于玲玲， 張富新， 邵玉宇， 云 丹， 雷飛艷， 候院林， 艾 對

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

影響羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度的化學(xué)因素

于玲玲， 張富新*， 邵玉宇， 云 丹， 雷飛艷， 候院林， 艾 對

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

研究了pH、金屬離子和抗氧化劑等化學(xué)因素對羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度的影響。結(jié)果表明，羊乳中pH為3時cAMP質(zhì)量濃度最高，pH為2時cGMP質(zhì)量濃度最高；Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+對羊乳中cAMP質(zhì)量濃度有促進(jìn)作用，而Cd2+可降低羊乳中cAMP的質(zhì)量濃度；Ca2+、Co2+、Mg2+、Zn2+對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度有促進(jìn)作用，而Fe2+、Ni2+對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度有降低作用；在羊乳貯存2~4 d內(nèi)抗氧化劑可降低羊乳中cAMP和cGMP的質(zhì)量濃度，在4 d后可促進(jìn)羊乳中cAMP和cGMP質(zhì)量濃度。

環(huán)核苷酸；pH值；金屬離子；抗氧化劑

羊奶營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)以及環(huán)核苷酸（Cyclic Nucleotides，CNT）、生長因子等生物活性物質(zhì)[1-2]。相對于牛奶，羊奶具有獨特的生理功能[3]，羊奶脂肪球較小，易于消化吸收，且羊奶中含有蛋白質(zhì)過敏原αs1-酪蛋白較少[4-5]，適用于易過敏人群。除此之外，羊奶還含有一定量的環(huán)核苷酸，主要包括環(huán)腺苷酸（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）和環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosinemonophosphate，cGMP），有益于大腦健康發(fā)育[6]。近年來，人們對乳中環(huán)核苷酸十分關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)一些維生素以及人體必須的微量元素等對乳中環(huán)核苷酸的質(zhì)量濃度有影響，維生素C可清除體內(nèi)過氧化物，保護(hù)生物膜的完整結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)核苷酸環(huán)化酶（Nucleotides cyclase，NC）的活性，使乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度增加[7]；Wickson[8]研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子Li2+和Ca2+有改變核苷酸環(huán)化酶（NC）和磷酸二酯酶 （phosphodiesterase，PDE）活性的作用，對體內(nèi)環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度有一定影響。作者較為系統(tǒng)地研究了基本化學(xué)因素pH、金屬離子和抗氧化劑對羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度的影響，為開發(fā)功能性羊乳產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊奶：來自西北農(nóng)林科技大學(xué)羊場的混合乳樣，取后分裝于50mL的離心管中，立即在-40℃下冷凍保存，分析前在4℃下解凍；

主要試劑：氯化銅（CuCl2）、氯化鎂（MgCl2）、氯化鋅（ZnCl2）、氯化鈣（CaCl2）、氯化亞鐵（FeCl2）、氯化鈷（CoCl2）、氯化鎘（CdCl2）、氯化鎳（NiCl2）、氯化錳（MnCl2）、氯化氫（HCl）、氫氧化鉀（KOH）、三氯乙酸（TCA）、高氯酸（HClO4）（AR）：天津天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

抗氧化劑：叔丁基對苯二酚（TBHQ）、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、叔丁基羥基茴香醚（BHA）、沒食子酸正丙酯（PG）、抗壞血酸（VC）、生育酚（VE）（食品級）：西安晶博試劑有限公司產(chǎn)品。

主要儀器：TGL-16B型臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；PHS-3C pH計：上海精科儀器有限公司產(chǎn)品；GSP-9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；Multiskan Go型全波長酶標(biāo)儀：美國熱電公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 pH值對羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度影響 取15 mL乳樣于20mL試管中，用1 mol/L HCl或1 mol/L KOH調(diào)節(jié)乳樣的pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，在室溫下保存2 h，測定其CNT質(zhì)量濃度。以未處理乳樣作為空白對照。

1.2.2 金屬離子對羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度影響取990μL的乳樣于2 mL的試管中，分別加入10 μL濃度為 100μmol/L或 10 mmol/L的 CuCl2、MgCl2、ZnCl2、CaCl2、FeCl2、CoCl2、CdCl2、NiCl2、MnCl2溶液，使乳樣中金屬離子最終濃度分別達(dá)到1 μmol/L或100μmol/L后，將其混合均勻，于室溫下保存2 h，測定其CNT質(zhì)量濃度。以未處理乳樣作為空白對照。

1.2.3 抗氧化劑對羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度影響稱取0.02 g的TBHQ、BHT、BHA、PG、VC、VE分別加入到100 mL的羊乳中，用渦旋振蕩器振蕩1 min，使其充分混勻。取1 mL添加抗氧化劑的乳樣于2 mL的試管中，在4℃下保存8 d，每隔1 d取樣測定其CNT質(zhì)量濃度。同時將未處理乳樣在同條件貯藏，作為空白對照。

1.2.4 環(huán)核苷酸的測定 樣品處理：取0.5 mL乳樣于2mL離心管中，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)1%的高氯酸和體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸（TCA），混合均勻后在3 000 g下離心15min，去除上層脂肪和沉淀。取上清液，用1 mol/L的KOH調(diào)節(jié)其pH至6.7（羊乳天然pH），用于CNT質(zhì)量濃度測定。

環(huán)核苷酸測定：cAMP和cGMP采用酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒測定。將試劑盒在室溫（20℃）下平衡20min后，取出試劑盒中板條。取10μL處理后的樣品加入板條反應(yīng)孔中，接著加入樣品稀釋液40 μL，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體液50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔后，在37℃下保溫60 min。然后棄去反應(yīng)孔中液體，將板條翻轉(zhuǎn)，在濾紙上拍干。在反應(yīng)后的反應(yīng)孔中加入350μL洗滌液，靜置1 min后，棄去洗滌液，在濾紙上拍干，如此重復(fù)5次。在洗滌后的板條反應(yīng)孔中加入底物A、B各50μL，37℃避光保溫15min。最后在反應(yīng)孔中加入終止液50μL，15min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔吸光度。每個樣品重復(fù)3次。

環(huán)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用上述方法檢測不同質(zhì)量濃度cAMP（cGMP）標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，然后以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），OD值為縱坐標(biāo)（Y），繪制cAMP（cGMP）標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算線性回歸方程，按回歸方程計算各樣品cAMP和cGMP質(zhì)量濃度。

表1 環(huán)核苷酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regression equations and their correlation coefficients of CNT

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分別采用Excel 2003、DPS 7.05軟件繪圖和方差分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 pH對羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度的影響

由圖1可以看出，當(dāng)pH為2時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度為（2 558.92±54.16）ng/mL；pH為3時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度明顯增大，達(dá)到 （5 493.12± 94.36）ng/mL；當(dāng)pH大于3時，羊乳中cAMP的質(zhì)量濃度逐漸降低；當(dāng)pH為13時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度降低到（638.41±19.51）ng/mL。羊乳中cGMP質(zhì)量濃度在pH為2時最高，達(dá)到 （18 000.77± 240.61）pg/mL，之后隨pH的增大呈逐漸降低的趨勢；當(dāng)pH達(dá)到13時，羊乳中cGMP質(zhì)量濃度降低到（4 871.40±262.33）pg/mL。未經(jīng)pH處理的乳樣中cAMP和cGMP質(zhì)量濃度分別為 （1 592.59±68.21）ng/mL和（4 982.29±268.84）pg/mL，在pH為3時羊乳中cAMP質(zhì)量濃度達(dá)最高，比未處理乳樣增加了245%，pH大于3時，羊乳中cAMP的質(zhì)量濃度逐漸下降，當(dāng)pH大于7時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度均顯著低于未處理羊乳中cAMP質(zhì)量濃度；在pH為2時羊乳中cGMP質(zhì)量濃度最高，比未處理乳樣增加了261%。由此可見，在酸性環(huán)境下羊乳中cAMP和cGMP質(zhì)量濃度明顯增大，而在堿性環(huán)境下羊乳中cAMP和cGMP質(zhì)量濃度明顯降低。

圖1 pH對羊乳中CNT質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of pH on contents of CNT

表2 不同pH處理羊乳與未處理羊乳中CNT的質(zhì)量濃度比Table 2 Ratio between CNT contents in different pH treated goat m ilk and CNT contents in untreated goatm ilk

2.2 金屬離子對羊乳中環(huán)腺苷酸質(zhì)量濃度的影響

由表3、表4可知，當(dāng)羊乳中Ca2++、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+和Zn2+濃度為1μmol/L時，羊乳的cAMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加了70%、44%、113%、37%、74%、79%和72%；當(dāng)羊乳中這些離子濃度增加到100μmol/L時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度也有不同程度的增加，表明Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+和Zn2+離子對羊乳中cAMP質(zhì)量濃度有促進(jìn)作用。當(dāng)羊乳中Cd2+濃度為1μmol/L時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度下降了88%；當(dāng)羊乳中Cd2+濃度增加到100μmol/L時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度也有所降低，表明Cd2+離子對羊乳中cAMP質(zhì)量濃度有降低作用。然而Co2+對羊乳中cAMP質(zhì)量濃度有不同的影響，當(dāng)羊乳中Co2+濃度為1μmol/L時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度較未處理乳樣增加36%，而當(dāng)羊乳中Co2+濃度為100 μmol/L時，羊乳中cAMP質(zhì)量濃度比未處理羊乳降低18%，表明低濃度（1μmol/L）Co2+對羊乳中cAMP質(zhì)量濃度有促進(jìn)作用，而高濃度（100μmol/L）Co2+對羊乳中cAMP有降低作用。

由表3、表4可知，當(dāng)羊乳中Ca2+、Co2+、Mg2+和Zn2+濃度為1μmol/L時，羊乳中cGMP質(zhì)量濃度分別增加了22%、6%、13%和11%；當(dāng)羊乳中這些離子濃度增加到100μmol/L時，羊乳中cGMP質(zhì)量濃度也有不同程度的增加，表明Ca2+、Co2+、Mg2+和Zn2+離子對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度有促進(jìn)作用。當(dāng)羊乳中Fe2+和Ni2+濃度為1μmol/L時，羊乳的cGMP質(zhì)量濃度分別降低了4%和6%；當(dāng)羊乳中Fe2+和Ni2+濃度增加到100μmol/L時，羊乳中cGMP質(zhì)量濃度也有所降低，表Fe2+和Ni2+離子對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度有降低作用。當(dāng)羊乳中Mn2+濃度分別為1μmol/L和100μmol/L時，羊乳中cGMP質(zhì)量濃度變化不大，表明Mn2+離子對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度影響較小。同時可以看出，羊乳中低濃度（1μmol/L）Cd2+和Cu2+對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度有一定促進(jìn)作用，而高濃度 （100μmol/L）Cd2+和Cu2+對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度具有抑制作用。

表3 金屬離子處理的羊乳中CNT的質(zhì)量濃度Table 3 Contents of CNT in metal ions treated goatm ilk

表4 金屬離子處理羊乳與未處理羊乳中CNT的質(zhì)量濃度比Table 4 Ratio between CNT contents in differentmental ion treated goatm ilk and CNT contents in untreated goatm ilk

2.3 抗氧化劑對羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度的影響

由圖2、表5可以看出，加入6種抗氧化劑的羊乳中cAMP的質(zhì)量濃度變化趨勢基本一致。未處理空白乳樣貯存期間cAMP質(zhì)量濃度無明顯變化（p＜0．05）；加入抗氧化劑的羊乳在貯存第2～4 d時羊乳中cAMP質(zhì)量濃度略有下降，其中添加BHA的羊乳中cAMP在第2 d時達(dá)到最低值（946．17±24．55）ng/ mL，降低了37%，添加BHT、TBHQ、PG、VC、VE的羊乳中cAMP在第 4 d時達(dá)到最低值 （411．59± 12．15）ng/mL、（546．67±36．89）ng/mL、（890．05± 27．75）ng/mL、（824．66±25．90）ng/mL、（813．48± 26．65）ng/mL，分別降低了73%、64%、41%、45%和46%；第4 d后添加不同抗氧化劑的羊乳中cAMP質(zhì)量濃度均有不同程度增加。表明抗氧化劑對貯存2～4 d的羊乳中cAMP質(zhì)量濃度具有降低作用，對貯存4 d后羊乳中cAMP質(zhì)量濃度具有促進(jìn)作用。

由圖3、表6中可以看出，加入6種抗氧化劑的羊乳中cGMP的質(zhì)量濃度變化趨勢基本一致。未處理空白羊乳貯存期間cGMP質(zhì)量濃度無明顯變化（p＜0．05）；加入抗氧化劑的羊乳在貯存第2～4 d時羊乳中cGMP質(zhì)量濃度略有下降，其中，添加TBHQ、BHA第 2 d的羊乳中cGMP質(zhì)量濃度最低為 （2 803．12±89．42）pg/mL、（4 200．86±139．46）pg/ mL，相比未處理羊乳，分別降低了40%、11%，添加BHT、PG、VC、VE的羊乳中cGMP到第4 d時達(dá)到最低分別為 （3 422．25±138．70）pg/mL、（3 004．39± 202．85）pg/mL、（3 118．61±131．69）pg/mL、（4 205．74± 194．95）pg/mL，降幅分別為27%、36%、34%和10%；第4 d后添加不同抗氧化劑的羊乳中cGMP質(zhì)量濃度均有不同程度增加。表明抗氧化劑對貯存2～4 d的羊乳中cGMP質(zhì)量濃度具有降低作用，對貯存4 d后的羊乳中cGMP質(zhì)量濃度具有促進(jìn)作用。

圖2 抗氧化劑處理的羊乳中cAMP質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Changes of cAMP concentration in antioxidants treatment goatm ilk

圖3 抗氧化劑處理的羊乳中cGMP質(zhì)量濃度的變化Fig.3 Changes of cGMP concentration in antioxidants treatment goatm ilk

表5 抗氧化劑處理羊乳與未處理羊乳中cAMP的質(zhì)量濃度比Table 5 Ratio between cAMP contents in different antioxidants treated goatm ilk and CNT contents in untreated goatm ilk

表6 抗氧化劑處理羊乳與未處理羊乳中cGMP的質(zhì)量濃度比Table 6 Ratio between cGMP contents in different antioxidants treated goatm ilk and CNT contents in untreated goatm ilk

3 討論

環(huán)核苷酸是由三磷酸核苷酸經(jīng)核苷酸環(huán)化酶（NC）催化合成，能被磷酸二酯酶（PDE）催化水解成單核苷酸；Wada[10]研究表明pH對NC和PDE的催化特性產(chǎn)生影響，并且在pH 7．5時PDE的活性最高，因此pH可通過影響NC和PDE的活性而影響CNT的含量。研究中羊乳中cAMP和cGMP質(zhì)量濃度在堿性條件時下降較多，這可能與羊乳pH在中性偏堿性條件下PDE活性較高，使羊乳中已有的環(huán)核苷酸分解，引起CNT質(zhì)量濃度下降有關(guān)。底物類似物和競爭性抑制劑也可以誘導(dǎo)PDE變構(gòu)或激活PDE，因此羊乳中CNT也能調(diào)節(jié)PDE的活性[11]。酶的結(jié)構(gòu)變化以及CNT的質(zhì)子化作用均與pH影響CNT質(zhì)量濃度有關(guān)[9]，CNT的重要基團(tuán)有環(huán)上的磷酸基團(tuán)和嘌呤環(huán)上的氨基基團(tuán)，其中磷酸基團(tuán)易在pH 7.4時解離，這或造成CNT在pH 7.5時水解度達(dá)最高[10]；CNT中互變異構(gòu)化的烯醇基團(tuán)在更高pH值時有助于PDE對CNT的水解，因此高pH對羊乳中cAMP和cGMP含量有一定降低作用。

Thomas[12]研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子的存在會加速或抑制CNT被相關(guān)PDE水解，部分金屬離子可與PDE的磷酸基團(tuán)絡(luò)合，降低其活性，從而減緩CNT的水解，一些金屬離子則會對PDE起激活作用，加速CNT的水解。胞內(nèi)CNT水平部分是由多種PDE的活性所調(diào)節(jié)的，這些酶的活性受二價金屬離子調(diào)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Co2+能調(diào)節(jié)牛心臟中依賴CNT的PDE的活性[12，14]，因此在羊乳中這些金屬離子也可通過改變羊乳中PDE活性調(diào)節(jié)CNT含量。Law[15]研究發(fā)現(xiàn)Zn2+的主要作用是抑制PDE的活性，Zn2+處理的羊乳中CNT高于未處理羊乳，該結(jié)果與Law的研究一致；體內(nèi)Mg2+較其他金屬離子濃度高，對體內(nèi)PDE活性的調(diào)節(jié)起主導(dǎo)作用[14]，Ca2+、Fe2+、Cu2+離子對PDE活性也有不同程度的調(diào)節(jié)作用[8，16-17]。二價金屬離子可以和CNT的磷酸或含氮氨基結(jié)合[18]，如Mn2+可以通過螯合CNT而調(diào)節(jié)羊乳中CNT質(zhì)量濃度。重金屬Cd2+通過cGMP/ NO通道對身體產(chǎn)生負(fù)面影響[19]，研究了Cd2+對CNT的影響，結(jié)果顯示低濃度的 Cd2+可減少羊乳中cAMP的質(zhì)量濃度。

TBHQ、BHT、BHA、PG、VE屬于酚型抗氧化劑，可有效清除自由基，自由基清除劑能借助鍵的均裂，釋放出體積小、親合性強(qiáng)的氫自由基[20]，與反應(yīng)生成的自由基結(jié)合而生成分子態(tài)化合物，將高勢能的極活躍的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檩^穩(wěn)定的分子，從而中斷鏈反應(yīng)的傳遞速度，VC屬于脫氧劑[21]，這些物質(zhì)對氧有強(qiáng)的親合力，可保護(hù)腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶的活性?？寡趸瘎┮环矫婵梢种芇DE活性，阻止CNT水解成單核苷酸[22-23]，另一方面，抗氧化劑可清除自由基，保護(hù)AC和GC不受影響[24-25]。羊乳中CNT在抗氧化劑加入第2~4 d，羊乳中CNT質(zhì)量濃度降低，第4 d后羊乳中CNT質(zhì)量濃度逐漸升高，可能與羊乳中腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶有關(guān)。

4 結(jié)語

對影響羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度的化學(xué)因素的研究，表明酸性環(huán)境可提高羊奶中cAMP和cGMP的質(zhì)量濃度，而堿性環(huán)境可降低羊乳中cAMP和cGMP質(zhì)量濃度；金屬離子Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+和Zn2+對羊乳中cAMP質(zhì)量濃度的增加有促進(jìn)作用，Cd2+降低了cAMP的質(zhì)量濃度；Ca2+、Co2+、Mg2+、Zn2+對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度有增加的作用，F(xiàn)e2+和Ni2+對羊乳中cGMP質(zhì)量濃度有降低的作用；抗氧化劑對貯存初期的羊乳中cAMP和cGMP有明顯的抑制作用。

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Research on Effects of Chem ical Factors on Contents of Cyclic Nucleotides in Goat M ilk

YU Lingling， ZHANG Fuxin*， SHAO Yuyu， YUN Dan， LEIFeiyan， HOU Yuanlin， AIDui
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shanxi Normal University，Xi'an 710119，China）

Effects of chem icals，such as pH，metal ions and antioxidants，on the cyclic nucleotides contentin goatmilkwere studied.The resultsshowed thatcyclic adenosinemonophosphate（cAMP）got the highest concentration at pH 3，while highest concentration of cyclic guanosine monophosphate（cGMP）wasachieved atpH 2.The contentof cAMP in goatm ilk was increased by Ca2+，Cu2+，F(xiàn)e2+，Ni2+，Mg2+，Mn2+and Zn2+，while decreased by Cd2+.The addition of Ca2+，Co2+，Mg2+and Zn2+could improve cGMP content in goatm ilk，while Fe2+and Ni2+negatively affected cGMP content.The contents of cAMP and cGMP in goatm ilk was decreased by antioxidants during first 2～4 days，but improved after 4 days.This study could provide references for the development of functionalgoatm ilk products.

cyclic nucleotides，pH values，mental ions，antioxidants

TS 252.1

A

1673—1689（2017）04—0393—07

2015-06-09

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2013BAD18B00）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201103038）；陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（2014K01-17-05）。

*通信作者：張富新（1962—），男，陜西咸陽人，教授，主要從事乳品科學(xué)研究。E-mail：fuxinzh@snnu.edu.cn

于玲玲 ，張富新，邵玉宇，等.影響羊乳中環(huán)核苷酸質(zhì)量濃度的化學(xué)因素[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（04）：393-399.