張桂蓮 廖斌 唐文幫 陳立云肖應(yīng)輝

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長(zhǎng)沙410128；*通訊聯(lián)系人,E-mail:chenliyun996@163.com,xiao_yh@163.com)

稻米堊白性狀對(duì)高溫耐性的QTL分析

張桂蓮 廖斌 唐文幫 陳立云*肖應(yīng)輝*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長(zhǎng)沙410128；*通訊聯(lián)系人,E-mail:chenliyun996@163.com,xiao_yh@163.com)

【目的】本研究旨在篩選與稻米外觀品質(zhì)高溫耐性連鎖的分子標(biāo)記，為稻米品質(zhì)育種提供參考。【方法】以耐熱水稻品系996和熱敏感水稻品系4628為親本構(gòu)建的重組自交系為材料，采用堊白粒率耐熱指數(shù)、堊白大小耐熱指數(shù)和堊白度耐熱指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)水稻堊白性狀的高溫耐性QTL進(jìn)行檢測(cè)。【結(jié)果】采用復(fù)合區(qū)間作圖法兩年共檢測(cè)到堊白性狀高溫耐性QTL 24個(gè)，包括堊白粒率高溫耐性QTL 8個(gè)，堊白大小高溫耐性QTL 12個(gè)，堊白度高溫耐性QTL 4個(gè)。其中，第6染色體上的2個(gè)堊白粒率高溫耐性QTL和第7染色體上的2個(gè)堊白度高溫耐性QTL在兩年中重復(fù)檢測(cè)到，且這2個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的堊白度位點(diǎn)與2015年檢測(cè)到的第7染色體上的堊白粒率位點(diǎn)重合。另外，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)QTL一因多效，同時(shí)影響堊白粒率、堊白大小及堊白度。【結(jié)論】控制堊白粒率耐熱指數(shù)的qHTCGR6.1和控制堊白度耐熱指數(shù)的qHTCD7.1是新的QTL。

稻米；堊白性狀；高溫耐性；數(shù)量性狀基因座位

水稻是我國(guó)主要糧食作物，在保障國(guó)家糧食安全中占有舉重輕重的地位。隨著人們生活水平提高，對(duì)稻米品質(zhì)的要求也越來越高。雖然近幾年我國(guó)水稻品種的稻米品質(zhì)有較大提高，但還遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)的需求。如林海等[1]對(duì)2011-2015年通過審定水稻品種主要米質(zhì)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn),粳稻品質(zhì)提高幅度較大，而秈型兩系雜交水稻和秈型三系雜交稻米質(zhì)總體表現(xiàn)較差，優(yōu)質(zhì)達(dá)標(biāo)率5年平均分別為39.10%和32.65%，堊白粒率、堊白度優(yōu)質(zhì)達(dá)標(biāo)率5年平均值分別為38.36%和6.6%。同樣,超級(jí)雜交稻的堊白粒率及堊白度優(yōu)質(zhì)達(dá)標(biāo)率仍然較低，僅為34.7%和51.0%[2]。堊白粒率、堊白度仍是制約我國(guó)雜交水稻品質(zhì)提高的主要因素。因此，減少堊白、改善稻米的外觀品質(zhì)，增加稻米的商品價(jià)值，是我國(guó)稻米品質(zhì)改良中亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。

近年來，全球氣候變暖，地球平均氣溫升高，極端高溫天氣發(fā)生的頻率增大，在世界上許多地區(qū)高溫已成為影響作物生長(zhǎng)的主要因素[3]。我國(guó)長(zhǎng)江以南雙季早稻的開花結(jié)實(shí)期及中稻開花期經(jīng)常遭遇異常高溫天氣，不僅影響水稻的受精結(jié)實(shí)，導(dǎo)致大幅度減產(chǎn)[4,5]，而且稻米品質(zhì)顯著降低，主要表現(xiàn)為外觀品質(zhì)變差，即堊白粒率增加、堊白度增大。大量的研究表明，灌漿成熟期的氣溫對(duì)稻米品質(zhì)影響極大[6-8]。高溫?zé)岷σ殉蔀橄拗莆覈?guó)南方稻區(qū)水稻優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)的瓶頸。因此，培育和推廣對(duì)環(huán)境溫度弱感或鈍感的廣適性水稻品種，是克服高溫脅迫的最有效措施。已有研究表明，稻米品質(zhì)形成對(duì)環(huán)境溫度的敏感性存在基因型差異,但由于缺乏對(duì)其遺傳基礎(chǔ)的了解,有關(guān)稻米品質(zhì)對(duì)溫度耐性的遺傳改良報(bào)道很少。因此，本研究利用水稻耐熱品系996和熱敏感品系4628為親本構(gòu)建的重組自交系群體為材料，對(duì)堊白性狀進(jìn)行QTL定位分析，旨在揭示稻米外觀品質(zhì)的遺傳機(jī)理，篩選與稻米外觀品質(zhì)高溫耐性連鎖的分子標(biāo)記，以應(yīng)用于稻米品質(zhì)育種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為耐熱水稻品系996、熱敏感水稻品系4628及其124個(gè)重組自交系群體。該重組自交系群體在以996/4628 F1自交分離獲得F2群體的基礎(chǔ)上，通過單粒傳法構(gòu)建而成。

1.2 材料種植與溫度處理

2014年和2015年分別在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗(yàn)地種植耐熱品系996、熱敏感品系4628、996/4628重組自交系群體。2014年3月27日播種，5月1日移栽，采用單本移植，每一株系種植30株，移栽密度為17 cm×20 cm；2015年3月27日播種，5月4日移栽，采用單本移植，每一株系種植30株，移栽密度為17 cm×20 cm。按照常規(guī)水稻栽培管理技術(shù)進(jìn)行田間管理，在水稻幼穗分化第5期左右，選取生長(zhǎng)進(jìn)程和分蘗數(shù)目基本一致水稻植株(邊行不取樣)移入盆缽中(盆缽內(nèi)徑266 mm，高190 mm)，移栽時(shí)植株根部帶土(根部帶土量基本一致)移入，每盆3株，每株系4盆，盆內(nèi)加水讓其恢復(fù)生長(zhǎng)。始穗當(dāng)日上午7:00-8:00標(biāo)記抽穗分蘗，在抽穗后8 d移入湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所人工氣候室進(jìn)行高溫(8:00-17:00,37℃，17:00-8:00,30℃)和適溫(8:00-17:00,30℃，17:00-8:00,25℃)處理。處理期間人工氣候室相對(duì)濕度為75%，植株冠層光通量密度為850μmol/(m2·s)。處理20 d后移出人工氣候室，在室外恢復(fù)生長(zhǎng)3 d，至成熟期收獲標(biāo)記穗，脫粒，于陰涼通風(fēng)處自然干燥3個(gè)月后進(jìn)行堊白性狀考察。每株系每處理處理兩盆，每1盆為1次重復(fù)，共2次重復(fù)。

1.2 表型測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 堊白粒率、堊白大小和堊白度的測(cè)定

從平均樣品中隨機(jī)數(shù)取試樣100粒，3次重復(fù)。逐粒目測(cè)，揀出試樣中具有明顯的、白色透明的堊白米粒，然后統(tǒng)計(jì)堊白米粒數(shù)目，計(jì)算堊白粒率(堊白米粒占試樣總粒數(shù)的百分率)，從中選取100粒采用平面方格法，逐粒目測(cè)堊白面積占整粒米平面投影面積的百分率，然后用加權(quán)法計(jì)算試樣平均堊白大小。然后，根據(jù)公式計(jì)算堊白度(堊白度=堊白粒率×堊白大小×100)。

1.2.2 堊白性狀耐熱指數(shù)的計(jì)算

堊白性狀高溫耐性以耐熱指數(shù)表示，計(jì)算公式如下：

堊白粒率耐熱指數(shù)=[(高溫下堊白粒率-適溫下堊白粒率)/堊白粒率轉(zhuǎn)換指數(shù)]×100；堊白粒率轉(zhuǎn)換指數(shù)=[(親本高溫下堊白粒率-親本適溫下堊白粒率)/親本高溫下堊白粒率]×100；

堊白大小耐熱指數(shù)=[(高溫下堊白大小-適溫下堊白大小)/堊白大小轉(zhuǎn)換指數(shù)]×100；堊白大小轉(zhuǎn)換指數(shù)=(親本高溫下堊白大小-親本適溫下堊白大小)/親本高溫下堊白大小×100；

堊白度耐熱指數(shù)=[(高溫下堊白度-適溫下堊白度)/堊白度轉(zhuǎn)換指數(shù))×100；堊白度轉(zhuǎn)換指數(shù)=[(親本高溫下堊白度-親本適溫下堊白度)/親本高溫下堊白度]×100。

以2個(gè)重復(fù)(盆缽)耐熱指數(shù)的平均值作為高溫耐性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3 DNA提取及基因型分析方法

1.3.1 DNA樣品制備和SSR分析

在水稻分蘗期對(duì)耐熱品系996、熱敏感品系4628及996/4628重組自交系群體各株系取3～4片新鮮幼嫩葉片，液氮速凍后保存在-80℃低溫冰箱中備用。DNA樣品的制備參照Saghai等[9]的方法。提取的DNA溶解于TE緩沖液(10 mmol/L Tris, 0.1 mmol/L EDTA)。每份DNA統(tǒng)一用ddH2O稀釋成20 ng/L的濃度，作為PCR分析的模板。

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道的引物序列[10-14]，共計(jì)選取了991對(duì)SSR引物和66對(duì)SFP引物對(duì)親本的多態(tài)性進(jìn)行了篩選。SSR和SFP分析參照Chen等[10]的程序，10 μL反應(yīng)體系包含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，50 μmol/LdNTPs，0.2 μmol/L引物，0.5 U Taq聚合酶(天根生化科技有限公司生產(chǎn))和20 ng DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)在美國(guó)ABI-2700 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下30 s；55℃下30 s，72℃下1 min,共35個(gè)循環(huán)；最后72℃下延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，銀染顯色。DNA條帶利用裝有熒光燈的燈箱進(jìn)行觀察。

1.3.2 遺傳連鎖圖構(gòu)建及QTL分析

根據(jù)兩個(gè)群體中各株系PCR產(chǎn)物的電泳帶型，將與996帶型相同的個(gè)體記為“1”，與4628帶型相同的個(gè)體記為“2”，表現(xiàn)雙親帶型的雜合個(gè)體記為“3”，空缺的條帶記為“-”，并進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。運(yùn)用MapMaker 3.0軟件[15]對(duì)整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算分子標(biāo)記間的遺傳距離，并繪制分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜(LOD閾值取3.0)。利用已構(gòu)建的分子標(biāo)記遺傳圖譜[16]，結(jié)合各耐熱表型數(shù)據(jù)，使用WinQTL Cartographer 2.5軟件[17]，用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)進(jìn)行QTL分析。并分析每個(gè)QTL可解釋表型變異的百分率。將LOD值2.5作為閾值，若標(biāo)記區(qū)間LOD≥2.5，則認(rèn)為該區(qū)間LOD值的最高處對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)為該性狀的1個(gè)QTL，并分析各個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本與RIL群體的表型

從表1和圖1可看出，在堊白粒率、堊白大小、堊白度性狀方面，親本996和4628耐熱指數(shù)差異大，且不同年份表現(xiàn)基本一致。而重組自交系群體各株系的堊白粒率、堊白度、堊白大小的耐熱指數(shù)均表現(xiàn)為正態(tài)連續(xù)性分布，同一性狀兩年間的頻率分布特征基本一致，但2015年各性狀值多大于2014年，這可能是不同的環(huán)境條件能夠影響水稻堊白性狀的分布。

2.2 堊白粒率高溫耐性QTL定位

2014年在重組自交群體中檢測(cè)到堊白粒率高溫耐性QTL共6個(gè)，分別位于第1、第3、第6和第7染色體上(表2)。QTL的貢獻(xiàn)率變化范圍為7.91%～17.89%，加性效應(yīng)值變幅為0.02～0.06；2015年在重組自交系群體中檢測(cè)到堊白粒率高溫耐性QTL共4個(gè)，分別位于第6、第7染色體上，QTL的貢獻(xiàn)率的變化范圍為7.66%～14.25%，加性效應(yīng)值變幅為0.03～0.06。位于第6染色體上的RM3353-RM1369標(biāo)記區(qū)間內(nèi)的qHTCGR6.1及RM1369-RM190標(biāo)記區(qū)間內(nèi)的qHTCGR6.2在2014與2015年間均被檢測(cè)到。qHTCGR6.1、qHTCGR6.2的LOD值分別為4.44和7.24；貢獻(xiàn)率分別為14.24%和17.89%。

2.3 堊白大小高溫耐性QTL定位

2014年在重組自交群體中檢測(cè)到堊白大小高溫耐性QTL共7個(gè)，分別位于第1、第2、第10染色體上，其中第1染色體上分布1個(gè)QTL，第2染色體上分布2個(gè)QTL，第10染色體上存在4個(gè)QTL(表2)。QTL的貢獻(xiàn)率變化范圍為10.30%～15.08%，加性效應(yīng)值變幅為-0.14～0.17。2015年在重組自交系群體中檢測(cè)到堊白大小高溫耐性QTL共5個(gè)，分別位于第4、第6、第7染色體上，第4染色體上分布1個(gè)QTL，其中第6和第7染色體上各分布2個(gè)QTL，這5個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率的變化范圍在6.91%～18.76%，其加性效應(yīng)值變幅為-0.25～0.17。所有堊白大小高溫耐性QTL均只被檢測(cè)出一次，兩年間沒有相同的QTL被檢測(cè)出來。位于第6染色體上的qHTCS6.1、qHTCS6.2和第7染色體上的qHTCS7.1、qHTCS7.2與堊白粒率高溫耐性的位點(diǎn)重合。

表1 雙親及RIL群體各株系堊白粒率、堊白大小和堊白度耐熱指數(shù)Table 1.Heat tolerance index of chalky grain rate,chalkiness size and chalkiness degree of two parents and their RIL population.

圖1 2014年和2015年RIL群體堊白粒率、堊白大小、堊白度耐熱指數(shù)分布Fig.1.Frequency distribution of heat tolerance index of chalky grain rate,chalkiness size and chalkiness degree in RIL population in 2014 and 2015.

2.4 堊白度高溫耐性QTL定位

2014年在重組自交群體中檢測(cè)到4個(gè)堊白度高溫耐性QTL，分別位于第1、第3、第7染色體上，其中2個(gè)QTL位于第7染色體上(表2)，QTL的貢獻(xiàn)率變化范圍為11.54%～36.34%，加性效應(yīng)值變幅為-0.17～-0.10；2015年在重組自交系群體中檢測(cè)到2個(gè)堊白度高溫耐性QTL，分布在第7染色體上，貢獻(xiàn)率分別為17.44%、29.52%，加性效應(yīng)值變幅為-0.14～-0.17。位于第7染色體上RM21327 -RM21364標(biāo)記區(qū)間內(nèi)的qHTCD7.1和RM21364 -RM3859標(biāo)記區(qū)間內(nèi)的qHTCD7.2在兩年均被重復(fù)檢測(cè)出來，2014年貢獻(xiàn)率分別為13.27%、16.32%，2015年貢獻(xiàn)率分別為17.44%、29.52%。而且這兩個(gè)位點(diǎn)與堊白粒率、堊白大小的位點(diǎn)重合，表明堊白度與堊白粒率、堊白大小間存在高度相關(guān)的內(nèi)在分子基礎(chǔ)。

表2 堊白性狀高溫耐性QTL分析Table 2.Mapping of heat tolerance QTL associated with grain chalkiness traits.

3 討論

水稻堊白性狀包括堊白粒率、堊白面積、堊白度，堊白性狀屬于數(shù)量性狀，有多個(gè)QTL共同調(diào)控堊白性狀的表達(dá)，并且與環(huán)境存在明顯的互作效應(yīng)[18-24]。高溫是影響水稻堊白形成的最主要?dú)夂蛞蛩?，灌漿結(jié)實(shí)期高溫脅迫明顯導(dǎo)致水稻籽粒堊白粒率上升，堊白面積增大，堊白度增加[25-28]。高溫脅迫已成為水稻優(yōu)質(zhì)的重要限制因素。本研究以996/4628 RIL為供試材料，對(duì)水稻籽粒堊白粒率高溫耐性QTL、堊白大小高溫耐性QTL、堊白度高溫耐性QTL進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，在2014-2015年2年內(nèi)共檢測(cè)到堊白性狀高溫耐性QTL 24個(gè)，其中堊白粒率高溫耐性QTL 8個(gè)，堊白大小高溫耐性QTL 12個(gè)，堊白度高溫耐性QTL 4個(gè)。在2014 -2015年，2個(gè)堊白粒率高溫耐性QTL qHTCGR6.1，qHTCGR6.2和2個(gè)堊白度高溫耐性QTL qHTCD7.1，qHTCD7.2在兩年均被重復(fù)檢測(cè)到，這表明這4個(gè)QTL位點(diǎn)在不同年份環(huán)境中能穩(wěn)定表達(dá)。其余控制堊白性狀的QTL位點(diǎn)只能在一個(gè)年份中檢測(cè)到，屬于對(duì)環(huán)境敏感型。其次，位于第7染色體上的2個(gè)堊白度位點(diǎn)與堊白粒率的位點(diǎn)重合，表明這2個(gè)位點(diǎn)不僅能調(diào)控堊白粒率，而且對(duì)堊白度也有一定的影響，這2個(gè)性狀可能存在相同的遺傳基礎(chǔ)[29-30]。

圖2 檢測(cè)到的堊白性狀高溫耐性QTL在染色體上的分布Fig.2.Chromosome location of putative QTL for heat tolerance of grain chalkiness traits.

同一性狀的檢測(cè)結(jié)果在不同群體中可能不同；同一群體的同一性狀QTL檢測(cè)結(jié)果在不同年份或地點(diǎn)中可能不同；同一群體的，同一年份的，同一地點(diǎn)的同一性狀QTL檢測(cè)結(jié)果可能因不同播始?xì)v期而不同。因此，重復(fù)性高，貢獻(xiàn)率大的QTL往往存在較大的挖掘空間。在本研究中，位于第6染色體RM1369-RM190標(biāo)記區(qū)間的qHTCGR6.2與盤毅等[31]利用本研究的同一個(gè)群體在第6染色體上檢測(cè)到控制花粉育性高溫耐性QTL(標(biāo)記區(qū)間為RM190-RM225)和Yamakawa等[32]定位的位點(diǎn)qPGWC-6相鄰，與高方遠(yuǎn)等[33]定位的控制堊白粒率性狀表達(dá)的基因位點(diǎn)重合。這說明標(biāo)記RM190附近可能存在同時(shí)控制堊白粒率、堊白粒率高溫耐性及花粉育性高溫耐性基因。位于第7染色體RM21364-RM3859標(biāo)記區(qū)間的qHTCD7.2與楊亞春等[22]定位的堊白粒率QTL qCR7-1標(biāo)記區(qū)間RM481-RM3859相鄰，這說明標(biāo)記RM3859附近可能存在同時(shí)控制堊白性狀及堊白性狀高溫耐性基因。位于第6染色體RM3353-RM1369標(biāo)記區(qū)間內(nèi)的qHTCA6.1和位于第7染色RM21327-RM21364標(biāo)記區(qū)間內(nèi)的qHTCD7.1在兩年中穩(wěn)定表達(dá)，目前未有相關(guān)報(bào)道，可能為新的QTL位點(diǎn)，可為分子標(biāo)記輔助選擇培育耐熱優(yōu)質(zhì)水稻品種提供新的基因資源。

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Identifying QTLs for Thermo-tolerance of Grain Chalkiness Trait in Rice

ZHANG Guilian,LIAO Bin,TANG Wenbang,CHEN Liyun*,XIAO Yinghui*

(College of Agronomy,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;*Corresponding author,E-mail:chenliyun996@163.com, xiaoyinghui@163.com)

【Objective】The molecular markers linked to high temperature tolerance of rice appearance quality were screened for the purpose of providing an important foundation of improvement for rice grain quality.【Method】The quantitative trait loci(QTLs)for heat tolerance of grain chalkiness trait were identified using the recombinant inbred lines(RILs)derived from a cross between the heat tolerant rice line 996 and the heat sensitive line 4628.The heat tolerance indexes of chalky grain rate,chalkiness size and chalkiness degree were used as the heat-tolerance indicators.【Result】24 QTLs for heat tolerance of grain chalky traits were detected in two years by using composite interval mapping analysis including eight for heat tolerance of chalky grain rate(HTCGR),twelve for heat tolerance of chalkiness size and fourteen for heat tolerance of chalkiness degree(HTCD).Two HTCGR QTLs on chromosome 6 and two HTCD QTLs on chromosome 7 could be detected repeatedly in two years.The two HTCD sites coincided with two HTCGR sites on chromosome 7 detected in 2015.Moreover,anyone of the four pleiotropic QTLs had impacts on the chalky grain rate,chalkiness size and chalkiness degree.【Conclusion】The QTL controlling the heat tolerance index of chalkiness degree qHTCGR6.1 and the QTL controlling the heat tolerance of chalkiness degree qHTCD7.1 might be new findings.．

rice;chalkiness trait;thermo-tolerance;quantitative trait locus

Q948.112+2;Q343.1+5

：A

：1001-7216(2017)03-0257-08

2016-12-25;修改稿收到日期：2017-02-28。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30900874)；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11JJ3026)；湖南省科技計(jì)劃博士后專項(xiàng)(2012RS4037)；湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(17A100)；作物學(xué)開放基金資助項(xiàng)目(ZWKF201504)。