖1所示,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后,陽性對照樣品及部分對蝦樣本在941 bp處出現(xiàn)1條特異性條帶,表明這些陽性樣品中存在WSSV DNA,對蝦已受到WSSV感染。

2.2.2 IHHNV的PCR檢測 試驗結(jié)果顯示,在所有檢測項目中IHHNV的感染率最高,在26份樣品中有17份樣品IHHNV檢測呈陽性,其陰性率高達(dá)65.4%(表2),是本地區(qū)該養(yǎng)殖時期最主要的流行病原,其檢出率在不同體長對蝦樣本中無明顯差異(表3)。部分病蝦樣本IHHNV的PCR檢測結(jié)果如圖2所示,陽性對照樣品及部分病蝦樣本在389 bp處出現(xiàn)目的條帶。

圖1 部分被檢病蝦樣本的WSSV套式PCR檢測結(jié)果Fig.1 The results of WSSV detected by nested-PCR in Pacific white leg shrimpLitopenaeus vannamei

圖2 部分被檢病蝦樣本的IHHNV PCR檢測結(jié)果Fig.2 The results of IHHNV detected by PCR in Pacific white leg shrimpLitopenaeus vannamei

2.2.3 TSV的PCR檢測 26個養(yǎng)殖池塘僅有2個池塘的樣本TSV檢測呈陽性(表2),且均為小蝦樣本,陰性率為7.7%(表3)。部分病蝦樣本TSV的PCR檢測結(jié)果如圖3所示,陽性對照樣品及部分病蝦樣本在231 bp處出現(xiàn)目的條帶。

圖3 部分被檢病蝦樣本中TSV PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection results of TSV in Pacific white leg shrimpLitopenaeus vannamei

表1 病蝦感染EHP、WSSV、IHHNV和TSV的檢測結(jié)果Tab.1 Detection of EHP,IHHNV,WSSV and TSV by PCR or LAMP among Pacific white leg shrimpLitopenaeus vannameisamples

2.2.4 EHP的LAMP檢測 EHP在病蝦樣品中的檢出率也相對較高,為34.6%(表2),且所有小蝦樣本均呈陽性,陽性率為100%,而在大蝦樣本中未檢出(表3)。部分對蝦樣本EHP的LAMP檢測結(jié)果如圖4所示,病蝦樣品檢測結(jié)果與試劑盒中的陽性和陰性對照進(jìn)行比對,陽性檢測結(jié)果呈黃綠色,而陰性檢測結(jié)果呈橙色。

表2 26個池塘病蝦樣本中EHP、IHHNV、WSSV和TSV的檢出率Tab.2 Incidence rates of EHP,IHHNV,WSSV and TSV among Pacific white leg shrimpLitopenaeus vannameisamples from 26 ponds

3 討論

3.1 遼寧地區(qū)凡納濱對蝦病原的流行特點

本研究結(jié)果表明,遼寧地區(qū)凡納濱對蝦感染多種病原,在病蝦樣本中,3種病毒和一種寄生蟲均能檢測到,其中IHHNV和EHP的感染率較高,分別為65.4%和34.6%,WSSV感染率為19.2%, TSV的感染率最低,只有7.7%。這表明IHHNV和EHP是本地區(qū)對蝦感染率最高的兩種病原。

3.1.1 WSSV的流行特點 本研究結(jié)果表明, WSSV的感染率為19.2%,作者認(rèn)為這與調(diào)查工作在8月進(jìn)行有關(guān)。眾所周知,WSSV是當(dāng)前對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的病原,其感染力強(qiáng)、傳播速度快,會導(dǎo)致被感染對蝦短時間內(nèi)大量死亡。中國對蝦感染W(wǎng)SSV后死亡率幾乎達(dá)100%,而南美白對蝦則對WSSV具有一定的抵抗力,受感染后有部分個體可存活下來,但終生帶毒,其死亡率往往與養(yǎng)殖環(huán)境和管理水平呈負(fù)相關(guān)[16]。在北方地區(qū)WSSV引起對蝦大批死亡的時間一般在6—7月份,此時可引起暴發(fā)性死亡[14],而幸存者則可攜帶病毒存活到養(yǎng)殖中后期,其發(fā)病與否與該地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境、控制水平和管理的規(guī)范程度有關(guān)。推測若在6—7月份進(jìn)行調(diào)查,WSSV的感染率會更高。

3.1.2 IHHNV的流行特點 IHHNV能夠感染包括受精卵在內(nèi)的各個生長階段的對蝦,感染后對蝦終生帶毒,并能通過垂直和水平方式進(jìn)行傳播[17-18]。IHHNV可導(dǎo)致對蝦生長緩慢、規(guī)格大小差異大和畸形,但死亡率卻不高[19-20],也會引起對蝦的矮小畸形癥候群(Runt-deformity syndrome, RDS)。本試驗結(jié)果顯示,8月份遼寧省盤錦、營口地區(qū)的26個自然發(fā)病的凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘中, IHHNV的檢出率最高,高達(dá)65.4%。本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn),該地區(qū)凡納濱對蝦未出現(xiàn)暴發(fā)性大規(guī)模死亡,而普遍以生長緩慢、個體大小差異大的癥狀為主。IHHNV感染率高、死亡率低,在本地區(qū)該養(yǎng)殖時期成為最主要的流行病原,且與發(fā)病特征相吻合。此外,檢測結(jié)果還顯示,IHHNV的檢出與對蝦體型大小無關(guān),這與Kalagayan等[20]的試驗結(jié)果相符。該病毒的發(fā)病程度與飼養(yǎng)、管理水平有關(guān),一般不急性發(fā)病,感染率較高,其危害主要是影響生長。浙江省養(yǎng)殖凡納濱對蝦IHHNV的檢出率更高,達(dá)100%[3],表明IHHNV已嚴(yán)重感染中國南北沿海地區(qū)的凡納濱對蝦,因此,加強(qiáng)對IHHNV的防控措施十分必要。

表3 不同體長病蝦EHP、IHHNV、WSSV、TSV的感染率Tab.3 Incidence rates of EHP,IHHNV,WSSV and TSV among Pacific white leg shrimpLitopenaeus vannameisamples with different body length

圖4 部分被檢病蝦樣本中EHP LAMP檢測結(jié)果Fig.4 LAMP detection of EHP among Pacific white leg shrimpLitopenaeus vannamei

3.1.3 TSV的流行特點 TSV原本是凡納濱對蝦的主要病原,但此次僅有兩個池塘樣本呈陽性,且均為小蝦樣本。這與TSV的感染率逐年下降的趨勢相吻合[3]。由此可見,近年來TSV并未對國內(nèi)凡納濱對蝦的養(yǎng)殖造成大的危害。

3.1.4 EHP的流行特點 目前,EHP已在中國多個對蝦養(yǎng)殖區(qū)被檢出,且檢出率有增加的趨勢。EHP導(dǎo)致受感染的對蝦生長阻滯、個體大小差異明顯,且會導(dǎo)致細(xì)菌的繼發(fā)感染[21]。本研究結(jié)果表明,遼寧地區(qū)對蝦EHP的檢出率較高,達(dá)34.6%,是該地區(qū)的主要流行病原。本研究中檢測呈陽性的池塘中對蝦生長緩慢,個體大小差異極其明顯,小蝦幾乎不蛻殼且活力差,但吃料正常,且EHP僅在小蝦樣本中檢測到,其檢出率高達(dá)100%,而大蝦樣本中則均未檢出。EHP檢測結(jié)果呈陽性的9個池塘中有7份樣品也同時檢出IHHNV,兩種病原混合感染比例較高。這與劉寶彬等[22]、陳祿芝等[23]的研究結(jié)果相符。

3.2 防治建議及對策

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn),遼寧省盤錦、營口地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對蝦病原以IHHNV和EHP為主,而不是以往備受關(guān)注的WSSV和TSV,這表明養(yǎng)殖對蝦的疾病是動態(tài)發(fā)展與變化的。因此,相關(guān)部門應(yīng)加大對養(yǎng)殖對蝦主要流行疾病的監(jiān)測,及時揭示對蝦疾病的流行規(guī)律及趨勢,以便有針對性的指導(dǎo)防控工作。目前,養(yǎng)殖戶和科研工作者應(yīng)更加關(guān)注IHHNV和EHP所帶來的危害,做好相應(yīng)防治工作。同時調(diào)查還發(fā)現(xiàn),同一池塘對蝦存在多種病原同時感染情況,因此,在進(jìn)行對蝦病害防治工作中應(yīng)對多種病原采取綜合防控措施。

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Epidemiological investigation of three major viruses and Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in Liaoning Province

WANG Bo-ya,WANG Li,LIU Mei-ru,YE Shi-gen,LI Rui-jun,LI Hua,LI Qiang
(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

White spot syndrome virus(WSSV),infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus(IHHNV) and Taura syndrome virus(TSV)were detected by nested-PCR and RT-PCR and Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)was detected by LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplication)kit in diseased Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei collected from 26 shrimp culture ponds in Yingkou and Panjin,Liaoning Province in August 2015.The results showed that the IHHNV had incidences of 65.4%with positive rates of 19.2%and EHP had incidences of 34.6%.While the TSV showed positive rates of 7.7%.EHP positive was found in all the small shrimp samples and seven diseased shrimp samples showed co-infection of IHHNV and EHP.There was higher positive rate in large-sized shrimp samples(100%)than in small-sized shrimp samples(0%).The findings indicated that IHHNV and EHP were major pathogens in Pacific white leg shrimp in Liaoning Province in August 2015.

Litopenaeus vannamei;infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus(IHHNV);white spot syndrome virus(WSSV);Taura syndrome virus(TSV);Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.02.005

2095-1388(2017)02-0150-05

Q954.4

:A

2016-11-17

遼寧省海洋漁業(yè)廳重點攻關(guān)項目(201402)

王博雅(1991—),女,碩士研究生。E-mail:769352220@qq.com

李強(qiáng)(1979—),男,博士,教授。E-mail:liqiang@dlou.edu.cn