檀鵬輝，袁麗麗，樊波，于安東，董笛，滕珂*，晁躍輝*

(1.北京林業(yè)大學草坪研究所，北京 100083； 2.深圳市國藝園林建設有限公司，廣東 深圳 518038)

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日本結縷草滯綠基因ZjSGR對煙草的轉化及功能分析

檀鵬輝1，袁麗麗2，樊波2，于安東1，董笛1，滕珂1*，晁躍輝1*

(1.北京林業(yè)大學草坪研究所，北京 100083； 2.深圳市國藝園林建設有限公司，廣東 深圳 518038)

SGR基因是植物體內調控葉綠素降解的關鍵基因之一，在調控植物衰老以及響應非生物脅迫等方面也發(fā)揮著重要的作用。 本研究利用 DNA 重組技術，構建 35S::ZjSGR:YFP植物表達載體，并通過農桿菌介導的方法成功轉化煙草。PCR 和 qRT-PCR 結果顯示日本結縷草滯綠基因ZjSGR已整合到煙草基因組中，并能夠在轉基因煙草中高效表達。在正常生長環(huán)境下，轉基因煙草表現(xiàn)出黃化的表型。與對照相比葉綠素含量較低，光合速率下降。亞細胞定位實驗證明ZjSGR定位在葉綠體，透射電鏡觀察結果表明過表達ZjSGR基因使葉綠體發(fā)育異常,且有加速降解的趨勢。qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)轉ZjSGR基因的煙草中SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表達量明顯高于野生型，衰老進程明顯加快。本研究證明ZjSGR可在調控葉綠素降解和衰老的進程中發(fā)揮重要作用。

日本結縷草；滯綠基因；轉基因煙草；葉綠素；衰老

植物由成熟到衰老的過程中，發(fā)生的最顯著的一個變化是葉綠素降解，葉片變黃。因為草坪草的坪觀質量很大程度上決定了其市場定價，因此衰老一直是草地植物研究的重點方向之一[1]。研究表明，滯綠蛋白(STAY-GREEN)的調控是一種不同于PAO(脫鎂葉綠酸a加氧酶)途徑的重要方式，可調節(jié)葉綠體中的多個生化反應，在植物葉綠素降解和衰老過程中發(fā)揮著重要作用[2]。隨著滯綠突變體的發(fā)現(xiàn)，滯綠基因的功能及調控機理在水稻(Oryzasativa)[3]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[4]、苜蓿(Medicagotruncatula)[1]和番茄(Solanumlycopersicum)[5]等模式植物和作物中得以深入開展。擬南芥nye1-1滯綠突變體與野生型相比表現(xiàn)出綠期延長的表型，而過表達擬南芥AtNYE引起葉片黃化，加速衰老[4]；苜蓿sgr滯綠突變體與對照相比在黑暗處理后可保持更長的綠期，并且衰老程度較低[1]；SlSGR1可直接與SlPSY1基因互作調控番茄紅素合成，而RNA干擾SlSGR1延緩番茄果實成熟，使番茄儲存壽命延長[5]。然而，目前為止對日本結縷草滯綠基因的認識只有北京林業(yè)大學草坪研究所前期在擬南芥中做的初步探索[6]，其在調控葉綠素降解和衰老中的確切功能尚未明確，有必要進一步利用轉基因的方法進行深入研究。

結縷草(Zoysiajaponica)是我國草坪草的瑰寶，具有抗性強和養(yǎng)護費用低等優(yōu)點，非常適用于高爾夫球場、足球場、城市園林綠化等[7]。但結縷草的綠期較短，直接影響到其使用價值，極大地制約了在我國北方地區(qū)的大面積推廣應用[7-8]。結縷草育種的一個主要目標就是培育綠期長、品質好的品種，除傳統(tǒng)育種的方法之外，基因工程育種技術的不斷發(fā)展為這一目標的實現(xiàn)提供了可能。本研究在前期研究的基礎上克隆了日本結縷草ZjSGR基因,構建植物表達載體并利用農桿菌介導的方法成功轉化了煙草。對轉基因煙草的表型特征、生理指標和相關基因的表達模式進行了分析，為研究該基因在調控葉綠素降解和衰老方面的作用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本試驗于2014年7月—2016年9月在北京林業(yè)大學草坪研究所進行，試驗中所用日本結縷草品種‘Zenith’的種子購自美國Hancock公司，煙草(Nicotianatabacum)野生型品種由本實驗室保存。DNA、RNA提取試劑盒購自OMEGA公司。反轉錄試劑盒、限制性內切酶、T4連接酶和SYBR Mix購自TaKaRa公司。大腸桿菌感受態(tài)DH5α和T1克隆載體購自北京全式金公司，PCR Mix購于康為世紀公司。農桿菌LBA4404以及3302Y載體為本實驗室保存，其他試劑采用進口分裝或國產分析純。

1.2ZjSGR植物表達載體的構建

根據ZjSGR基因序列(KP148819)，設計一對帶酶切位點的引物ZjSGR-F(5′-cctCCATGGATGGCTGCGGCCATTTCGGC-3′)和ZjSGR-R(5′-cctACTAGTCTGCTGCGTCTGGCCAG-3′)(劃橫線部分分別為限制性內切酶NcoⅠ和SpeⅠ酶切位點)擴增基因完整編碼區(qū)。利用NcoⅠ和SpeⅠ對3302Y載體和上一步獲得的PCR產物進行雙酶切，純化之后利用T4連接酶連接，并轉化大腸桿菌。對測序正確的菌液提取質粒并保存。利用凍融法將構建好的質粒轉化農桿菌LBA4404，挑取陽性菌落測序并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 煙草的轉化及篩選

通過農桿菌介導，采用葉盤法將3302Y-ZjSGR整合到煙草基因組。對生長1個月的煙草打取葉圓片進行侵染，侵染后的葉片共培養(yǎng)3 d后轉移到生芽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，促使其生芽，每2個星期換板。待其芽長至1 cm左右，將芽割下并轉移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，促使其生根。待到根系發(fā)育到適宜程度，將其移栽于盆中，25 ℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)。本研究所采用的共培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基配方分別如下：MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+6 g/L Agar、MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+300 mg/L Cef+3 mg/L Basta+6 g/L Agar、1/2 MS+0.2 mg/L NAA+300 mg/L Cef+3 mg/L Basta+6 g/L Agar。

1.4 再生植株檢測

采用CTAB法提取基因組DNA，以3302Y通用引物(3302Y-F:5′-TGACGCACAATCCCACTATCCTT-3′;3302Y-R: 5′-CCGTCCAGCTCGACCAGGAT-3′)進行基因組PCR鑒定；利用Trizol法[6,9]提取總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄獲得第一鏈cDNA。然后以cDNA為模板，qSGR-F和qSGR-R為引物(qSGR-F: 5′-CGTCCACTGCCACATCTCCG-3′；qSGR-R: 5′-CGAACGCCTTCAGCACCACA-3′)，進行qRT-PCR鑒定，篩選T1代轉基因煙草中外源ZjSGR表達量較高的株系用于后續(xù)試驗。利用單拷貝的煙草內源核糖核酸還原酶基因(RNR2)為內參設計引物(RNR2-F：5′-TACCCGTCACTGGGAAAC-3′；RNR2-R：5′-GGAAGCCGTAGAAAGCAC-3′)，以轉基因煙草基因組DNA為模板進行熒光定量分析，確定其拷貝數(shù)[10]。

1.5 轉基因植株形態(tài)、亞細胞定位及葉綠體超微結構觀察

以野生型煙草為對照，T3代轉基因煙草植株正常生長3個月后進行拍照。撕取轉基因煙草葉片表皮細胞，在Leica SP5激光共聚焦顯微鏡下觀察ZjSGR的亞細胞定位情況。取相同生長時期和部位的野生型煙草和轉基因煙草葉片，切成1 mm2小塊后先經2.5%的戊二醛和1%四氧化鋨固定，利用酒精逐級脫水處理后進行包埋，然后用包埋塊做超薄切片，最后用Hitachi HT7700透射電鏡觀察葉綠體超微結構。

1.6 轉基因植株生理指標及基因表達量測定

采用丙酮法提取葉綠素，利用Li-Cor 6400光合儀測定凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Cd)、胞間二氧化碳濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。提取RNA，反轉錄成cDNA后以煙草Actin基因為內參，利用實時熒光定量，按照ΔΔCt的方法[11]測定ZjSGR、NtSAG113、NtSAG12、NtNCED和NtAAO3的相對表達量。所用引物分別為SAG113-F：5′-GGTGCGAACTTCAGACTCCA-3′，SAG113-R：5′-ATTCATCTGGTCGATCCGGC-3′；SAG12-F：5′-CCTATCAAGGACCAAAAGGAATG-3′，SAG12-R：5′-TCACAGTCTACAAGTTCTTGCTCTG-3′；NCED3-F：5′-AGCTTTGGGTCGTCCTGTTT-3′，NCED3-R：5′-AAACCAGCGTTTGCAACTCC-3′；AAO3-F：5′-AGTGCCCCGAGTATGTAGGT-3′，AAO3-R：5′-TCAGTCTTTCGGTTGACGCA-3′；NtACT-F：5′-AGGTTACGCCCTTCCTCAT-3′，NtACT-R：5′-GGACAATTTCCCGTTCAGC-3′。

2 結果與分析

圖1 35S::ZjSGR:YFP酶切鑒定Fig.1 35S::ZjSGR:YFP digested with enzymes

2.1 植物表達載體 35S::ZjSGR:YFP的構建

以ZjSGR-F和ZjSGR-R為引物，擴增ZjSGR的完整ORF，經電泳檢測后可見一條900 bp的片段，符合預期大小，純化回收。利用NcoⅠ和SpeⅠ分別對純化后的3302Y載體和PCR擴增產物進行雙酶切，酶切后的產物純化回收后利用T4連接酶16 ℃過夜連接。連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行菌體PCR驗證。對可以擴增出目的片段的菌體提取質粒送測序公司測序，并用NcoⅠ和SpeⅠ對重組子雙酶切。經1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，從35S::ZjSGR:YFP酶切獲得一條大約900 bp的片段，與預期大小相符(圖1)。測序結果顯示無突變，證明構建的載體可用于后續(xù)的轉基因實驗。大量提取質粒，轉化農桿菌LBA4404。

2.2 轉基因煙草鑒定及篩選

通過農桿菌介導的煙草葉盤轉化法，將經草銨膦篩選后能正常生芽(圖2A)、生根(圖2B)的幼苗移植到培養(yǎng)基質中培養(yǎng)生長(圖2C)。提取煙草基因組DNA，用3302Y載體通用引物進行PCR驗證，電泳結果顯示獲得11棵轉基因陽性植株(圖3)。提取總RNA，反轉錄后用qSGR-F/R進行qRT-PCR驗證，結果顯示ZjSGR在不同株系中均有不同程度的表達，且在OE3和OE6中表達量最高(圖4)。以基因組DNA為模板，qRT-PCR結果表明，OE3和OE6均為單拷貝株系，因此選取這兩個株系用于后續(xù)實驗。

圖2 抗性煙草篩選Fig.2 Selection of resistant N. tabacum A：生芽培養(yǎng) Shoot induction; B: 生根培養(yǎng) Root induction; C: 移栽 Transplantation in soil.

圖3 轉基因煙草PCR鑒定Fig.3 Validation of transgenic N. tabacum CK-:陰性對照Negative control; CK+:陽性對照Positive control; 1-11: 轉基因植株Transgenic tobacco.

2.3 轉基因煙草表型觀察及指標測定

2.3.1 過表達ZjSGR加速煙草葉綠素降解 在相同的生長條件下，OE3和OE6兩個轉基因株系與野生型相比葉片呈現(xiàn)出明顯黃化的現(xiàn)象(圖5)。為研究過表達ZjSGR基因對煙草葉綠素的影響，測定了葉片葉綠素含量，結果顯示野生型煙草的葉綠素含量明顯高于轉基因煙草(圖6)。

2.3.2 ZjSGR定位于葉綠體 利用轉基因煙草，在激光共聚焦顯微鏡下觀察了ZjSGR蛋白的亞細胞定位情況。在激光共聚焦顯微鏡下，葉綠體由于自發(fā)熒光的存在而呈紅色球狀；35S::ZjSGR:YFP呈黃色球狀顆粒，在融合場下能與葉綠體重合，結果表明ZjSGR定位于葉綠體(圖7)。

圖4 轉基因煙草qRT-PCR鑒定Fig.4 qRT-PCR analysis of transgenic N. tabacum OE：轉基因煙草 Transgenic tobacco. 下同 The same below.

圖5 轉基因煙草表型觀察Fig.5 Phenotype observation of transgenic N. tabacum WT：野生型煙草Wild type. 下同 The same below.

2.3.3 過表達ZjSGR使葉綠體結構發(fā)育異常 為研究ZjSGR的過表達是否會引起葉綠體結構的變化，本研究利用透射電鏡(TEM)進行了葉綠體超微結構的觀察。透射電鏡觀察表明，野生型的葉綠體環(huán)繞在細胞內表面且結構比較穩(wěn)定，有明顯的淀粉顆粒，葉綠體基粒片層堆疊緊密、顏色較深。然而，轉基因煙草的葉綠體結構異常，有泡狀化的趨勢。淀粉顆粒不明顯，葉綠體基粒數(shù)目和堆疊層數(shù)較少。透射電鏡結果表明，過表達ZjSGR基因使煙草葉片葉綠體發(fā)育異常，結構穩(wěn)定性遭到破壞(圖8)。

圖6 轉基因煙草葉綠素測定Fig.6 Determination of chlorophyll contents in transgenic N. tabacum 圖中不同字母表示差異顯著(P≤0.05)，下同。Different letters represent significant difference (P≤0.05). The same below.

2.3.4 過表達ZjSGR降低煙草光合效率 經Li-Cor 6400測定，轉基因煙草的凈光合速率明顯低于野生型，OE3和OE6分別約為WT的63.77%和61.93%(圖9)。轉基因煙草的氣孔導度明顯高于WT，OE3和OE6分別是WT的3.73和2.83倍。OE3和OE6轉基因煙草的胞間二氧化碳濃度分別是WT的3.54和3.19倍；蒸騰速率分別是WT的4.56和2.63倍。

圖7 ZjSGR亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of ZjSGR A: 葉綠體自發(fā)熒光 Chloroplast autofluorescence; B: 激發(fā)光下 35S::ZjSGR:YFP 的熒光 Ultraviolet field; C: 融合場 Merged.

圖 8 轉基因煙草葉綠體結構Fig.8 TEM analysis of the ultrastructure of chloroplasts

圖9 轉基因煙草光合指標測定Fig.9 Determination of photosynthesis system in ZjSGR-overexpressing N. tabacum

2.3.5 過表達ZjSGR促進煙草衰老 為研究ZjSGR對轉基因煙草衰老程度的影響，本研究利用實時熒光定量技術分析了SAG113、SAG12、NCED和AAO3的相對表達情況。結果表明，轉基因煙草的這些基因表達量均明顯高于WT(圖10)。其中，OE3和OE6中SAG113的表達量分別是WT的8.88和24.8倍；SAG12的表達量為WT的11.68和23.64倍；NCED為WT的7.21和29.73倍；AAO3為WT的1.58和1.42倍。

圖10 轉基因煙草相關衰老基因的表達量分析Fig.10 Determination of senescence associated genes in ZjSGR-overexpressing N. tabacum

3 討論

目前為止，有關滯綠基因的研究多集中在模式植物和農作物，這些滯綠基因的發(fā)現(xiàn)加深了對葉綠素降解途徑的認識和理解[1,12]。本研究中的日本結縷草滯綠基因ZjSGR編碼區(qū)長831 bp，編碼276個氨基酸殘基，屬于STAY-GREEN超家族。前人的研究表明,SGR基因在調控葉綠素降解和加速植物衰老進程中行使重要的功能，但結縷草SGR基因的功能有待進一步確定。

本研究利用DNA重組技術構建了ZjSGR的植物表達載體，并成功轉化了煙草。對轉基因煙草的形態(tài)及生理生化指標進行了測定，在相同的生長環(huán)境下轉基因煙草與對照相比葉片表現(xiàn)出明顯的黃化現(xiàn)象。葉綠素測定結果證明了過表達ZjSGR基因可加速葉綠素的降解，這與擬南芥[4]、水稻[3]和苜蓿[1]中SGR的研究一致。亞細胞定位觀察結果表明ZjSGR定位于葉綠體，與預測結果一致，且與擬南芥和水稻中滯綠基因的亞細胞定位情況一致[3-4]。透射電鏡觀察結果表明過表達ZjSGR破壞了葉綠體結構的穩(wěn)定性，這與過表達水稻SGR促進了本生煙草葉綠體結構分解的研究結果一致[3]。

葉綠體是植物進行光合作用的場所，并且是植物葉片中蛋白質最富集的細胞器，葉綠體結構的降解會對下游反應產生十分重要的影響[13]。經光合儀測定，轉基因煙草的凈光合速率明顯低于野生型，表明過表達ZjSGR基因抑制了煙草的光合速率。Zhou等[1]利用RNA干擾技術抑制苜蓿SGR基因的表達，從而使得苜蓿光合速率提高，本研究的結果與此一致。轉基因煙草的胞間二氧化碳濃度明顯高于野生型，說明轉基因煙草的光化學和生理生化反應也受到了抑制，這可能與葉綠體結構遭到破壞以及組分發(fā)生降解有關[14]。此外，轉基因煙草的氣孔導度和蒸騰速率明顯高于野生型，說明過表達ZjSGR基因可提高植物的氣孔導度和蒸騰速率，其中的機理還需進一步的研究。

SAG113在衰老組織中高度表達，并可受到內源ABA的誘導，表明SAG113在促進植物衰老過程中可發(fā)揮重要的作用[15]。過表達SAG113可促進擬南芥衰老，并提高葉片失水速度[15]。SAG12僅在衰老葉片中表達，是一個植物衰老的標記基因，其啟動子常用來構建驅動ipt基因的表達載體來調控植物衰老[16-17]。NCED是控制ABA合成的一個關鍵基因，而AAO3控制ABA合成的最后一步，在調控植物衰老過程中行使重要的功能[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比轉ZjSGR基因的煙草中SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表達量明顯升高，說明ZjSGR促進了轉基因煙草的衰老進程。

4 結論

本研究成功構建了植物表達載體35S::ZjSGR:YFP，利用農桿菌介導的方法成功轉化了煙草。qRT-PCR結果表明,ZjSGR可在煙草中異源表達，并且轉基因煙草葉綠素加速降解，光合作用受到明顯抑制。亞細胞定位結果顯示ZjSGR定位于葉綠體，透射電鏡觀察實驗進一步證明過表達ZjSGR可促進葉綠體結構降解。過表達ZjSGR提高了SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表達量，加速了轉基因煙草的衰老進程。本研究證明ZjSGR可加速葉綠素降解，促進植物衰老，是調控葉綠素降解和植物衰老進程的一個重要功能基因。

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Functional analysis of the stay-green geneZjSGRfromZoysiajaponicausing transgenicNicotianatabacum

TAN Peng-Hui1, YUAN Li-Li2, FAN Bo2, YU An-Dong1, DONG Di1, TENG Ke1*, CHAO Yue-Hui1*

1.InstituteofTurfgrassScience,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.ShenzhenGuoyiParkDevelopmentsCO.,LTD,Shenzhen518038,China

In green plants,SGRis a key gene with roles in chlorophyll degradation, plant development, senescence, and responses to abiotic stresses. In this study, the coding domain sequence ofZjSGRfromZoysiajaponicawas inserted into the 3302Y vector, yielding the plant expression vector 35S::ZjSGR:YFP, by DNA recombination technology. The construct was introduced into tobacco plants byAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation. The transgenic plants were confirmed to harbor the construct by PCR, and qRT-PCR analyses confirmed thatZjSGRwas successfully heterologously expressed in the transgenic tobacco plants. The transgenic plants showed a rapid yellowing phenotype corresponding to a lower chlorophyll content and lower photosynthetic rate. Subcellular localization analyses showed that ZjSGR was localized in the chloroplasts in stably transformed tobacco plants. Transmission electron microscope analyses revealed that the chloroplasts in transgenic plants showed retarded development and decomposition processes. Analyses of gene transcript levels by qRT-PCR showed that the transcript levels ofSAG113,SAG12,NECD, andAAO3 were higher inZjSGR-overexpressing tobacco plants than in control plants. The results of this study highlight the important roles ofZjSGRin controlling chlorophyll degradation and senescence in plants.

Zoysiajaponica; stay green gene; transgenicNicotianatabacum; chlorophyll; senescence

10.11686/cyxb2016492

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-12-26；改回日期：2017-02-10

深圳市科技計劃項目(JCYJ20160331151245672，JSGG20160229155434792)資助。

檀鵬輝(1993-)，女，河北邢臺人，在讀碩士。E-mail：penghuitan@bjfu.edu.cn*通信作者Corresponding author. E-mail: tengke@bjfu.edu.cn，chaoyuehui@163.com

檀鵬輝, 袁麗麗, 樊波, 于安東, 董笛, 滕珂, 晁躍輝. 日本結縷草滯綠基因ZjSGR對煙草的轉化及功能分析. 草業(yè)學報, 2017, 26(5): 155-162.

TAN Peng-Hui, YUAN Li-Li, FAN Bo, YU An-Dong, DONG Di, TENG Ke, CHAO Yue-Hui. Functional analysis of the stay-green geneZjSGRfromZoysiajaponicausing transgenicNicotianatabacum. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 155-162.