李佩佩，劉韶，文琪，麥?zhǔn)犁?，張俊?/p>

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；2.海南醫(yī)學(xué)院，海南 海口 571199）

LC-MS/MS定性分析大鼠尿液中益智提取物的成分及其代謝產(chǎn)物

李佩佩1，劉韶1，文琪2，麥?zhǔn)犁?，張俊清2

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；2.海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199）

目的 通過LC-MS/MS法檢測大鼠尿液中益智提取物中10種活性成分的存在形式。方法采用LC-MS/MS法檢測灌胃給藥后0～4 h、4～8 h、8～24 h大鼠尿液中的益智代謝產(chǎn)物，與給藥前大鼠空白尿液MRM圖進(jìn)行比對。結(jié)果實驗組大鼠尿液中9種主要活性成分均以原形化合物的形式存在，而未發(fā)現(xiàn)山柰酚及其葡萄糖酸代謝產(chǎn)物。結(jié)論大鼠灌胃益智提取物后，益智活性成分在大鼠尿液中的物質(zhì)形式以原形為主，為理解這些物質(zhì)在大鼠體內(nèi)的消除途徑提供部分參考依據(jù)。

益智提取物；尿排泄；定性分析；LC-MS/MS

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明益智(Alpinia oxyphylla Miq.)有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、神經(jīng)保護(hù)、改善記憶、抗腫瘤等顯著生物學(xué)活性，但目前對益智的研究主要集中在化學(xué)成分、毒理、藥理藥效研究等方面，對于益智在體內(nèi)的研究則相對較少[1-5]。中藥成分的復(fù)雜性及其質(zhì)量的難控性，使得中藥分析方法必須具有高的靈敏度、強的抗干擾能力等特點。LC-MS/MS技術(shù)具有抗干擾能力強、分析速度快、定性能力強、檢測靈敏度高等優(yōu)點，不僅可以快速鑒定中藥中的己知化學(xué)成分，還能檢測出未知化學(xué)成分[6-7]。因此，通過LC-MS/MS技術(shù)研究益智提取物在大鼠尿液中代謝物的種類，為益智提取物在體內(nèi)的代謝途徑研究及其后續(xù)的定量分析提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 AB-SCIEX API 4000+串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，美國AB公司；Prominence UFLC液相色譜儀，LC-20AD雙泵系統(tǒng)，DGU-20A3R在線脫氣機，SIL-20AHT自動進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，均島津公司；Phenomenex Kinetex 2.6μm XB-C18色譜柱，廣州FLM科學(xué)儀器有限公司；Lab Tower EDI15系統(tǒng)，Thermo Scientific公司。

1.2 試藥與試劑

1.2.1 試劑及標(biāo)準(zhǔn)品 諾卡酮(Nootkatone)，Sigma chemical公司；益智酮甲(Yakuchinone A)、益智酮乙(Yakuchinone B)、益智醇(Oxyphyllacinol)，上海凱方醫(yī)藥科技公司；山柰素(Kaempferide)、山柰酚(Kaempfer-ol)，曼斯特生物科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品楊芽黃素(Tectochrysin)，白楊素(Chrysin)，伊砂黃素(Izalpinin)，芹菜素-4'，7-二甲氧醚(5-Hydroxy-4'，7-dimethoxy-flavone)由本課題組從益智中分離制備，通過UV、NMR和MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，用HPLC-DAD-MS進(jìn)行純度測定，其純度均在98%以上。每個標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇配制為1 mg/mL的溶液，-40℃避光貯存。色譜純級甲醇和乙腈，美國天地公司；色譜級甲酸，上海阿拉丁公司；其他化學(xué)試劑(分析級或以上級別)，海南詣高儀器有限公司。

1.2.2 益智提取物 獲得益智提取物，通過LC-MS/MS法測得每毫克的益智提取物中含有82.8μg諾卡酮、28.3μg益智酮甲、0.12μg益智酮乙、21.1μg益智醇、1.499μg楊芽黃素、0.14μg白楊素、0.07μg伊砂黃素、1.46μg芹菜素-4',7-二甲氧醚、0.12μg山柰素。

1.3 實驗動物 15只健康成年雄性SD大鼠，等級為優(yōu)，體質(zhì)量約為350 g，由長沙東創(chuàng)實驗動物服務(wù)部提供。于溫度為22℃～26℃，濕度50%～70%條件下飼養(yǎng)，試驗前禁食12 h自由飲水。常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，無不良反應(yīng)者進(jìn)入實驗。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 使用phenomenex Kinetex 2.6 μXB-C18色譜柱(2.10 mmi.d.×50 mm)進(jìn)行樣品的分離分析，柱溫40℃；流動相為含0.1‰甲酸的水(A相)-含0.1‰甲酸的乙腈(B相)；洗脫梯度：0～1 min為0% B，1～1.01 min B相從0迅速增加到30%，1.01～10 min B相從30%緩緩增加到100%，10～10.01 min從100%回到0，10.01～15 min維持在0%B進(jìn)行平衡；流速為0.35 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 ESI(+)模式，噴霧電壓5 500伏，GS1為55 psi，GS2為55 psi，簾氣為25 psi，噴霧溫度為550oC。采用RMR模式進(jìn)行掃描，每個離子對的掃描時間為20 ms，見表1、表2。

表1 10種化合物的檢測離子對

表2 上述9種化合物二相代謝產(chǎn)物（葡萄醛酸化代謝物）的檢測離子對

1.4.3 動物試驗方案 取益智提取物流浸膏，加入少量吐溫80助溶，用純水分別配置成0.09 g/mL、0.27 g/mL、0.81 g/mL的混懸液。動物實驗前1 d進(jìn)行抓拿適應(yīng)性實驗，置于代謝鼠籠中適應(yīng)1 d，收集空白尿樣品。15只大鼠灌胃給予益智提取物混懸液，給藥體積為1.00 mL/100 g，給藥劑量為8.1 g/kg。放入代謝籠內(nèi)，收集給藥后0～4 h、4～8h、8～24 h尿液，置于-80℃冰箱存至分析。

1.4.4 尿液樣品處理 分別取200μL尿液樣品，加入600μL甲醇，振搖后放在漩渦振蕩器上震蕩(1 500 r/min)提取10 min，13 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，在37℃條件下N2吹干。用50μL甲醇復(fù)溶上述N2吹干的含有待分析成分的樣品，再在振蕩器上震蕩(1 500 r/min)提取5 min，13 000 r/min離心5 min，吸取45μL，供LC-MS-MS分析用。

2 結(jié)果

收集3個時間段的大鼠尿液樣品經(jīng)處理后，分別通過LC-MS/MS法檢測，再將3個時間段大鼠尿液中的益智提取物及其代謝產(chǎn)物保留時間的MRM圖合并，并依次和圖1中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間進(jìn)行對比。發(fā)現(xiàn)實驗大鼠尿液中益智提取物中除山奈酚外，其他9種活性成分均以物質(zhì)原形存在，并未檢測到相關(guān)的二相代謝產(chǎn)物。

2.1 諾卡酮 大鼠尿液中可檢測到諾卡酮原形物質(zhì)，見圖2(tR為6.06，圖1)。

2.2 益智酮甲及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)益智酮甲原形化合物，見圖3A(tR為5.95 min，圖1)，未發(fā)現(xiàn)益智酮甲-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖3B。

2.3 益智酮乙及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中存在益智酮乙原形化合物，見圖4A(tR為5.90 min，圖1)，未發(fā)現(xiàn)益智酮乙-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖4B。

2.4 益智醇及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)益智醇原形物質(zhì)，見圖5A，未發(fā)現(xiàn)益智醇-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖5B。

2.5 楊芽黃素及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)楊芽黃素原形物質(zhì)，見圖6A(tR為5.86 min，圖1)，未發(fā)現(xiàn)楊芽黃素-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖6B。

2.6 白楊素及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)白楊素原形物質(zhì)，見圖7A(tR為4.52 min，圖1)，未發(fā)現(xiàn)白楊素-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖7B。

2.7 伊砂黃素及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)伊砂黃素原形化合物，見圖8A(tR為5.98 min，圖1)，未發(fā)現(xiàn)伊砂黃素-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖8B。

2.8 芹菜素-4',7-二甲氧醚及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)芹菜素-4'，7-二甲氧醚原形化合物，見圖9A(tR為5.91 min，圖1)，未發(fā)現(xiàn)芹菜素-4'，7-二甲氧醚-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖9B。

2.9 山柰素及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)山柰素原形物質(zhì)圖，見10A(tR為4.69 min，圖1)，未發(fā)現(xiàn)山柰素-葡萄糖醛酸化代謝物，見圖10B。

2.10 山奈酚及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物 在大鼠尿液中未發(fā)現(xiàn)山奈酚原形化合物，見圖11A(tR為3.69 min，見圖1)及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，見圖11B。

圖1 益智10種活性成分標(biāo)準(zhǔn)品保留時間（tR）

圖2 大鼠尿液中諾卡酮(Nootkatone)的MRM圖

圖3 大鼠尿液中益智酮甲和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

圖4 大鼠尿液中益智酮乙和其葡萄糖代謝物的MRM圖

圖5 大鼠尿液中益智醇和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

圖6 大鼠尿液中楊芽黃素和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

圖7 大鼠尿液中白楊素和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

圖8 大鼠尿液中伊砂黃素和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

圖9 大鼠尿液中芹菜素-4'，7-二甲氧醚和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

圖10 大鼠尿液中山柰素和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

圖11 大鼠尿液中山奈酚和其葡萄糖醛酸化代謝物的MRM圖

3 討論

本文旨在研究大鼠灌胃給藥益智提取物后目標(biāo)成分在大鼠尿液中的存在形式。此前的研究表明，益智中的包括二芳基庚烷類、黃酮類等9種代表性成分在大鼠血漿中主要以葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式存在[8]。借助LC-MS/MS技術(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖譜的比對，證實大鼠尿液中存在濃度較低的原形物質(zhì)，并未檢測到二相結(jié)合代謝產(chǎn)物。由于二芳基庚烷類成分、黃酮類成分等生物利用度普遍偏低，再加上部分通過膽汁排泄的形式進(jìn)入腸道，除去重吸收的部分，大部分從糞便中消除[5]。因此推測這些成分在尿中的濃度處于較低水平。為實現(xiàn)有效檢測的目的，樣品處理時采用了高劑量給藥下收集的不同時段的尿液，經(jīng)甲醇沉淀經(jīng)離心后得到上清液再吹干復(fù)溶。試驗中發(fā)現(xiàn)復(fù)溶溶劑對目標(biāo)成分的分析產(chǎn)生了不同的影響，這對同類物質(zhì)的分析具有一定的借鑒作用。

本文僅對大鼠灌胃給藥后益智中的代表性成分在尿液中的物質(zhì)形式進(jìn)行了定性分析，這些物質(zhì)的經(jīng)腎的排泄比例尚待進(jìn)一步研究。

[1]李倩.中藥益智仁的化學(xué)成分研究[D].昆明:云南中醫(yī)學(xué)院,2014.

[2]彭璐,白夢娜,譚睿,等.益智的研究概況及進(jìn)展[J].中國藥業(yè), 2015,24(23):12-15.

[3]張俊清,王勇,陳峰,等.益智的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(2):280-287.

[4]李海龍,魏娜,羅喻超,等.益智根莖的抗腫瘤活性成分研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(8):1833-1835.

[5]秦貞苗,李海龍,譚銀豐,等.大鼠灌胃縮泉方制劑后尿、糞中的益智活性成分及代謝物的測定[J].海南醫(yī)學(xué),2014,25(23):3433-3436.

[6]肖日平.基于UPLC-MS/MS的附子中六種生物堿含量分析及藥代動力學(xué)研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[7]姜艷彬,單吉浩,王瑩,等.LC-MS/MS技術(shù)在藥物代謝研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].藥物分析雜志,2014,14(3):385-391.

[8]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Identification of known chemicals and their metabolites from Alpinia oxyphylla fruit extract in rat plasma using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/ MS)with selected reaction monitoring[J].J Pharm Biomed Anal, 2014,97:166-177.

LC-MS/MS-based qualitative analysis of the main substances and metabolites of Alpinia oxyphylla extract in rat urine after intragastric administration.

LI Pei-pei1,LIU Shao1,WEN Qi2,MAI Shi-ying2,ZHANG Jun-qing2. 1.Xiangya Hospital School of Medicine,Central South University,Changsha 410008,Hu'nan,CHINA;2.Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the existing form of the 10 main active compounds of Alpinia oxyphylla extract in rat urine by liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)after oral administration.MethodsThe metabolites of of Alpinia oxyphylla extract in urine of rats 0-4 h,4-8 h and 8-24 h after dosing were detected by LC-MS/MS method,which was used to compare with the multiple reaction monitoring(MRM)mode of rat urine samples before dosing.ResultsThe nine active compounds detected in real rat urine samples were parent forms in rats after oral administration of Alpinia oxyphylla extract,and no kaempferoland its metabolites of gluconic acid were found.ConclusionThe main substances detected in urine were parent forms of Alpinia oxyphylla extract in rats after administration,which can provide the references to understand the elimination of these substances in rats.

Alpinia oxyphylla extract;Urinary excretion;Qualitative analysis;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2017）09—1450—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.027

2016-12-20)

劉韶。E-mail：545272666@qq.com