董攀，羅澤欣，王冬梅

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

雞血藤原花青素的提取工藝和體外抗氧化活性*

董攀，羅澤欣，王冬梅

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法優(yōu)化雞血藤SpatholobussuberectusDunn 原花青素的超聲波輔助提取工藝。以料液比、丙酮體積分數(shù)、提取時間為考察因素，以原花青素的提取率為響應(yīng)因子，進行Box-behnken中心組合試驗，得到最佳提取工藝參數(shù)為：室溫下，超聲功率500 W，提取時間30 min，料液比1∶45 (m/V)，丙酮體積分數(shù)70%，提取1次。在此條件下,雞血藤原花青素提取得率為25.59%。制得的原花青素對DPPH·、ABTS·的IC50分別為8.42,10.55 μg/mL。

雞血藤SpatholobussuberectusDunn；原花青素；響應(yīng)面法；抗氧化活性

原花青素(proanthocyanidins，PC)是由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素結(jié)合而成的一大類多酚類化合物，其基本組成單位是黃烷-3-醇和黃烷-3,4-二醇，其具有廣泛的藥理作用，是一種極佳的氧自由基清除劑，具有抗炎[1]、抗氧化應(yīng)激[2]、抗腫瘤[3]、改善記憶力[4]和防治肝損傷[5]等功能,且毒性很低[6]，目前在食品、保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用[7]。

雞血藤為豆科植物密花豆屬密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖。雞血藤又名大血藤、血藤、血風(fēng)藤、三葉雞血藤，是補血活血的傳統(tǒng)中藥。研究表明，雞血藤乙醇提取物對MCF-7和結(jié)腸癌HT-29細胞增殖表現(xiàn)出不同抑制活性，其中富含原花青素的正丁醇萃取物活性最強，故認為其中的原花青素成分在抗腫瘤過程中發(fā)揮了重要作用[8]；雞血藤中的原花青素B4可抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖[9]。同時，雞血藤對于乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞移植的裸鼠有抑制作用，其中兒茶素、表兒茶素沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素等多酚化合物為重要的藥效物質(zhì)[10]。

雞血藤原花青素含量很高，其φ=60%乙醇提取浸膏中原花青素的含量可達51%[8]。而目前無人對雞血藤原花青素的提取工藝進行相關(guān)研究，因此，本文擬研究超聲波輔助提取雞血藤原花青素的工藝，對于主要提取工藝參數(shù)進行響應(yīng)面法優(yōu)化，采用本課題組前期已建立的香草醛-硫酸法[11]測定提取液中原花青素的含量并計算原花青素提取得率。本論文研究建立的提取工藝、以及采用DPPH法、ABTS法考察雞血藤原花青素的體外抗氧化活性，可為雞血藤原花青素的廣泛開發(fā)利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

雞血藤藥材，產(chǎn)地廣西，于2015年購于廣州市清平藥材市場，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥化實驗室楊得坡教授鑒定為豆科密花豆屬植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的藤莖；兒茶素對照品，購于廣東省食品藥品檢驗所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)與2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)購自美國sigma公司；香草醛(分析純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇、硫酸、丙酮、乙醇均為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠

Millipore超純水系統(tǒng)；多功能酶標儀工作站，美國Moleculardevices公司；超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份公司

1.2 方法

1.2.1 材料制備 將雞血藤藥材粉碎后過60目藥篩，放入冰箱保存。

1.2.2 提取液中原花青素含量的測定

1) 對照品溶液的制備

精密稱取兒茶素20 mg, 用少量甲醇溶解后置20 mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液(1 mg/mL)。

2) 標準曲線的繪制

精密量取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，精密量取5.0 mL各濃度兒茶素對照品溶液、3 mLφ=3% 香草醛甲醇溶液和3mLφ=30% 硫酸甲醇溶液置包有錫箔的試管中，搖勻，25 ℃避光顯色20min后，取100μL于96孔板上，在500nm處測定吸光度A500，得到回歸方程為

y=1.598 8x+0.032 8，R=0.999 0

線性范圍為0.1 ～0.5 mg/mL。

3)原花青素的提取及在提取液中的含量測定

準確稱取200 mg雞血藤粉末，加入φ=70%丙酮8mL，500W超聲提取30min，抽濾，定容至100mL容量瓶，搖勻，得原花青素提取液。取5mL提取液按上述測定方法進行比色，再以所得的曲線回歸方程計算原花青素提取得率。

1.2.3 實驗設(shè)計方法 通過單因素考察，篩選出料液比([m(藥材原料)/g]∶[V(提取溶劑)/mL])、提取時間、提取溶劑體積分數(shù)等對雞血藤原花青素提取得率影響較大的三個因素，進行接下來的Box-behnken中心組合試驗設(shè)計(見表1)。

表1 Box-behnken設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-behnken design

1.2.4 DPPH·清除率的測定 測定方法參考文獻[12]，精密稱取DPPH，用無水乙醇溶液溶解并定容于棕色容量瓶中，配制濃度為20 μmol/L，避光保存。將原花青素提取物冷凍干燥后，精密稱取，用無水乙醇配制成5種不同質(zhì)量濃度(1，2，4，8，16 μg/mL)的樣品溶液。分別加入1.0 mL DPPH溶液，2.0 mL樣品溶液，混合避光反應(yīng)30 min， 517 nm處測定各樣品的吸光度值A(chǔ)1。無水乙醇代替DPPH乙醇溶液作為樣品本底組，吸光度記為A2，無水乙醇代替樣品溶液作為空白組，吸光度記為A01，VC為陽性對照，清除率計算公式：

DPPH·清除率

1.2.5ABTS·清除率的測定 測定方法在文獻[13] 基礎(chǔ)上稍作修改，將濃度為7mmol/LABTS無水乙醇溶液與2.45mmol/L過硫酸鉀等量混合，避光放置15h，加入無水乙醇，以期于734nm獲得0.70±0.02的吸收值。將原花青素提取物冷凍干燥后，精密稱取，用無水乙醇配制成5種不同質(zhì)量濃度(1，2，4，8，16μg/mL)的樣品溶液。分別加入2.0mLABTS溶液，1.0mL樣品溶液，混合避光反應(yīng)10min， 732nm處測定各樣品的吸光度值A(chǔ)3。無水乙醇代替ABTS乙醇溶液作為樣品本底組，吸光度記為A4，無水乙醇代替樣品溶液作為空白組，吸光度記為A02，VC為陽性對照，清除率計算公式：

ABTS·清除率

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 不同體積分數(shù)溶劑對原花青素提取得率的影響 以不同體積分數(shù)的乙醇、甲醇、丙酮作為提取溶劑，其他參數(shù)同1.2.2，2)，結(jié)果見圖1(a)。從圖中可以看出，φ=70%丙酮對雞血藤原花青素的提取率最高，因此選擇φ=70%丙酮作為提取溶劑。

2.1.2 料液比對雞血藤原花青素提取得率的影響 設(shè)置不同的料液比,其他參數(shù)同1.2.2，2)，結(jié)果見圖1(b)。在料液比為1∶40 時，原花青素提取率達到峰值，而后略微減少,故選定料液比為1∶40。

2.1.3 提取時間對原花青素提取得率的影響 設(shè)置不同的提取時間，其他參數(shù)同1.2.2, 2)，結(jié)果見圖1(c)。雞血藤的原花青素的提取得率在30min左右達到峰值，而后逐漸減少，可能與提取時間過長后原花青素被氧化有關(guān)。因此，選擇超聲輔助提取時間30min。

2.1.4 超聲功率對原花青素提取得率的影響 設(shè)置不同的超聲提取功率，其他參數(shù)同1.2.2, 2)。結(jié)果見圖1(d)。原花青素提取率隨超聲功率增大而增加，故選定500W進行其他單因素試驗。

2.1.5 提取次數(shù)對原花青素提取得率的影響 設(shè)置不同的提取次數(shù)，其他參數(shù)同1.2.2, 2)。結(jié)果見圖1(e)。原花青素的提取得率隨提取次數(shù)的增加有一定提高，提取2次的提取得率是提取1次的1.1倍，提取2次后得率的變化不顯著，考慮到提取成本，選定提取次數(shù)為1次。

2.2 響應(yīng)面法設(shè)計及結(jié)果

2.2.1 提取工藝參數(shù)的單因素考察 以φ=70%丙酮，料液比[m(藥材原料)/g] ∶[V(提取溶劑)]為1∶40，超聲輔助提取30 min時雞血藤原花青素有較大的提取率。雞血藤原花青素提取的響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2，基于Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，根據(jù)表1結(jié)果對丙酮體積分數(shù)、料液比、提取時間作變換，將原花青素提取率作為響應(yīng)值(Y)，設(shè)置17個試驗點。

圖1 溶劑體積分數(shù)(a)、料液比(b)、提取時間(c)、超聲功率(d)、提取次數(shù)(e)對雞血藤原花青素提取率的影響Fig.1 Effects of solvent concentration(a),solid liquid ratio(b),extraction time(c), ultrasonic power (d) and extraction times (e) on the extraction yield of PC

表2 原花青素提取得率試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis for the optimization of extraction conditions of PC

將所得雞血藤原花青素提取得率數(shù)據(jù)通過Design Expert 8.06軟件進行回歸擬合分析，得到回歸方程如下：

Y=-113.642+1.473X1+2.177X2+1.801X3-2×10-3X1X2-6.875×10-3X1X3-3.125×10-3X2X3-

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)模型的響應(yīng)面與等高線圖(圖2)，可以看出各因素對響應(yīng)值的影響，由圖可知，提取時間對提取率的影響較大，圖b1、c1表現(xiàn)為較陡的曲面。其中料液比與提取時間，提取時間與料液比交互作用較為明顯，等高線因而呈橢圓形。

2.2.4 最優(yōu)提取工藝參數(shù) 使用Design Expert 8.06軟件求解回歸方程，得到最佳提取工藝參數(shù)如下：料液比1∶44.72，提取溶劑為φ=71.19%丙酮，提取時間31.29min，雞血藤原花青素在該條件下的理論提取率為25.62%。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of regression analysis

圖2 料液比(X1)與丙酮體積分數(shù)(X2)、料液比(X1)與提取時間(X3)以及丙酮體積分數(shù)(X2)與提取時間(X3)交互作用響應(yīng)面圖(a1、b1、c1)與等高線圖(a2、b2、c2)Fig.2 Responsive surface plots (a1、b1、c1) and contour plots (a2、b2、c2) showing the mutual effects of ratio of solid liquid (X1) and acetone concentration (X2) , ratio of solid liquid (X1) and extraction time (X3), acetone concentration(X2) and extraction time (X3) on the yield of PC

2.2.5 試驗?zāi)Ｐ偷尿炞C和比較 對模型得出的最優(yōu)提取工藝參數(shù)進行試驗驗證?？紤]到實際操作的可行性，對工藝參數(shù)進行了微調(diào)，料液比1∶45，φ=70%丙酮，室溫提取30min，在該條件下進行了3批提取試驗，雞血藤原花青素實際提取得率分別為25.57%，25.58%，25.62%，符合理論提取得率數(shù)據(jù)，也證明了該模型用于預(yù)測與分析原花青素提取工藝參數(shù)的可靠性

圖3 雞血藤原花青素及VC對DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging effects of PC on DPPH·

2.3DPPH·/ABTS·清除率測定結(jié)果

由圖3、圖4可知，雞血藤原花青素抗氧化能力與濃度呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，其清除DPPH·的IC50為8.42μg/mL，陽性對照VC為4.91μg/mL；清除ABTS·的IC50約為10.55μg/mL，陽性對照VC為8.42μg/mL， 雞血藤原花青素粗提物抗氧化效果與VC接近。

圖4 雞血藤原花青素及VC對ABTS·的清除作用Fig.4 Scavenging effects of PC on ABTS·

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助提取技術(shù)對雞血藤原花青素進行提取，通過單因素試驗和Box-behnken試驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析對超聲波提取工藝進行優(yōu)化，得出較優(yōu)工藝條件為室溫條件下，超聲功率500W、超聲時間30min、料液比1∶45、φ=70%丙酮，室溫下提取1次，在此工藝下，原花青素提取率為25.59%，并得到原花青素總提取率與超聲波處理各因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合良好。提取得到的雞血藤原花青素對DPPH·、ABTS·清除率的IC50分別為8.42 和10.55μg/mL，抗氧化活性接近于VC。該研究可對雞血藤原花青素的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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Extraction and antioxidant activity of Proanthocyanidins fromSpatholobussuberectusDunn

DONGPan，LUOZexin，WANGDongmei

(School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006，China)

Ultrasonic-assisted extraction (UAE) was used to extract proanthocyanidins (PC) fromSpatholobussuberectusDunn. Response surface methodology (RSM), based on a three-factor, three-level Box-Behnken central composite design (BBD), was employed to obtain the optimal extraction parameters, in which the extraction yields of PC was maximum. Three important factors, including extraction time, solid-liquid ratio and acetone concentration, were selected by single-factor tests. Optimized extraction conditions for PC were a ratio of liquid to solid of 1∶45 mL/g, 25 ℃, 30 min, and acetone concentration as 70%, one-time extraction, 500 W ultrasonic power. Under these conditions，the extraction yield of PC was 25.58%. In DPPH· and ABTS· scavenging assays, the IC50of PC fromS.suberectuswere 8.42 μg/mL and 10.55 μg/mL, respectively.

SpatholobussuberectusDunn; proanthocyanidins; response surface methodology ; antioxidant activity

2016-08-15 基金項目：廣東省自然科學(xué)基金(2016A030313855)；廣東省省部產(chǎn)學(xué)研合作專項資金(2013B090500100)

董攀(1992年生)，男；研究方向：天然產(chǎn)物活性成分；E-mail:448415288@qq.con

王冬梅(1968年生)，女；研究方向：中藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制;E-mail:lsswdm@mail.sysu.edu.cn

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.01.002

R962

A

0529-6579(2017)01-0008-06