曾璇，蘇薇薇，白楊，彭維，姚宏亮

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275)

同時(shí)測(cè)定人血漿中柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度的HPLC-MS/MS方法學(xué)*

曾璇，蘇薇薇，白楊，彭維，姚宏亮

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275)

采用HPLC-MS/MS建立了同時(shí)測(cè)定人血漿中柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度的方法。以異槲皮苷為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后，以Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×30 mm，2.7 μm)為色譜柱，甲醇-水(體積比45∶55，均含φ=0.1%甲酸)為流動(dòng)相，流速為0.4 mL·min-1；采用電噴霧負(fù)離子(ESI-)、多反應(yīng)離子檢測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，用于定量分析的離子對(duì)分別為柚皮苷m/z579.1/270.8、柚皮素m/z270.9/150.7、異槲皮苷(內(nèi)標(biāo))m/z463.1/299.8。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，柚皮苷、柚皮素分別在0.251 0～100.4、0.503 0～201.2 ng·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，批間、批內(nèi)精密度均符合要求，提取回收率高。結(jié)果表明，HPLC-MS/MS法靈敏度好、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，適用于測(cè)定人血漿中柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度。

人血漿；柚皮苷；柚皮素；HPLC-MS/MS

柚皮苷是本團(tuán)隊(duì)研發(fā)的原創(chuàng)化學(xué)一類(lèi)新藥[1]，具有很好的止咳[2]、化痰[3]及抗炎[4-5]作用，已獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的藥物臨床試驗(yàn)批件，柚皮素是柚皮苷進(jìn)入體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物[6]。目前已報(bào)道的測(cè)定人血漿中柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度的方法，存在定量下限高、提取回收率低、樣品處理復(fù)雜等問(wèn)題[7-9]。筆者通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相組成及比例、改進(jìn)內(nèi)標(biāo)選擇和樣品處理方法，建立了一種定量下限低、提取回收率高、樣品處理簡(jiǎn)單的能夠同時(shí)測(cè)定人血漿中柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度的方法，符合2015版《中國(guó)藥典》四部“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”要求，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1200SL HPLC-6410 QQQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；Centrifuge 5415R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國(guó)Scientific Industries公司)；Simplicity超純水器(美國(guó)Millipore公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP211D 電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；EYELA MG-2200型氮吹儀(日本東京理化器械株式會(huì)社)；移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

柚皮苷(供含量測(cè)定用，批號(hào)：110722-201312)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，柚皮素(純度99.5%，批號(hào)：038K1039)及異槲皮苷(純度90.5%，批號(hào)：BCBL9721V)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

甲醇(LC/MS級(jí)，F(xiàn)isher Scientific公司)、乙酸乙酯(色譜級(jí)，B&J公司)、甲酸(MS級(jí)，F(xiàn)luka公司)、β-葡萄糖醛酸酶(Type H-1，Sigma-Aldrich公司)，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×30 mm，2.7 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(45∶55，均含φ=0.1%甲酸)，流速為0.4 mL·min-1，柱溫為40 ℃。

離子源參數(shù)：Capillary 4 000 V，Drying Gas 10 L·min-1，Neb Pressure 25 psi，Gas Temp 350 ℃。采用電噴霧負(fù)離子(ESI-)、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)，定量離子對(duì)及相應(yīng)參數(shù)如下：柚皮苷m/z579.1/270.8，F(xiàn)ragmentor 225 V，Collision Energy 33 V；柚皮素m/z270.9/150.7，F(xiàn)ragmentor 100 V，Collision Energy 12 V；異槲皮苷(內(nèi)標(biāo))m/z463.1/299.8，F(xiàn)ragmentor 128 V，Collision Energy 24 V。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 分別精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒量的柚皮苷、柚皮素對(duì)照品適量，置于2個(gè)10 mL量瓶中，用甲醇溶解，φ=45%甲醇水定容，分別制成柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的校正標(biāo)樣儲(chǔ)備液。另各平行一份制成質(zhì)控樣品儲(chǔ)備液。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱(chēng)取五氧化二磷減壓干燥至恒量的異槲皮苷對(duì)照品適量，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解，φ=45%甲醇水定容，制成異槲皮苷質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用φ=45%甲醇水將儲(chǔ)備液稀釋至1 μg·mL-1，作為內(nèi)標(biāo)工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 β-葡萄糖醛酸酶溶液的配制 精密稱(chēng)取β-葡萄糖醛酸酶適量，用0.2 mmol·L-1醋酸緩沖液(pH=5.0)溶解，制成10 unit·μL-1的β-葡萄糖醛酸酶溶液。

2.3 校正標(biāo)樣及質(zhì)控樣品的制備

2.3.1 血漿校正標(biāo)樣的制備 分別取柚皮苷、柚皮素校正標(biāo)樣儲(chǔ)備液適量，置10 mL量瓶中，用φ=45%甲醇水稀釋成柚皮苷質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、120、200、500、1 000、1 500和2 000 ng·mL-1，柚皮素質(zhì)量濃度分別為10、20、40、100、240、400、1 000、2 000、3 000和4 000 ng·mL-1的校正標(biāo)樣工作液。取空白血漿200 μL，然后分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的校正標(biāo)樣工作液10 μL，制成柚皮苷質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、6、10、25、50、75和100 ng·mL-1，柚皮素質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、12、20、50、100、150和200 ng·mL-1的血漿校正標(biāo)樣。

2.3.2 血漿質(zhì)控樣品的制備 分別取柚皮苷、柚皮素質(zhì)控樣品儲(chǔ)備液適量，置10 mL量瓶中，用φ=45%甲醇水稀釋成柚皮苷質(zhì)量濃度分別為10、120、500、1 500 ng·mL-1，柚皮素質(zhì)量濃度分別為20、240、1 000和3 000 ng·mL-1的質(zhì)控樣品工作液。取空白血漿200 μL，然后分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品工作液10 μL，制成柚皮苷質(zhì)量濃度分別為0.5、6、25和75 ng·mL-1，柚皮素質(zhì)量濃度分別為1、12、50和150 ng·mL-1的血漿質(zhì)控樣品。

2.4 血漿樣品的處理

取血漿樣品200 μL，加入φ=45%甲醇水10 μL，然后加入β-葡萄糖醛酸酶溶液20 μL(10 Unit·μL-1)，混勻，37 ℃水浴2 h。取出后，加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，混勻，再加入φ=2%甲酸水溶液12 μL酸化，混勻后加入乙酸乙酯2 000 μL，渦旋1 min，10 000 r·min-1離心10 min(4 ℃)，轉(zhuǎn)移上清，氮?dú)獯蹈伞Ｈ缓蠹尤?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，超聲5 min，渦旋5 min，13 000 r·min-1離心45 min(20 ℃)，取上清液10 μL進(jìn)樣。

2.5 方法專(zhuān)屬性

取6名臨床健康受試者的空白血漿200 μL，除不加內(nèi)標(biāo)工作液外，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，得空白血漿樣品色譜圖(圖1：A-F)；按“2.3.2”項(xiàng)操作得柚皮苷質(zhì)量濃度為6 ng·mL-1、柚皮素質(zhì)量濃度為12 ng·mL-1的血漿質(zhì)控樣品，然后按“2.4”項(xiàng)下方法操作，得質(zhì)控血漿樣品色譜圖(圖1：G)；取健康受試者口服柚皮苷后采集的血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，得給藥后血漿樣品色譜圖(圖1：H)。結(jié)果表明：在目標(biāo)成分柚皮苷、柚皮素及內(nèi)標(biāo)異槲皮苷的保留時(shí)間處無(wú)雜質(zhì)干擾；目標(biāo)成分柚皮苷、柚皮素及內(nèi)標(biāo)異槲皮苷之間亦無(wú)干擾。

2.6 殘留效應(yīng)

通過(guò)在注射柚皮苷質(zhì)量濃度為75 ng·mL-1、柚皮素質(zhì)量濃度為150 ng·mL-1的高質(zhì)量濃度血漿質(zhì)控樣品后，注射空白樣品來(lái)估計(jì)殘留。結(jié)果表明：空白樣品中未檢出目標(biāo)成分柚皮苷、柚皮素及內(nèi)標(biāo)異槲皮苷，無(wú)殘留效應(yīng)。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍與定量下限

按“2.3.1”項(xiàng)操作得血漿校正標(biāo)樣，然后按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。采用最小二次加權(quán)法，以目標(biāo)成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)Y、目標(biāo)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程如下：

Y1=2.882 8X1+ 0.002 8(柚皮苷)，

r=0.995 8；

Y2=4.577 3X2+0.008 4(柚皮素)，

r=0.998 0

結(jié)果表明：柚皮苷在0.25～100 ng·mL-1、柚皮素在0.5～200 ng·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；柚皮苷、柚皮素的定量下限分別為0.25、0.5 ng·mL-1。

2.8 方法的精密度與準(zhǔn)確度

按“2.3”項(xiàng)操作得定量下限樣品、血漿質(zhì)控樣品，然后按“2.4”項(xiàng)下方法處理。取定量下限樣品、血漿質(zhì)控樣品上清液10 μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算批間精密度、準(zhǔn)確度。結(jié)果表明：柚皮苷和柚皮素的精密度(批內(nèi)、批間)和準(zhǔn)確度均符合生物樣品測(cè)定的要求(見(jiàn)表1、表2)。

表1 方法的精密度與準(zhǔn)確度(柚皮苷)Table 1 Precision and accuracy of the assay method (naringin)

表2 方法的精密度與準(zhǔn)確度(柚皮素)Table 2 Precision and accuracy of the assay method (naringenin)

2.9 提取回收率

取空白血漿200 μL，除不加內(nèi)標(biāo)工作液外，按“2.4”項(xiàng)下方法處理。復(fù)溶時(shí)加入φ=45%甲醇水180 μL，然后分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品工作液10 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，超聲5 min，渦旋5 min，13 000 r·min-1離心45 min(20 ℃)，制得SAE樣品。

分別測(cè)定對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的SAE樣品、血漿質(zhì)控樣品，計(jì)算提取回收率：

圖1 人血漿中柚皮苷、柚皮素及異槲皮苷的提取離子流色譜圖A-F：6個(gè)不同來(lái)源空白血漿；G：空白血漿+柚皮苷+柚皮素；H：受試者給藥后2 h血漿樣品Fig.1 Chromatograms of naringin, naringenin and isoquercitrin in human plasmaA-F：Blank plasma samples from six different origins; G：Blank plasma + naringin + naringenin; H：Plasma sample of subject at 2 h post dose

式中，(A目標(biāo)成分/A內(nèi)標(biāo))QC是指血漿質(zhì)控樣品的目標(biāo)成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，(A目標(biāo)成分/A內(nèi)標(biāo))SAE是指SAE樣品的目標(biāo)成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比。柚皮苷、柚皮素提取回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10 基質(zhì)效應(yīng)

本研究采用6名臨床健康受試者的空白血漿，考察了柚皮苷、柚皮素在低質(zhì)量濃度(柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度分別為0.5、1 ng·mL-1)、高質(zhì)量濃度(柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度分別為75、150 ng·mL-1)水平下的基質(zhì)效應(yīng)。

取φ=45%甲醇水180 μL，分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品工作液10 μL，再加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，混勻，制成低、高質(zhì)量濃度的Sol樣品。

分別測(cè)定對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的SAE樣品、Sol樣品，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：

式中，(A目標(biāo)成分/A內(nèi)標(biāo))SAE是指SAE樣品的目標(biāo)成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，(A目標(biāo)成分/A內(nèi)標(biāo))Sol是指Sol樣品的目標(biāo)成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比。柚皮苷和柚皮素在低、高質(zhì)量濃度水平下的基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表4，其RSD均小于15%，符合生物樣品測(cè)定的要求。

表3 方法的提取回收率(n=3)Table 3 Recoveries of the assay method (n=3)

表4 方法的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)Table 4 Matrix effects of the assay method (n=3) /%

2.11 稀釋可靠性與穩(wěn)定性試驗(yàn)

按表5所列的考察項(xiàng)目，逐項(xiàng)試驗(yàn)，結(jié)果表明：該方法的稀釋可靠性與穩(wěn)定性均符合生物樣品測(cè)定的要求。

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本研究考察了流動(dòng)相組成、比例及流速對(duì)目標(biāo)成分及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)大小、分離情況、峰型的影響。結(jié)果表明：以甲醇-水(45∶55，均含φ=0.1%甲酸)為流動(dòng)相，流速為0.4 mL·min-1時(shí)，測(cè)試效果最佳。

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

橙皮苷、黃芩苷、異槲皮苷與柚皮苷、柚皮素結(jié)構(gòu)相似，故選取上述3個(gè)化合物作為候選內(nèi)標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果表明：橙皮苷在空白血漿中有較大干擾；黃芩苷在揮干過(guò)程中易降解；而異槲皮苷空白干擾小，提取回收率穩(wěn)定，基質(zhì)效應(yīng)影響??；故本研究選取異槲皮苷作為目標(biāo)成分柚皮苷、柚皮素的內(nèi)標(biāo)。

3.3 樣品處理方法的優(yōu)化

本研究以10倍體積乙酸乙酯對(duì)血漿樣品進(jìn)行1次萃取，在有機(jī)相揮干后加入與血漿樣品相同體積的流動(dòng)相進(jìn)行復(fù)溶，基質(zhì)干擾小，提取回收率高。試驗(yàn)表明：與乙腈蛋白沉淀法相比，乙酸乙酯萃取法具有基質(zhì)干擾小、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)；乙酸乙酯體積增大對(duì)提取回收率的提高貢獻(xiàn)不大，而萃取次數(shù)增多以及濃縮則會(huì)造成基質(zhì)干擾變大、重現(xiàn)性降低。

3.4 β-葡萄糖醛酸酶孵育

柚皮苷在體內(nèi)主要轉(zhuǎn)化成苷元柚皮素，柚皮素經(jīng)Ⅱ相代謝反應(yīng)生成其在血漿中的主要代謝產(chǎn)物柚皮素-葡萄糖醛酸化/硫酸化結(jié)合物[6, 10]。藥理研究表明，柚皮苷、柚皮素均具有顯著療效[11]，因此同時(shí)測(cè)定兩者在血漿中的質(zhì)量濃度很有必要。本研究通過(guò)β-葡萄糖醛酸酶孵育來(lái)游離結(jié)合態(tài)的柚皮素，達(dá)到同時(shí)測(cè)定人血漿樣品中柚皮苷、柚皮素質(zhì)量濃度的目的。

表5 血漿樣品的稀釋可靠性與穩(wěn)定性RSD /%(n=3)Table 5 RSD results of dilute reliability and stability in spiked samples/% (n=3)

3.5 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定人血漿中柚皮苷、柚皮素的HPLC-MS/MS方法，采用一步液液萃取法處理血漿樣品，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度好、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、提取回收率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于人體藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)中柚皮苷、柚皮素血漿質(zhì)量濃度的測(cè)定。

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HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of naringin and naringenin in human plasma

ZENGXuan,SUWeiwei,BAIYang,PENGWei,YAOHongliang

(School of Life Sciences, Sun Yat-sen University; Guangdong Engineering & Technology Research Center for Quality and Efficacy Re-evaluation of Post-market Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510275, China)

The aim of the study was to establish an HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of naringin and naringenin in human plasma. Naringin and naringenin were extracted from plasma by ethyl acetate, then determined by HPLC-MS/MS taking isoquercitrin as internal standard (IS). Chromatographic separation was carried out on a Agilent Poroshell 120 EC-C18column (3.0 mm×30 mm，2.7 μm). The mobile phase was composed of solvent A (0.1% formic acid,V/V) and B (methanol with 0.1% formic acid,V/V). The flow rate was 0.4 mL·min-1. Electrospray ionization (ESI) source was applied and operated in multiple reaction monitoring (MRM) mode with the transitions ofm/z579.1/270.8,m/z270.9/150.7,m/z463.1/299.8 for naringin, naringenin and IS, respectively. The method was validated over the concentration range of 0.251 0～100.4 ng·mL-1for naringin, and 0.503 0～201.2 ng·mL-1for naringenin, respectively. The intra- and inter-run precisions were within the acceptable range, and the extraction recoveries were satisfactory. The established method is highly sensitive, accurate and reproducible, which can be applied for the simultaneous determination of naringin and naringenin in human plasma.

human plasma; naringin; naringenin; HPLC-MS/MS

2016-05-05 基金項(xiàng)目：國(guó)家"重大新藥創(chuàng)制"科技重大專(zhuān)項(xiàng)課題(2015ZX09101014)；廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015B020234004)

曾璇(1993年生)，男；研究方向：人體藥代動(dòng)力學(xué)；E-mail：zengx6@qq.con

姚宏亮(1988年生)，男；研究方向：創(chuàng)新藥物的研究開(kāi)發(fā)；E-mail：yhlsysu@126.com

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.01.020

R965

A

0529-6579(2017)01-0125-06