李舒麗 楊鈺琪 張偉剛 朱冠男 高天文 李春英

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·論著·

XBP1在白癜風(fēng)皮損及應(yīng)激HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)

李舒麗 楊鈺琪 張偉剛 朱冠男 高天文 李春英

目的： 檢測(cè)XBP1在白癜風(fēng)皮損組織及H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)。方法： H2O2處理體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞。Real time PCR檢測(cè)白癜風(fēng)皮損中及應(yīng)激HaCaT細(xì)胞中XBP1的表達(dá)；ELISA檢測(cè)應(yīng)激HaCaT細(xì)胞中特異性抑制劑抑制XBP1活化前后IL-6和IL-8的表達(dá)。結(jié)果： 白癜風(fēng)皮損和應(yīng)激HaCaT細(xì)胞中XBP1 mRNA顯著高于正常對(duì)照；應(yīng)激HaCaT細(xì)胞中IL-6和IL-8水平高于空白對(duì)照組，抑制XBP1活化后兩者分泌減少。結(jié)論： XBP1在白癜風(fēng)皮損組織中顯著上調(diào)，促進(jìn)應(yīng)激的HaCaT細(xì)胞分泌IL-6、IL-8。

XBP1； 角質(zhì)形成細(xì)胞； 白癜風(fēng)

白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，我們及國(guó)外多項(xiàng)研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在啟動(dòng)白癜風(fēng)自身免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白蓄積，引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。UPR主要表現(xiàn)為激活PERK-eIF2α，IRE1α-XBP1，ATF6三條信號(hào)通路，最終減輕或中止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[1]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)遺傳學(xué)研究表明XBP1基因多態(tài)性顯著增加白癜風(fēng)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2,3]，但機(jī)制不清。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生UPR時(shí)IRE1α激活，能從XBP1 mRNA中特異剪切26個(gè)堿基的內(nèi)含子，改變XBP1 mRNA閱讀框，其翻譯產(chǎn)物XBP1-s(活化型XBP1)可作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控UPR下游靶基因及多種細(xì)胞因子的表達(dá)，參與疾病發(fā)生及進(jìn)展[4]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激條件下，黑素細(xì)胞中XBP1表達(dá)活化促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，參與白癜風(fēng)發(fā)病[5]。事實(shí)上，白癜風(fēng)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞也存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷[6,7]，基于其在表皮分布的數(shù)量及其產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的能力，我們推測(cè)其在白癜風(fēng)局部免疫微環(huán)境中也發(fā)揮重要作用。因此，本課題旨在明確XBP1在白癜風(fēng)組織及應(yīng)激角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步研究其對(duì)白癜風(fēng)局部免疫微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 HaCaT細(xì)胞系本室常規(guī)保存，1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。兔抗人XBP1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗人XBP1-s抗體購(gòu)自Protein Teq公司，鼠抗人β-actin 單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技公司。水楊酸(SA)、雷帕霉素(RA)購(gòu)自Sigma公司。IL-6、IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本的收集與保存 收集6例進(jìn)展期白癜風(fēng)患者皮損組織樣本，所有入選患者未伴發(fā)其他自身免疫性疾病且局部皮損無(wú)感染，患者皮損標(biāo)本均于我科皮膚病理中心采用皮膚活檢的方法切取約1.0 cm×0.5 cm全層皮組織，健康皮膚對(duì)照組織來(lái)源于西京醫(yī)院整形科接受美容手術(shù)的非曝光部位正常全層皮組織。所有入組患者及對(duì)照均簽署知情同意并得到第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。所有樣本于液氮中凍存待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)及處理 HaCaT使用含10% FBS的1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%融合時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基，16 h后予以0.5 mM H2O2處理24 h，收集細(xì)胞裂解液及上清用于后續(xù)檢測(cè)；為了抑制XBP1活化，采用其特異性抑制劑水楊酸(RA)[8]及雷帕霉素(RA)[9]預(yù)處理，即對(duì)HaCaT細(xì)胞予以SA(100 μM)、RA(100 nM)預(yù)處理6 h，對(duì)照組予以DMSO處理，之后予以0.5 mM H2O2處理24 h，收集細(xì)胞裂解液及上清用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè) Trizol試劑提取組織及細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，以β-actin表達(dá)量為內(nèi)參照，采取2-△△CT方法計(jì)算各基因表達(dá)變化的相對(duì)倍數(shù)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子引物設(shè)計(jì)如下：PERK：正向引物5'-GGAAACGAGAGCCGGATTTATT-3'及反向引物5'-ACTATGTCCATTATGGCAGCTTC-3'；IRE1α：正向引物5'-CACAGTGACGCTTCCTGAAAC-3'及反向引物5'-GCCATCATTAGGATCTGGGAGA-3'；ATF6：正向引物5'-TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA-3'及反向引物5'-CTTGGGCTGAATTGAAGGTTTTG-3'；eIF2α：正向引物5'-CCGCTCTTGACAGTCCGAG-3'及反向引物：5'-GCAGTAGTCCCTTGTTAGTGACA-3'；XBP1：正向引物5'-TATCCTGTTGGGCATTCTGGAC-3'及反向引物：5'-AGAAAGGGAGGCTGGTAAGGA-3'；XBP1-s：正向引物5'-GCTGAGTCCGCAGCAGG-3'及反向引物5'-GTCCAGAATGCCCAACAGGA-3'。

1.2.4 XBP1活化檢測(cè)：提取細(xì)胞總RNA，采用PCR擴(kuò)增獲得XBP1 mRNA產(chǎn)物，XBP1引物序列為：正向引物5'-CTGAAAAACAGAGTAGCAGCTCA-3'及反向引物5'-TGGGTAGACCTCTGGGAGCTCCT-3'。由于XBP1比活化型XBP1-s多26個(gè)堿基，該26個(gè)堿基序列上含有Apa-LI特異酶切位點(diǎn)，因此對(duì)擴(kuò)增的XBP1 mRNA進(jìn)行酶切反應(yīng)，所得產(chǎn)物凝膠電泳，非活化型XBP1則被酶切為兩個(gè)片段，分別為278 bp和195 bp，而活化型XBP1(XBP1-s)則為447 bp大小的一個(gè)片段。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 收集實(shí)驗(yàn)處理組及對(duì)照組HaCaT細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白含量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)。PVDF膜經(jīng)甲醇激活后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用TBST稀釋的5%脫脂奶粉室溫封閉1～4 h，予XBP1、XBP1-s及β-actin等一抗4℃孵育過(guò)夜。次日予以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育50 min。使用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6 ELISA檢測(cè) 收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)IL-6、IL-8分泌水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間檢驗(yàn)采用one-way anova檢驗(yàn)法，各組數(shù)據(jù)兩兩比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白癜風(fēng)皮損組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)情況 采用Real-time PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子PERK、eIF2α、ATF6、IRE1α、XBP1、活化型XBP1(XBP1-s) mRNA表達(dá)變化。結(jié)果顯示，白癜風(fēng)皮損周ATF6表達(dá)下降，PERK、eIF2α、IRE1α、XBP1 mRNA表達(dá)水平均升高，但以XBP1及XBP1-s上調(diào)最顯著，分別為13.36±2.10倍和7.63±1.03倍(圖1)。

2.2 H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞XBP1及細(xì)胞因子IL-6、IL-8表達(dá)分泌情況 以H2O2處理HaCaT細(xì)胞24 h后，Real-time PCR結(jié)果顯示XBP1及XBP1-s分別上調(diào)14.84±3.26倍和13.32±2.71倍(圖2a)，進(jìn)一步Western blot檢測(cè)確定XBP1及其活化型XBP1-s表達(dá)也升高(圖2b)；采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-8的水平，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后，HaCaT細(xì)胞分泌的IL-6由(28.75±5.40)pg/mL上調(diào)至(63.50±8.99)pg/mL，IL-8由(46.47±5.65)pg/mL上調(diào)至(294.4±15.25)pg/mL(圖2c、d)。以上研究提示，應(yīng)激的角質(zhì)形成細(xì)胞中，XBP1表達(dá)升高且其活性增強(qiáng)，并可促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6、IL-8的分泌。

2.3 抑制XBP1活化對(duì)H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞分泌IL-6、IL-8的影響 我們?cè)贖aCaT細(xì)胞接受H2O2處理前，使用XBP1活化的特異性抑制劑預(yù)處理6 h發(fā)現(xiàn)水楊酸SA及雷帕霉素RA預(yù)處理均可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的XBP1活化(圖3a)，且能顯著抑制H2O2對(duì)IL-6、IL-8的誘導(dǎo)效應(yīng)(圖3b、c)。以上結(jié)果提示XBP1活化是促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-8的關(guān)鍵。

圖1 白癜風(fēng)皮損周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子表達(dá)水平變化(n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

圖2 a:H2O2處理HaCaT細(xì)胞后XBP1 mRNA及XBP1-s mRNA水平(n=4，***P<0.001)；b:蛋白表達(dá)活化水平；c:細(xì)胞因子IL-6分泌水平(n=4，*P<0.05);d:IL-8(n=4，***P<0.001)分泌水平

圖3 a:XBP1活化抑制劑SA、RA的抑制效率;b、c：SA、RA對(duì)H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞分泌IL-6(n=4，*P<0.05，**P<0.01)和IL-8(n=4，**P<0.01，***P<0.001)的影響

3 討論

大量研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是白癜風(fēng)發(fā)病的重要原因，其引起的T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)是表皮黑素細(xì)胞破壞的關(guān)鍵效應(yīng)環(huán)節(jié)[10]，然而氧化應(yīng)激啟動(dòng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的具體機(jī)制尚不完全清楚。近年來(lái)有學(xué)者提出，氧化應(yīng)激可播散至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)UPR，適度的UPR維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生存；而過(guò)度激活的UPR促進(jìn)下游一系列炎癥因子、趨化因子的表達(dá)及分泌，導(dǎo)致局部免疫微環(huán)境紊亂，參與疾病的發(fā)生發(fā)展[1,4]。以往有研究證實(shí)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有損傷，表明白癜風(fēng)表皮存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6,7]。我們通過(guò)檢測(cè)UPR的3條信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)，首次發(fā)現(xiàn)PERK-eIF2α、IRE1α-XBP1信號(hào)在白癜風(fēng)皮損組織均顯著升高，以XBP1上調(diào)最顯著。

國(guó)內(nèi)外GWAS研究表明，XBP1基因多態(tài)性與白癜風(fēng)發(fā)病密切相關(guān)[2,3]。以往有研究報(bào)道XBP1可激活MHC II類基因表達(dá)，調(diào)控漿細(xì)胞分化及炎癥因子表達(dá)，參與多種自身免疫反應(yīng)以及腫瘤免疫的調(diào)控[2]。Toosi等發(fā)現(xiàn)酚劑處理誘導(dǎo)黑素細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可激活未折疊蛋白反應(yīng)UPR，啟動(dòng)一系列炎癥因子表達(dá)[5]。除了黑素細(xì)胞，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激的角質(zhì)形成細(xì)胞也發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其標(biāo)志分子X(jué)BP1表達(dá)顯著上調(diào)，并進(jìn)一步證實(shí)XBP1活化促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞促炎介質(zhì)IL-6、IL-8的釋放。以往有研究證實(shí)IL-6可以上調(diào)黑素細(xì)胞ICAM表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞與黑素細(xì)胞的接觸，增強(qiáng)其殺傷效應(yīng)[11]。IL-8也被證實(shí)在白癜風(fēng)皮損高表達(dá)[12]，可能促進(jìn)皮損局部T細(xì)胞遷移，放大炎癥反應(yīng)。綜合以上研究我們推測(cè)，應(yīng)激的角質(zhì)形成細(xì)胞激活XBP1，促進(jìn)IL-6、IL-8的分泌，加重白癜風(fēng)局部免疫紊亂，放大炎癥反應(yīng)。此外，基于角質(zhì)形成細(xì)胞在表皮中的分布數(shù)量及其釋放炎癥因子的能力，我們推測(cè)應(yīng)激的角質(zhì)形成細(xì)胞相較于黑素細(xì)胞，在白癜風(fēng)免疫微環(huán)境中可能發(fā)揮更重要的作用。

綜上，本研究證實(shí)XBP1在白癜風(fēng)組織表達(dá)顯著上調(diào)，且證實(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下，活化XBP1信號(hào)促進(jìn)炎癥因子IL-6、IL-8的釋放。我們的研究為XBP1參與白癜風(fēng)發(fā)病提供了新的證據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)了XBP1活化在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)白癜風(fēng)異常免疫中起重要作用。

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(收稿：2016-09-07 修回：2016-11-10)

Expression of XBP1 in vitiligo lesions and stressed keratinocytes

LIShuli,YANGYuqi,ZHANGWeigang,ZHUGuannan,GAOTianwen,LIChunying.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective: To detect the expression level of XBP1 in vitiligo lesions and stressed HaCaT cells. Methods: The cultured HaCaT cells were treated by H2O2. The levels of XBP1 mRNA in the lesions of vitiligo and stressed HaCaT cells were detected by Real-time PCR. The level of IL-6 and IL-8 secretion were detected by ELISA in stressed HaCaT cells before and after treatment with XBP1 inhibitors. Results: The levels of the XBP1 mRNA expression in the lesions of vitiligo and stressed HaCaT cells were higher than that in the control group. The levels of IL-6 and IL-8 in the stressed HaCaT cells were higher than those in the normal HaCaT cells and decreased after the activation of XBP1 was inhibited. Conclusion: The expression level of XBP1 is up-regulated and promote the secretion of IL-6 and IL-8 in the stressed keratinocytes.

XBP1; keratinocytes; vitiligo

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81602764,81502863)

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，西安，710032

李春英，E-mail: lichying@fmmu.edu.cn