張潔陳曉敏吳錦鴻 朱重慶 丁新倫 吳祖建

(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350002；＃共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail:wuzujian@126.com)

水稻齒葉矮縮病毒Pns10蛋白在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的表達(dá)

張潔＃陳曉敏＃吳錦鴻 朱重慶 丁新倫 吳祖建*

(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350002；＃共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail:wuzujian@126.com)

【目的】水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介體昆蟲細(xì)胞內(nèi)可形成類似病毒原質(zhì)(viroplasm)的內(nèi)含體，是RRSV侵染介體所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有類似功能及其表達(dá)情況如何未見報(bào)道。【方法】利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)Pns10蛋白，免疫家兔制備多克隆抗體；通過水稻原生質(zhì)體病毒侵染體系，利用免疫熒光技術(shù)分析Pns10蛋白在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的分布情況，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的積累情況?！窘Y(jié)果】將Pns10基因克隆到Gateway系統(tǒng)原核表達(dá)載體pDEST17中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)成功后，制備融合蛋白抗血清。Western blot檢測(cè)顯示，該抗血清可檢測(cè)感病水稻葉片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生質(zhì)體后，Pns10蛋白可形成類似病毒原質(zhì)的內(nèi)含體；Pns10 RNA在病毒接種8 h后開始積累，24 h后達(dá)到最大值，隨后開始下降；Pns10蛋白在24 h后開始表達(dá)，之后維持較高水平，60 h后略有下降?！窘Y(jié)論】成功獲得了Pns10抗血清；Pns10在水稻原生質(zhì)體內(nèi)成功表達(dá)，可形成類似病毒原質(zhì)的內(nèi)含體，并且Pns10 RNA的表達(dá)先于其蛋白的表達(dá)。

水稻齒葉矮縮病毒；水稻原生質(zhì)體；Pns10抗體；Pns10 RNA；Pns10蛋白

植物呼腸孤病毒(Reoviruses)主要有3個(gè)屬，即植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)、斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)和水稻病毒屬(Oryzavirus)[1]。水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)是水稻病毒屬的成員，在我國南方和越南等地給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失[2,3]。RRSV主要由褐飛虱(Nilaparvatalugens)以持久性方式傳播，但不經(jīng)卵和水稻種子傳播[4,5]。RRSV可侵染水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥等多種植物，主要表現(xiàn)為病株濃綠矮縮，分蘗增多，葉尖旋卷，葉緣有鋸齒狀缺刻，葉鞘和葉片基部有長短不一的線狀脈腫等。

RRSV基因組包含10條雙鏈RNA(doublestranded RNA,dsRNA)，分別為S1～S10[6]，它們編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(P1、P2、P3、P4A、P5、P8B和P9)和3種非結(jié)構(gòu)蛋白(Pns6、Pns7和Pns10)[3,7]。其中，P2、P3、P4A、P5分別為假定的尿苷轉(zhuǎn)移酶、外殼刺突蛋白、假定的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)、加帽酶等[1,8-10]，P8是主要外殼蛋白[8]，P9是刺突蛋白，參與介體傳毒[11]。非結(jié)構(gòu)蛋白中，Pns6具有沉默抑制子功能，并參與病毒在寄主植物中的運(yùn)動(dòng)[12,13]；Pns7作為一個(gè)NTP結(jié)合蛋白[14]，可能參與病毒在介體昆蟲體內(nèi)的擴(kuò)散[15]；Pns10具有ATPase的活性[16]，并與介體昆蟲中病毒原質(zhì)的形成及病毒復(fù)制相關(guān)[17]。

植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展、完善，為植物病毒分子生物學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的手段。植物原生質(zhì)體在病毒的侵染、復(fù)制、基因組功能和病毒與寄主細(xì)胞間的互作研究中發(fā)揮了重要的作用，也成為植物病毒研究的良好體系。煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)侵染煙草原生質(zhì)體檢測(cè)到病毒粒體的積累[18,19]，水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)、水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)等病毒也在水稻原生質(zhì)體內(nèi)成功表達(dá)[20-22]。本課題組利用水稻原生質(zhì)體病毒侵染體系，對(duì)RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Pns7和結(jié)構(gòu)蛋白P8的表達(dá)進(jìn)行了具體分析[23,24]。在之前研究的基礎(chǔ)上，本研究從RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10入手，制備Pns10抗血清，采用免疫熒光技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)技術(shù)，研究Pns10基因在病毒侵染水稻原生質(zhì)體后的表達(dá)情況，旨在為揭示RRSV致病性、病毒與寄主互作關(guān)系提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：感染RRSV的水稻病株由本實(shí)驗(yàn)室于田間種植保存；粳稻品種日本晴(Oryza sativa L. japonica cv.Nipponbare)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

菌株和載體：大腸桿菌DH5α菌株和Rosetta菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。Gateway系統(tǒng)載體pDONR221和pDEST17由福建農(nóng)林大學(xué)魏太云教授課題組饋贈(zèng)。

主要試劑：Trizol、重組酶(Gateway BP Clonase Enzyme Mix、LR Clonase Enzyme Mix，Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)；蛋白質(zhì)標(biāo)記(GeneStar公司)；IPTG、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔、BCIP/NBT(Sigma公司)；PVDF膜(Amersham Pharmacia Biotech公司)；DNA通用試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司)；聚合酶(2×Es Taq MasterMix，含染料，北京康為世紀(jì)公司)；KOD高保真酶、熒光定量PCR試劑(TOYOBO公司)；纖維素酶(Cellulose onozuka R-10)和離析酶(Macerozyme R-10，北京拜耳迪生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Pns10蛋白的原核表達(dá)

根據(jù)Pns10的基因序列設(shè)計(jì)全長引物(RRSVPns10-F:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC AGGCTTC ATGCCTTTCGTGCAATTCCC-3′; RRSV-Pns10-R:5′-GGGGACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGGTCCTCTGCGTCATCACCAAA GT-3′，其中5′端下劃線標(biāo)示Gateway載體重組序列)。Trizol法提取病葉總RNA，利用下游特異性引物RRSV-Pns10-R反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用RRSV-Pns10-F/RRSV-Pns10-R進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。將目的片段按照試劑盒說明跟中間載體pDONR221進(jìn)行BP重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)PCR鑒定并序列測(cè)定無誤后，將重組質(zhì)粒按照試劑盒說明跟終載體pDEST17進(jìn)行LR重組反應(yīng)，獲得表達(dá)載體pDEST17-Pns10，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，保存?zhèn)溆谩Ｌ崛DEST17-Pns10重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株，PCR篩選后，參照文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.2 Pns10抗血清的制備

將正確誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行大量誘導(dǎo)，通過12.5%SDS-PAGE電泳后，用預(yù)冷的0.25 mmol/L KCl顯色溶液浸泡5～10 min，切取含有目的蛋白的凝膠并研磨乳化，免疫新西蘭大白兔。免疫注射5次，初次免疫使用弗氏完全佐劑，間隔一周再次免疫使用弗氏不完全佐劑，最后加強(qiáng)免疫后一周進(jìn)行取血，37℃放置1 h，4℃冰箱中過夜使得血漿凝結(jié)，6 000 r/min離心20 min收集血清于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Western blot檢測(cè)抗體及病毒蛋白的表達(dá)

參照文獻(xiàn)[24]的方法對(duì)制備的抗血清進(jìn)行檢測(cè)。

RRSV接種水稻原生質(zhì)體后，不同時(shí)間點(diǎn)(接種后16、24、32、48、60、72 h)取樣，以等質(zhì)量原生質(zhì)體為樣本提取總蛋白，然后進(jìn)行Western blot檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)量。

1.2.4 PEG法病毒侵染原生質(zhì)體

病毒提取方法參照文獻(xiàn)[25]，稱取1 g感染RRSV的水稻病葉，在滅菌的培養(yǎng)皿中用70%酒精消毒，無菌水清洗3次；將水稻病葉剪碎后放入滅菌的研缽中，加入石英砂和1 mL His-Mg溶液(0.1 mol/L L-Histidine，0.01 mol/L MgCl2，pH 6.2)研磨成漿；4℃、2000 r/min下離心5 min，去除石英砂和雜質(zhì)；取上清液4℃、5000 r/min下離心20 min，收集上清即為RRSV粗提液。測(cè)定濃度后，取10 μg粗提液接種于100 μL水稻原生質(zhì)體中(約含1×106個(gè)細(xì)胞)。參照文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行水稻原生質(zhì)體的制備及PEG介導(dǎo)的病毒侵染。

1.2.5 激光共聚焦觀察Pns10的表達(dá)

玻片用0.05%多聚賴氨酸包被3～4 h，PBS(pH 7.2)洗3次后風(fēng)干；將樣本原生質(zhì)體均勻滴加到玻片上；5 min后加入96%乙醇固定20 min；PBS清洗玻片3次；加入5%BSA(溶于PBS，pH 7.2)封閉45 min；PBS洗滌玻片3次；加入1～5μg/mL熒光一抗(熒光抗體標(biāo)記方法參照賈東升[25])，避光室溫孵育1 h；PBS清洗玻片；Leica熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)量

采用絕對(duì)定量PCR試驗(yàn)。將含有RRSV目的基因片段的質(zhì)粒(pDONR-Pns10)作為標(biāo)準(zhǔn)品，梯度稀釋后作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)建立目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取病毒侵染不同時(shí)間點(diǎn)(接種后8、16、24、32、48、60 h)的原生質(zhì)體，Trizol法提取其總RNA，測(cè)定濃度后，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物qPns10-F(5′-GGTTGATG CCACAGGTAA-3′)和qPns7-R(5′-TAAGCAGAAA GGGACAGG-3′)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，將反應(yīng)后得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程最終可得出樣本中的拷貝數(shù)，從而比較不同時(shí)間目的基因表達(dá)量的差異。每次試驗(yàn)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pns10表達(dá)載體的構(gòu)建

提取感病水稻總RNA，利用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增Pns10全長891 bp(不包含終止密碼子)序列。通過兩步Gateway重組反應(yīng)，獲得重組表達(dá)載體pDEST17-Pns10(圖1)。

2.2 Pns10重組蛋白的表達(dá)

將pDEST17-Pns10載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株后，IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，加上His標(biāo)簽的大小及Gateway重組序列，目的蛋白大約為38 kD，表達(dá)正確(圖2)，并且與陰性對(duì)照相比誘導(dǎo)表達(dá)明顯。

2.3 Pns10抗血清的制備

以誘導(dǎo)表達(dá)的Pns10目的蛋白為抗原，進(jìn)行抗血清的制備。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，感病水稻樣品中僅檢測(cè)到32 kD左右的目的條帶，與預(yù)測(cè)的Pns10蛋白大小一致，而未發(fā)現(xiàn)其他條帶；同時(shí)健康水稻對(duì)照也未出現(xiàn)任何條帶，說明該抗血清具有一定的特異性(圖3)。

圖1 pDEST17-Pns10表達(dá)載體的菌液PCR鑒定Fig.1.PCR analysis of the bacterium harboring the pDEST17-Pns10 expression vector.

圖2 SDS-PAGE分析大腸桿菌Rosetta菌株P(guān)ns10表達(dá)Fig.2.SDS-PAGE analysis of the expression of Pns10 protein in Escherichia coli Rosetta strain.

2.4 免疫熒光標(biāo)記Pns10在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的表達(dá)

RRSV接種水稻原生質(zhì)體后，48 h取樣，進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，Pns10在細(xì)胞內(nèi)形成顆粒狀內(nèi)含體。結(jié)果表明，RRSV病毒粒子成功侵染了水稻原生質(zhì)體并可形成類似病毒原質(zhì)組分(圖4)。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)水稻原生質(zhì)體中Pns10 RNA的表達(dá)

RRSV接種水稻原生質(zhì)體后，不同時(shí)間分別取樣，檢測(cè)Pns10 RNA在原生質(zhì)體中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，病毒接種8 h后，即可檢測(cè)到Pns10 RNA的積累，隨后呈上升趨勢(shì)，24 h左右RNA表達(dá)量達(dá)到最大值，16～48 h表達(dá)量維持較高水平(圖5)。

圖3 Western blot檢測(cè)Pns10抗血清Fig.3.Analysis of the antiserum against Pns10 by Western blot.

圖4 共聚焦顯微鏡檢測(cè)Pns10在病毒侵染水稻原生質(zhì)體后的表達(dá)Fig.4.Analyzing the Pns10 expression in rice protoplasts 48 h post virus inoculation by confocal microscope.

2.6 Western blot檢測(cè)RRSV侵染后水稻原生質(zhì)體中Pns10蛋白的表達(dá)

RRSV接種水稻原生質(zhì)體后，不同時(shí)間分別取相同質(zhì)量的原生質(zhì)體樣本，提取其蛋白，經(jīng)Western blot檢測(cè)病毒Pns10蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Pns10蛋白在病毒接種后24 h左右開始表達(dá)，60 h左右表達(dá)量達(dá)到最大，隨后開始下降(圖6)。

3 討論

圖5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Pns10 RNA在病毒侵染水稻原生質(zhì)體后不同時(shí)間段的表達(dá)Fig.5.Analyzing the RNA expression of Pns10 gene in rice protoplasts at different time post virus inoculation by real-time quantitative RT-PCR.

圖6 Western blot分析Pns10蛋白在病毒侵染水稻原生質(zhì)體后不同時(shí)間段的表達(dá)Fig.6.Analyzing the expression of Pns10 protein in rice protoplasts at different time post virus inoculation by Western blot.

原生質(zhì)體為植物病毒研究提供了一種有效手段[18-24]。本研究中，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，RRSV接種水稻原生質(zhì)體后，Pns10RNA在8 h左右開始表達(dá)，Pns10蛋白在24 h左右開始表達(dá)，結(jié)果證實(shí)了RNA表達(dá)早于蛋白的表達(dá)。與之前我們的研究結(jié)果相比，RRSV侵染水稻原生質(zhì)體后，兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10和Pns7 RNA表達(dá)動(dòng)態(tài)保持一致[24]，而外殼蛋白P8 RNA表達(dá)略有延遲，但同比最大值，P8 RNA的絕對(duì)定量更高[23]。從整體的趨勢(shì)來看，各基因的表達(dá)量都是先上升后下降，與他人的研究結(jié)果保持一致[21,22]。前期的上升符合病毒指數(shù)增長的特征，后期的下降說明病毒在原生質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制受到了限制，這與原生質(zhì)體細(xì)胞活性下降也有一定關(guān)系。

呼腸孤病毒科(Reoviridae)的病毒在侵染細(xì)胞中經(jīng)常形成特定的復(fù)制場(chǎng)所，被稱作病毒原質(zhì)(viroplasms)或病毒工廠(viral factories)或病毒內(nèi)含體(viral inclusion bodies)，由病毒編碼的蛋白參與形成，不同的病毒參與形成病毒原質(zhì)的蛋白不同。水稻矮縮病毒(Rice dwarf virus,RDV)的Pns6、Pns11和Pns12蛋白在介體葉蟬體內(nèi)參與了病毒原質(zhì)的形成[26,27]；水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)的P9-1蛋白在感病玉米植株和介體灰飛虱體內(nèi)都能形成病毒原質(zhì)的組分[28]，在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)P9-1蛋白也能觀察到類似病毒原質(zhì)的組分[29]；水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)的Pns9蛋白在病毒原質(zhì)形成過程中起重要作用[30,31]。本研究利用水稻原生質(zhì)體結(jié)合免疫熒光技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pns10在細(xì)胞內(nèi)形成類似病毒原質(zhì)的點(diǎn)狀內(nèi)含體，這與Jia等[17]的研究結(jié)果一致，表明Pns10極有可能也參與寄主水稻中病毒原質(zhì)的形成和病毒的復(fù)制。Jia等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在非寄主昆蟲細(xì)胞Sf9中，Pns10可招募Pns6到病毒原質(zhì)中，共同參與病毒的復(fù)制和裝配，寄主水稻中是否具有類似功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

謝辭：特別感謝福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所的毛倩卓老師在共聚焦顯微鏡技術(shù)上的指導(dǎo)！

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Expression of Pns10 Protein of Rice ragged stunt virus in Rice Protoplasts

ZHANG Jie＃,CHEN Xiaomin＃,WU Jinhong,ZHU Chongqing,DING Xinlun,WU Zujian*

(Institute of Plant Virology,Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province,Fuzhou 350002,China;＃These authors contributed equally to this work;*Corresponding author,E-mail:wuzujian@126.com)

【Objective】Pns10 of Rice ragged stunt virus(RRSV)forms viroplasm-like inclusion bodies which are essential for virus infection to vector insects.However,the expression pattern and function of Pns10 in rice remain unknown.【Method】Polyclonal antibody against Pns10 protein was prepared by immunizing rabbits with a bacterially expressed Pns10;the cellular distribution of Pns10 protein in rice protoplasts was observed with an immunofluorescence microscopy;the accumulation of Pns10 RNA in rice protoplasts infected by RRSV was quantified with real-time quantitative RT-PCR and that of the Pns10 protein was investigated using Western blot.【Result】Pns10 ORF was cloned into the Gateway prokaryotic expression vector pDEST17 and its expression was induced by IPTG.Polyclonal antiserum against the Pns10 was obtained and it can react with the Pns10 protein from the naturally RRSV-infected rice by Western blot detecting.Pns10 formed viroplasm-like inclusion bodies in protoplasts.The Pns10 RNA was first detected at 8 h post RRSV inoculation.The accumulation of Pns10 RNA peaked at 24 h post virus inoculation but began to decline thereafter.The Pns10 protein was first detected at 24 h post virus inoculation.A high level of Pns10 protein was maintained until 60 h post virus inoculation.【Conclusion】Antiserum against RRSV Pns10 protein was obtained.Pns10 was expressed and viroplasm-like inclusion bodies formed in rice protoplasts.In addition,the expression of Pns10 RNA was earlier than that of the Pns10 protein.

Rice ragged stunt virus;rice protoplast;Pns10 antibody;Pns10 RNA;Pns10 protein

Q786;S435.111.4+9

:A

:1001-7216-(2017)03-0232-06

2016-11-08；修改稿收到日期：2016-12-13。

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20133515120004)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31301640)；福建教育廳科技項(xiàng)目(JA13103)。