張麗娜，林美桂，劉桃麗，古月瑜，廖曉忠，陶嵐婷，莫穗林

(1.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510655；2.廣州市越秀區(qū)衛(wèi)生局，廣東 廣州 510000；3.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 珠海 519000；4.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510080)

人肝癌細(xì)胞HepG2接種于BALB/C裸小鼠移植瘤的性別差異

張麗娜1，林美桂2，劉桃麗3，古月瑜4，廖曉忠4，陶嵐婷4，莫穗林4

(1.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510655；2.廣州市越秀區(qū)衛(wèi)生局，廣東 廣州 510000；3.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 珠海 519000；4.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510080)

目的研究性別對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2接種于BALB/C裸小鼠成瘤及移植瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響。方法18只4～6周齡BALB/C裸小鼠雌雄各半，按照性別分成雌雄兩組，每組9只，將全部裸小鼠肩胛部接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且濃度為1.0×107/mL的HepG2細(xì)胞0.2 mL，10 d后觀察兩組的成瘤情況并測(cè)量腫瘤體積。結(jié)果雌性組成瘤模型4只，成瘤率為44.44%；雄性組成瘤模型9只，成瘤率為100.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)；造模成功的移植瘤體積走勢(shì)圖顯示移植瘤生長(zhǎng)速度雄性組大于雌性組。結(jié)論人肝癌細(xì)胞HepG2接種于BALB/C裸小鼠成瘤率及移植瘤生長(zhǎng)速度有明顯的性別差異。

HepG2；成瘤；性別；裸小鼠

我國(guó)是肝癌大國(guó)，居惡性腫瘤病死率的第二位，組織學(xué)上類(lèi)型較多，如肝膽管癌、肝細(xì)胞癌、血管肉瘤等。并發(fā)癥如低蛋白血癥、凝血功能障礙、腹水、肝性腦病等復(fù)雜且難以糾正，影響患者生活質(zhì)量甚至危及生命。關(guān)于肝癌模型的研究，目前比較常用的有Hepal-6細(xì)胞誘發(fā)C57BL/6J小鼠原位肝癌模型[1]、HepG2細(xì)胞株建立裸鼠肝癌模型[2]、直接移植法建立大鼠肝癌模型[3]、直接注入法建立大鼠肝癌模型[4]、免疫重建荷人高轉(zhuǎn)移肝癌SCD鼠模型[5]、基因型肝癌模型和其他移植性肝癌模型[6-7]。為方便直觀觀察腫瘤情況，本實(shí)驗(yàn)選用HepG2細(xì)胞株建立裸鼠皮下肝癌模型。關(guān)于肝癌模型動(dòng)物性別的選擇，有研究提出使用雌性[8-9]，亦有相反提倡使用雄性動(dòng)物者[10]。臨實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法裁定與判斷，因此實(shí)施性別對(duì)肝癌移植瘤相關(guān)影響的研究十分必要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。4～6周齡BALB/C裸鼠，雌雄各半，共18只，每組9只，體質(zhì)量14～16 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)：44007200004290。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至足夠接種裸鼠時(shí)收集細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞濃度配制為1.0×107/mL待用。

1.2.2 動(dòng)物飼養(yǎng) 4～6周齡BALB/C裸鼠，雌雄各半，每組9只，均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)：44007200004290；于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 造模 用1 mL注射器抽取混勻的濃度為1.0×107/mL的人肝癌HepG2細(xì)胞0.2 mL，接種于所有裸小鼠的右側(cè)肩背部皮下。根據(jù)性別分為雌雄組和雄性組，造模后將裸鼠放于籠中繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.2.4 觀察指標(biāo) 接種人肝癌HepG2細(xì)胞第10天，觀察兩組裸小鼠成瘤情況、精神狀態(tài)等一般情況，并測(cè)量移植瘤直徑，根據(jù)公式V=ab2/2計(jì)算移植瘤體積，繪制移植瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組成瘤率比較 兩組裸鼠各9只，雌性組成瘤4只，成瘤率為44.44%；雄性組成瘤9只，成瘤率為100.00%。雄性組成瘤率高于雌性組，兩組成瘤率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=-8.04，P=0.029)。

2.2 移植瘤成瘤情況及裸鼠一般情況 肉眼可見(jiàn)造模成功初期雌雄兩組移植瘤體積無(wú)明顯差異(圖1)，但雄性組裸小鼠移植瘤增速快于雄性組。截止到造模成功第28天，雄性組裸鼠精神倦怠，形體消瘦，毛不光潔，死亡2只；雌性組成瘤的裸鼠精神狀態(tài)均可，形體中等，毛尚光潔，無(wú)死亡。

2.3 移植瘤生長(zhǎng)趨勢(shì) 接種HepG2細(xì)胞后第10～28天，記錄各組移植瘤直徑a(長(zhǎng)徑)、b(短徑)，根據(jù)體積公式V=ab2/2繪制移植瘤體積走勢(shì)圖(圖2)，圖示雄性組移植瘤生長(zhǎng)速度大于雌性組，即疾病進(jìn)展快，惡性度高于雌性組。

圖1 接種HepG2細(xì)胞后第10天

圖2 雌雄兩組移植瘤體積走勢(shì)變化

3 討 論

關(guān)于雌激素對(duì)肝癌的影響，通過(guò)查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)既往相關(guān)研究的結(jié)果存在對(duì)立和矛盾，一部分研究認(rèn)為：雌激素會(huì)促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)磁性組H22荷瘤小鼠的移植瘤體積及體質(zhì)量均明顯大于雄性組[8-9]；Ogawa等[11]認(rèn)為雌激素增強(qiáng)了肝中鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的活力，因而DNA復(fù)制也就加快，受損的DNA復(fù)制過(guò)程誤讀機(jī)會(huì)增多，這與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街懈渭?xì)胞癌的起始、發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系；王文奇等[12]研究人肝癌BEL-7402細(xì)胞株中雌二醇與肝癌細(xì)胞尿激酶型纖溶酶源激活劑受體表達(dá)有關(guān)，發(fā)現(xiàn)減少肝癌患者增高的雌激素水平有利于減少u(mài)PAR的表達(dá)，從而降低肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。另一部分研究認(rèn)為：雌激素對(duì)肝癌有保護(hù)作用，可以抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展，如于楠指出雌激素對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤有抑制作用[10]；Slattery等[13]認(rèn)為使用激素替代治療能夠?qū)⒔Y(jié)腸癌的發(fā)病率降低30%。其機(jī)制可能與雌激素誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因產(chǎn)生有關(guān)；王永倉(cāng)等[14]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生理性雌激素對(duì)大鼠肝癌生成有保護(hù)作用。那么我們會(huì)在實(shí)驗(yàn)之初存在困惑，究竟哪一種性別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更適合用于肝癌模型研究？究竟哪一種結(jié)論是正確的？如果造模小鼠性別選擇錯(cuò)誤造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間損失將是巨大的，為探究真相，為本課題組的下一步實(shí)驗(yàn)及肝癌相關(guān)研究提供可靠依據(jù)，筆者先行探究性別對(duì)裸小鼠肝癌移植瘤的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雄性裸小鼠成瘤率及移植瘤生長(zhǎng)速度均較雌性組大，表明雌激素具有抑制人肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤形成和生長(zhǎng)的作用，進(jìn)一步推斷雌激素抑制肝癌的生成及發(fā)展。其作用機(jī)制可能與多方面有關(guān)，目前尚無(wú)定論。有學(xué)者認(rèn)為雌激素通過(guò)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因發(fā)揮保護(hù)作用[13]；研究報(bào)道雌激素與雌激素受體結(jié)合后調(diào)節(jié)IL-6轉(zhuǎn)錄信號(hào)旁路[15-18]，近而抑制IL-6的表達(dá)，而IL-6可以增強(qiáng)肝細(xì)胞因子誘導(dǎo)的肝細(xì)胞再生[19]。其機(jī)制隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，也必定會(huì)被研究得更加透徹和全面，需要繼續(xù)深入探索。

[1]李銀鵬,朱惠明,吳本華.C57BL/6J小鼠原位肝癌模型的建立及高頻超聲對(duì)原位癌的監(jiān)測(cè)[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2010,19(2): 145-147.

[2]李軍,李福濤,開(kāi)麗,等.采用HepG2細(xì)胞株建立裸鼠肝癌模型的方法[J].四川生理科學(xué)雜志,2002,24(2):80-81.

[3]王錦波,何振平.大鼠移植性肝癌膽道轉(zhuǎn)移模型的建立[J].肝膽外科雜志,1999,7(1):69.

[4]邵成偉,王培軍,田建明,等.直接注射法制作大鼠肝癌模型[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2002,18(8):731-732.

[5]李文新,張秀敏,胡沛臻,等.免疫重建荷人高轉(zhuǎn)移肝癌SCD鼠模型的建立及其鑒定[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009,17(8):1415-1418.

[6]楊林,李祖茂,周翔平.兔VX2肝癌動(dòng)物模型的建立[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,25(2):156-159.

[7]Niemann H,Kues WA.Application of transgenesis in livestock for agriedtttre and biomedicine[J].Animal Reprod Sci,2003,79(3-4): 291-317.

[8]陳潤(rùn)濤,陳秉,夏源,等.性別對(duì)荷H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué),2008,35(4):283-285.

[9]姚楨譯.肝硬化與肝癌的性別差異[J].日本醫(yī)學(xué)介紹,2001,22(5): 223-224.

[10]于楠,張喆,郭佑民.雌激素及其受體對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2012,20(11):2438-2442.

[11]Ogawa T,Higashi S,Kawarada Y,et al.Role of reactive oxygen in synthestic estrogen induction of hepatoellular carcinomas in rats and preventive effect of vitamins[J].Carcinogenesis,1995,16(4): 831-836.

[12]王文奇,吳洪文,徐瀚峰,等.肝癌細(xì)胞株雌二醇與uPAR表達(dá)的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)信息,2005,18(10):1341-1342.

[13]Slattery ML,Ballard-Barbash R,Edwards S.Body mass index and colon cancer:An evaluation of the modifying effects of estrogen (United States)[J].Cancer Causes Control,2003,14(1):75-84.

[14]王永倉(cāng),許戈良,英衛(wèi)東,等.生理性雌激素對(duì)大鼠肝癌生成的保護(hù)作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,28(7):1105-1106.

[15]Naugler WE,Sakurai T,Kim S,et al.Gender disparity in liver cancer due to sex differences in MyD88-dependent IL-6 production[J].Science,2007,317(5834):121-124.

[16]Naugler WE,Sakurai T,Kim S,etal.Is inerleukin-6 a gender-specific risk[J].Hepatology,2007,46(4):1304-1305.

[17]Wands J.Hepatocellular carcinoma and sex[J].N Engl J Med,2007, 357(19):1974-1976.

[18]Prieto J.Inflammation,HCC and sex:IL-6 in the centre of the triangle[J].JHepatol,2008,48(2):380-381.

[19]Kaido T,Oe H,Imamura M.Interleukin-6 angments hepatocyte growth factor-induced liver regeneration;involvementof STAT3 activation[J].Hepatogastroenterology,2004,51(60):1667-1670.

Gender difference of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell xenografts in BALB/C nude mice.

ZHANG Li-na1,LIN Mei-gui2,LIU Tao-li3,GU Yue-yu4,LIAO Xiao-zhong4,TAO Lan-ting4,MO Sui-lin4.1.Department of Traditional Chinese Medicine,the Sixth Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510655,Guangdong,CHINA; 2.Yuexiu District Health Bureau,Guangzhou 510000,Guangdong,CHINA;3.Department of Traditional Chinese Medicine, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Zhuhai 519000,Guangdong,CHINA;4.Department of Traditional Chinese Medicine,the FirstAffiliated Hospitalof Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,CHINA

Objective To study the effectof gender on the tumorigenicity and growth trend after human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were inoculated into BALB/C nude mice.MethodsEighteen 4-6 weeks'old BALB/C nude mice were divided into two groups(male group and female group)according to the gender,with 9 in each group. All the nude mice scapular were inoculated with 0.2 mL HepG2 cells in logarithmic growth phase and at the concentration of 1×107/mL.After 10 days,the tumor formation of the two groups was observed,and the tumor volume was measured.ResultsThe number of tumorigenicity model in female group was 4,and tumorigenicity rate was 44.44%.The number of tumorigenicity modelin male group was 9,and tumorigenicity rate was 100.00%,with statistically significant difference(P=0.029).The transplanted tumor volume trend figure of the successfulmodelshowed thatthe tumor growth in male group was higher than thatin the female group.ConclusionTumorigenicity rate and growth rate of transplanted tumor have obvious gender difference after human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were inoculated into BALB/ C nude mice.

HepG2;Tumorigenicity;Gender;Nude mice

R-332

A

1003—6350（2017）09—1380—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.002

2016-12-09)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81274135）

莫穗林。E-mail：mosuilin cadd@hotmail.com