楊靜靜， 丁重陽*， 顧正華， 張 梁， 石貴陽

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

玉米粉對靈芝菌體形態(tài)及胞外多糖的影響

楊靜靜1，2， 丁重陽*1，2， 顧正華2， 張 梁1，2， 石貴陽1，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

研究了靈芝液體深層發(fā)酵中，玉米粉對靈芝菌體形態(tài)和胞外多糖產(chǎn)量、相對分子質(zhì)量、單糖組成的影響。發(fā)酵過程中隨著玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，靈芝菌球直徑逐漸減小，中小型（S型和M型）菌球利于靈芝多糖生產(chǎn)；對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米粉發(fā)酵獲得的多糖相對分子質(zhì)量及單糖組成比較，結(jié)果顯示，玉米粉對靈芝多糖的相對分子質(zhì)量沒有影響，但對靈芝多糖的單糖組成及其比例有很大影響，添加玉米粉發(fā)酵獲得的靈芝多糖中含有阿拉伯糖和木糖，但是巖藻糖和甘露糖的比例相對減少。

靈芝；胞外多糖；玉米粉；菌體形態(tài)

靈芝（Ganoderma lucidum）是名貴的食藥用真菌，靈芝多糖是靈芝的主要活性物質(zhì)之一。大量研究表明，靈芝多糖具有抗腫瘤[1-3]、降血糖[4]、抗氧化[5-7]、提高免疫力[8-10]等多種生物活性。近年來靈芝多糖的抗腫瘤活性研究較為深入，諸多學(xué)者報道具有低相對分子質(zhì)量或含有半乳糖等單糖組成或含有β-1，3糖苷鍵等都是其具有抗腫瘤活性的主要原因[11-12]。以傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵方式獲得靈芝子實體，具有產(chǎn)量小、耗費人力、周期較長等缺點，很難滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。與固態(tài)發(fā)酵相比，液體深層發(fā)酵技術(shù)，不僅可以免受氣候季節(jié)的影響、縮短培養(yǎng)周期、降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點，還可以大大增加菌絲體以及多糖、靈芝酸等產(chǎn)量，成為現(xiàn)代靈芝發(fā)酵的主要方式。

絲狀真菌菌體形態(tài)會受到培養(yǎng)環(huán)境的影響，而菌體形態(tài)的變化也會直接或間接的影響代謝物的合成。玉米粉可作為碳源等營養(yǎng)物質(zhì)的來源，在多種真菌的液態(tài)發(fā)酵中都有廣泛的應(yīng)用，但玉米粉對靈芝多糖等主要活性物質(zhì)發(fā)酵的作用尚未明確，且對靈芝菌體形態(tài)的影響尚不清楚，因此作者通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度玉米粉分析多糖產(chǎn)量和菌體形態(tài)的變化以進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基 PDA斜面培養(yǎng)基（g/L）：土豆200，葡萄糖20，瓊脂條20~22；種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，胰蛋白胨 5，無氨基酵母氮源 5，KH2PO43，MgSO4·7H2O 2，pH 6.0，培養(yǎng)基滅菌條件為110℃滅菌20 min，葡萄糖單獨滅菌后加入培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖+玉米粉共40（玉米粉分別為0，10，20，30，40），胰蛋白胨5，無氨基酵母氮源5，KH2PO43，MgSO4·7H2O 2，pH 6.0，培養(yǎng)基滅菌條件為115℃滅菌20min，葡萄糖單獨滅菌后加入培養(yǎng)基。1.1.2 菌種 靈芝（G.lucidum）菌株由江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室保藏。

1.1.3 主要試劑 常用的試劑均為國產(chǎn)分析純；無氨基酵母氮源 （YNB）為拜爾迪公司；胰蛋白胨（Tryptone）為英國Oxoid公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體發(fā)酵培養(yǎng) 種子培養(yǎng)時，250mL三角瓶裝液量為80 mL，高壓滅菌，待培養(yǎng)基冷卻后，從菌種斜面中取4塊0.5 cm2大小的活化菌種接入三角瓶內(nèi)，在150 r/min、30℃條件下培養(yǎng)10 d。發(fā)酵培養(yǎng)時，500mL三角瓶裝液量為150mL，接種量大約0.5 g（菌體濕質(zhì)量），在150 r/min、30℃條件下培養(yǎng)10 d。

1.2.2 菌體形態(tài)分析 液體發(fā)酵如2.2.1所示，發(fā)酵條件為30℃、pH 6.0、150 r/min，考察發(fā)酵時間及玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌體形態(tài)及多糖合成的影響，（葡萄糖+玉米粉）質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%（玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%，1%，2%，3%，4%）。

將槍頭一端剪平，小心吸取5 mL發(fā)酵液到小玻璃平皿中，每一個樣品中都至少含有20個菌球，并往平皿中加15 mL蒸餾水，使菌球處于懸浮狀態(tài)，使用數(shù)碼相機進行拍照，接下來用Image-proplus軟件對菌球當(dāng)量直徑D進行分析，并按照公式計算。

式中，A為菌球面積，mm2；D為菌球當(dāng)量直徑，mm。

1.2.3 菌體生物量測定 均勻、準(zhǔn)確量取菌體溶液于5mL離心管中，冰浴冷卻10min，然后10 000 r/ min，4℃離心5min，棄上清液。用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液洗滌沉淀2次。洗滌后的菌體加入適量的體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液，在80℃水浴中抽提25min。抽提結(jié)束后置冰浴中冷卻，用上述條件離心10min。上清液用體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液適當(dāng)稀釋，用紫外分光光度計測定其260 nm處的吸光度值。

以260 nm處吸光度值對菌體濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出菌體干質(zhì)量（mg）關(guān)于吸光度值的線性方程，Y=1.320 7x（R2＝0.997 6）。將測得的發(fā)酵液總核酸含量代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到發(fā)酵液的菌體干重，換算出菌體濃度。

1.2.4 靈芝胞外多糖含量測定及提取 取1 mL發(fā)酵液上清，加4倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，漩渦震蕩充分混合后于4℃冰箱靜置過夜，10 000 r/min，離心5min去上清，室溫揮發(fā)殘余酒精，加4 mL純凈水溶解沉淀，取200μL上清用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

量取一定量發(fā)酵液上清，加入4倍體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，充分混合，置于4℃過夜，10 000 r/min，離心5min去上清，室內(nèi)揮發(fā)去除酒精，加適量純凈水溶解沉淀，10 000 r/min，離心5 min，上清液冷凍干燥后即為靈芝胞外多糖。

1.2.5 還原糖的測定 取100μL發(fā)酵液上清，用DNS法測還原糖。100μL發(fā)酵液上清，加1.9mL去離子水，加1 mL DNS，在沸水中煮沸5 min，冷卻后定容至25mL，在540 nm測OD值。

1.2.6 水溶性淀粉測定 25mL棕色容量瓶中加入0.02%I2-KI標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL，加濾液100μL，定容至25mL，搖勻。以空白溶液為參比溶液，用1 cm比色皿，在最大吸收波長610 nm處，測定樣品溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中淀粉含量。

1.2.7 氣相色譜分析靈芝多糖的單糖組成 稱取20mg的靈芝粗多糖于玻璃水解管中，加入2mL的1mol/L H2SO4，用保鮮膜封管，于105℃條件下水解8 h。在水解的樣液中加適量碳酸鋇粉末，直至上清液由酸性變?yōu)橹行?，離心，保留上清，沉淀以蒸餾水洗滌2次，離心后上清液并入，至此得到的上清液為游離單糖溶液。

衍生化：在游離單糖溶液中加入1 mg肌醇做內(nèi)標(biāo)，經(jīng)冷凍干燥后得到的粉末，加10 mg鹽酸羥胺，0.5mL吡啶于90℃水浴中保持30 min，取出冷卻后加入0.5 mL乙酸酐于90℃水浴中保持30 min，待樣品冷卻后進行GC分析。

GC色譜分析條件：檢測器為氫火焰離子鑒定器；檢測器和氣化室溫度分別為 250℃和260℃；OV1701石英毛細管柱；采用程序升溫，起始柱溫120℃，持續(xù)3min，隨后以10℃/min的速度升至195℃，保持0.1 min，然后以3℃/min的速度升溫至240℃，保持10min載氣壓力（N2）0.60 kg/cm2，燃氣壓力（H2）0.65 kg/cm2，助燃氣壓力（空氣）0.50 kg/ cm2，分流比為30∶1。單糖分析：以內(nèi)標(biāo)法定出各單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中Ai為某單糖樣品峰面積；AIi為樣品中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積；AIs為標(biāo)樣中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)峰面積；As為某單糖標(biāo)樣峰面積；ms為某單糖標(biāo)樣的質(zhì)量 （mg）；mIs為標(biāo)樣中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量（mg）；mIi為樣品中加入的肌醇內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量（mg）；m為稱取糖樣品的質(zhì)量（mg）。

1.2.8 高效液相排阻色譜色譜分析靈芝多糖的相對分子質(zhì)量 冷凍干燥后的粗多糖，稱取適量于5 mL的EP管中，加入2mL純凈水使之溶解，用0.22 μm水膜過濾的糖液利用液相色譜進行分析。Waters600高效液相色譜儀 （美國Waters公司），配備2410示差折光檢測器和Empower工作站。分析條件：色譜柱：LtrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mm；流動相：0.1 mol/L NaNO3；流量：0.9 mL/min；柱溫：45℃；進樣量：20μL。

根據(jù)以上色譜條件分別測出各種葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣 （Mw分別為 135 350、36 800、9 750和 2 700，Sigma）的色譜峰保留時間。以標(biāo)樣的lg Mw為縱坐標(biāo)，色譜峰保留時間Rt為橫坐標(biāo)，使用線性方程擬合得標(biāo)準(zhǔn)校正曲線方程為lg Mw=-0.488 9x+14.514，R2=0.998 2，相關(guān)性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米粉對靈芝菌球直徑的影響

利用Image-pro-plus軟件分析靈芝菌球當(dāng)量直徑。見圖1，菌球的平均直徑隨著發(fā)酵時間的延長而顯著增大，尤以未添加玉米粉培養(yǎng)最顯著；玉米粉添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和2%時，菌球的平均直徑隨著發(fā)酵時間的延長而緩慢增大；玉米粉添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%和4%時，菌球的平均直徑從第3天起下降，第5天平均直徑最小，然后菌球平均直徑開始緩慢增大。

圖1 玉米粉發(fā)酵靈芝菌球平均當(dāng)量直徑變化Fig.1 Effect of corn powder on average pellet diameter of G.lucidum

在靈芝的液體發(fā)酵過程中，接種時種子培養(yǎng)基中的靈芝球形菌體在生長過程中產(chǎn)生突刺，突刺從第一代菌球上脫落后形成小菌球，成為第二代菌[13]。靈芝發(fā)酵的第5天，添加玉米粉培養(yǎng)的靈芝菌球平均直徑呈現(xiàn)出緩慢增加趨勢，而且隨著玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，平均直徑的變化幅度也在變大，可能是由于玉米粉濃度增大導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的增加使得靈芝菌體生長迅速，固形物量的增大又使得菌體之間的摩擦系數(shù)增大，促使突刺急劇脫落形成二代菌球，因而玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，其平均直徑越小。

2.2 玉米粉對靈芝胞外多糖的影響

靈芝胞外多糖在發(fā)酵過程中濃度變化如圖2（a）所示，在發(fā)酵初始的第3天開始，多糖質(zhì)量濃度大部分會先下降然后在第5天達到最高，隨后開始逐漸下降。圖2（b）顯示淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著發(fā)酵時間的消耗過程，發(fā)酵結(jié)束時基本耗盡。玉米粉是一種復(fù)合碳源，包含大量淀粉類多糖，較多文獻選擇玉米漿或者玉米淀粉為碳源，目的是提高所需目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，包括靈芝多糖、靈芝酸及蛋白酶。

圖2 靈芝液體深層發(fā)酵過程中的多糖、淀粉和還原糖質(zhì)量濃度Fig. 2 Content of exopolysaccharrides，starch and reducing sugar during submerged fermentation of G.lucidum

Wagner[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，在缺乏葡萄糖的發(fā)酵環(huán)境中添加葡萄糖，其多糖產(chǎn)量要比初始培養(yǎng)基中存在葡萄糖更高。對靈芝發(fā)酵過程中的還原糖含量進行檢測發(fā)現(xiàn)（圖2（c）），未添加玉米粉的發(fā)酵液還原糖含量是逐漸降低的，而添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%和3%玉米粉的發(fā)酵液中，分別在第6天和第7天達到最大，然后開始下降。質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%玉米粉的培養(yǎng)基中并沒有添加葡萄糖，發(fā)酵第5天開始在發(fā)酵液中出現(xiàn)還原糖，在發(fā)酵第7天達到最大質(zhì)量濃度后開始下降。在所有添加玉米粉條件中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%玉米粉所獲得的靈芝多糖產(chǎn)量最高，此條件與Wagner研究結(jié)果類似。所有添加了玉米粉培養(yǎng)的靈芝發(fā)酵液中都出現(xiàn)了還原糖含量隨著發(fā)酵時間增加的現(xiàn)象，結(jié)合發(fā)酵液中淀粉質(zhì)量濃度結(jié)果（圖2（b）），應(yīng)該是靈芝發(fā)酵過程中產(chǎn)生了淀粉酶，繼而水解發(fā)酵液中的淀粉，從而還原糖的質(zhì)量濃度有了升高，并且質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%玉米粉組有了一定的還原糖積累，第7天達最大值，然后開始下降。

2.3 菌體形態(tài)和胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)系

因為靈芝多糖產(chǎn)量在第5天達到最高，因此對第5天不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米粉條件下靈芝菌球直徑進行分析，結(jié)果見圖3。隨著玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，S型菌球所占的比例逐漸增大，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%玉米粉組里占最大比例（67．8±6．7%），而M型菌球所占比例先增大后減小，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，2%和3%組均為最大比例，L型菌球所占比例隨著玉米粉濃度的提高而逐漸減少，XL型菌球是4種菌球類型中比例從未占過最大的一組菌球，雖然其所占比例一直很小，隨著玉米粉濃度提高，其所占比例也逐漸減少。

靈芝液體發(fā)酵過程中，添加玉米粉發(fā)酵測得的靈芝多糖質(zhì)量濃度遠遠大于對照（圖4（a）和（b））。對照中的靈芝菌球隨著發(fā)酵時間延長，S和M型菌球比例逐漸減少，X和XL型菌球比例逐漸增加，主要是中大型菌球，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%玉米粉發(fā)酵獲得菌球一直以S和M型菌球為主，這與作者前期研究結(jié)果相似，即中小菌球是合成多糖的主要菌球，玉米粉是通過改變菌球形態(tài)進而影響多糖產(chǎn)量的[14]。Fang有研究證明，相比于D≧1．6 mm菌球，D＜1．2 mm的菌球最利于靈芝多糖的合成，可以獲得較高的靈芝胞內(nèi)多糖產(chǎn)量[15]。

S：D＜0．8mm；M：0．8≤D＜1．6mm；L：1．6≤D＜2．5mm；XL：D≧2．5mm圖3 發(fā)酵第5天玉米粉對靈芝產(chǎn)多糖和菌體形態(tài)的影響Fig.3 Effect of corn powder on EPS yield and the m ycelium morphologyof G.lucidumon day 5

圖4 玉米粉對靈芝菌球形態(tài)及胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of corn powder on EPS yield and the mycelium morphologyduring submerged fermentation of G.lucidum

2.4 玉米粉對靈芝多糖相對分子質(zhì)量及單糖組成的影響

經(jīng)過對靈芝多糖相對分子質(zhì)量進行分析，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖在不同時間中是由多種不同相對分子質(zhì)量的多糖組分組成通過不同多糖組分的峰面積進行比較后發(fā)現(xiàn)，未添加玉米粉的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的多糖，在第5天和第7天主要有兩種，相對分子質(zhì)量較大所占比例較小，而相對分子質(zhì)量分布在2 700左右的多糖所占比例高于98%。在添加玉米粉后，在發(fā)酵第5天時，高相對分子質(zhì)量靈芝多糖比例達50%以上，而在第7天時小相對分子質(zhì)量多糖比例與對照結(jié)果相似，面積比提高到98%以上（表1）。發(fā)酵過程過程出現(xiàn)的高比例大分子多糖，可能是由于培養(yǎng)基中添加的玉米粉中所含淀粉等物質(zhì)引起，但在發(fā)酵第7天時大分子多糖所占比例已遠遠低于正常發(fā)酵中多糖相對分子質(zhì)量比例，此結(jié)果說明發(fā)酵結(jié)束時玉米粉基本不影響發(fā)酵結(jié)束后靈芝多糖的性質(zhì)。此外，添加玉米粉后靈芝多糖相對分子質(zhì)量在發(fā)酵結(jié)束后與對照實驗中多糖的相對分子質(zhì)量基本一致，說明玉米粉的添加并未影響靈芝多糖的相對分子質(zhì)量。

在對靈芝多糖和玉米粉的單糖組成進行分析后發(fā)現(xiàn)，未添加玉米粉的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的靈芝多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，其中葡萄糖的摩爾比例在90%以上，而添加玉米粉后靈芝多糖的葡萄糖仍為主要單糖，但增加了巖藻糖、阿拉伯糖和木糖，隨著玉米粉濃度的增加葡萄糖所占比例不斷增大，而甘露糖和阿拉伯糖比例逐漸降低。同時，發(fā)酵第7天葡萄糖的摩爾比例對比發(fā)酵第5天有所下降，而甘露糖和阿拉伯糖逐漸提高。此結(jié)果說明，雖然玉米粉的添加并未影響靈芝多糖的相對分子質(zhì)量，但改變了靈芝多糖的單糖組成和比例。有研究結(jié)果表明，多糖中相對分子質(zhì)量和單糖組成的改變會對其生物活性造成影響[12]。因此玉米粉的添加造成的靈芝多糖單糖組成的改變可能是調(diào)節(jié)其生物活性的重要策略和手段。另外，葡萄糖的單糖組成比例遠遠高于其他單糖組成，選擇某一種單糖（葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖及木糖）做唯一碳源時，培養(yǎng)的靈芝多糖中該單糖組成的比例最高。

表1 靈芝多糖平均相對分子質(zhì)量及其面積比Table 1 Averagemolecular weight and area ratio of G.lucidum polysaccharides

3 結(jié)語

液體深層發(fā)酵中，絲狀真菌的代謝物產(chǎn)量會受菌體形態(tài)和菌球大小的影響，因此通過改變和控制菌體形態(tài)和菌球大小可以獲得較高的目的代謝物。作者在靈芝液體深層發(fā)酵中添加了不同濃度玉米粉，發(fā)現(xiàn)玉米粉導(dǎo)致靈芝菌球的當(dāng)量直徑減小，促進靈芝胞外多糖的產(chǎn)量。對不同玉米粉發(fā)酵獲得的靈芝多糖的相對分子質(zhì)量及單糖組成分析發(fā)現(xiàn)，玉米粉對靈芝胞外多糖的相對分子質(zhì)量幾乎沒有影響，對單糖組成影響較大，增加阿拉伯糖和木糖，巖藻糖和甘露糖比例下降。

藥用真菌是一種資源豐富的食用菌，目前已開發(fā)的藥用真菌主要以多糖成分為主，而藥用真菌除含有多糖外還含有生物堿、甾醇類和萜類等化合物。藥食用真菌有待進一步深入研究。

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Effect of Corn Powder on M ycelium M orphology and Exopolysaccharides of Ganoderma lucidum in Submerged Culture

YANG Jingjing1，2， DING Zhongyang*1，2， GU Zhenghua2， ZHANG Liang1，2， SHIGuiyang1，2
（1.Jiangnan University Biological Engineering，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Theeffectsof corn powderonmycelium morphology，exopolysaccharidesproduction and the monosaccharide composition were investigated in the liquid submerged fermentation of G. lucidumto obtain the high yield and activity of polysaccharidesusing solid composite carbon source. The pelletswere divided into four categories by the diameter of G.lucidum.The results showed that the pellets diameter decreased w ith the corn powder concentration increased during the fermentation process.The high percentage of S and M was beneficial to the exopolysaccharides production.The corn powder had no effect on the molecular weight of exopolysaccharides.However，it greatly affected themonosaccharide composition and proportion ofexopolysaccharides，inwhich therewere arabinoseand xylosewhile the proportion of fucoseandmannose declined.

Ganoderma lucidum，exopolysaccharides，corn powder，morphology

TS 201

A

1673—1689（2017）04—0383—06

2015-04-17

國家自然科學(xué)基金項目 （31271918）；國家863計劃項目 （2012AA021505）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（JUSRP51319B）。

*通信作者：丁重陽（1975—），男，江蘇南通人，工學(xué)博士，教授，主要從事發(fā)酵過程優(yōu)化控制及食藥用真菌生物技術(shù)研究。

E-mail：zyding@jiangnan.edu.cn

楊靜靜，丁重陽，顧正華，等.玉米粉對靈芝菌體形態(tài)及胞外多糖的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（04）：383-388.