陳冬志，尹曉琳，婁永富，楊飛，王園園，劉嘉琳，孟明，侯明輝

（1.河北大學醫(yī)學部，河北保定071000；2.河北大學附屬醫(yī)院，河北保定071000）

基礎研究·論著

不同劑量鏈脲佐菌素誘導C 57BL/6小鼠1型糖尿病模型的復制與iN KT細胞的檢測

陳冬志1，尹曉琳1，婁永富1，楊飛1，王園園1，劉嘉琳1，孟明1，侯明輝2

（1.河北大學醫(yī)學部，河北保定071000；2.河北大學附屬醫(yī)院，河北保定071000）

目的腹腔注射不同劑量鏈脲佐菌素（STZ）于雌性C57BL/6小鼠，誘導建立與人類1型糖尿病相似的動物模型，研究最適鏈脲佐菌素（STZ）建模劑量。方法35只雌性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（n= 5）和模型一、二、三組（STZ劑量分別為40、50和60 mg/kg），每組10只。模型組連續(xù)5 d腹腔注射不同劑量STZ，測定注射前、注射后1、2、3、4和5周的空腹血糖和體重，小鼠胰島素自身抗體（IAA）陽性率，觀察小鼠飲食、飲水和排尿情況。流式細胞技術（FACS）分析血和脾細胞懸液中恒定自然殺傷T細胞（iNKT）細胞比例；HE染色觀察胰島病理。結(jié)果與對照組比較，模型三組飲水量、進食量和排尿量增加，體重減輕。與對照組比較，模型三組血糖變化明顯，注射STZ后第1周迅速升高，第4周達高峰，隨后下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組3組胰島萎縮，胰島細胞不規(guī)則，數(shù)目減少。模型二組和模型三組IAA陽性率分別達到30%和90%。與對照組比較，模型三組外周血CD4+NK1.1+淋巴細胞和脾CD4+NK1.1+淋巴細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論誘導建立雌性C57BL/6小鼠1型糖尿病模型的最適STZ劑量為60 mg/kg。

1型糖尿??；鏈脲佐菌素；C57BL/6小鼠；恒定自然殺傷T細胞

1型糖尿?。―iabetesmellitustype1，T1DM）是T細胞介導的自身免疫病。主要病理表現(xiàn)為淋巴細胞浸潤性胰島炎，進行性胰島β細胞功能破壞，使其喪失合成和分泌胰島素的功能，從而引起糖代謝紊亂[1-2]。若治療不當或不及時將會產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥進而導致死亡，嚴重影響患者生活質(zhì)量。近年來T1DM發(fā)病率呈現(xiàn)出增長趨勢，由于T1DM的病因、發(fā)病機制尚未完全闡明，預防和治療仍不完善，因此建立較理想的動物模型對研究該病的發(fā)病機制和治療具有重要意義[3]。

近年來發(fā)現(xiàn)，恒定自然殺傷T細胞（invariant nature killer T，iNKT）在自身免疫性疾病中有重要作用，且與T1DM的發(fā)生發(fā)展密切相關。多數(shù)T1DM患者體內(nèi)iNKT細胞的數(shù)量和功能都低于正常水平，治療后隨著病情的緩解而恢復[4-6]，但其機制尚不完全清楚。

鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）是從鏈霉菌中提取出來的一種抗生素，由葡萄糖分子和甲基化氮源部分組成，是誘導糖尿病動物模型的常用藥物之一。STZ誘導糖尿病的發(fā)生及類型與鼠的種系、性別、用藥劑量和次數(shù)有關[7-9]。一般認為，多次小劑量STZ可誘導T1DM，但用藥劑量文獻報道不一[10-13]。本研究采用多次腹腔注射不同劑量的STZ誘導C57BL/6小鼠1型糖尿病，以篩選造模的適宜劑量，同時檢測外周血和脾iNKT細胞的比例，為進一步探討iNKT細胞在T1DM發(fā)病中的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性C57BL/6實驗小鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001]，日齡35～41 d。小鼠飼養(yǎng)于通風、清潔的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級動物室，室溫（23±2）℃，相對濕度（50±5）%，12 h光照和12 h黑暗循環(huán)進行，所有小鼠均自由攝食、飲水。實驗動物嚴格遵守《實驗動物保護條例》，動物處理程序經(jīng)過河北大學醫(yī)學部倫理委員會認證。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（美國Cayman Chemical公司），檸檬酸（C6H5O7H2O）（天津市北方天醫(yī)化學試劑廠），檸檬酸三鈉（C6H5O7Na32H2O）（天津市化學試劑三廠），血糖儀和血糖試紙（湖南省長沙市三諾生物傳感股份有限公司），尿糖試紙（廣東省廣州市花都高爾寶生物技術有限公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（江蘇省無錫市傲銳東源生物科技有限公司），熒光單克隆抗體試劑盒（CD4-FITC）（美國BD Pharmingen公司），胰島素自身抗體（insulin autoantibodies，IAA）試劑盒（北京方程佰金科技有限公司），F(xiàn)ACS Calibur細胞儀（美國BD Pharmingen公司），低溫低速離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 藥品溶液配制STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液氫離子濃度指數(shù)（potential of hydrogen，PH）4.5配制。0.22 μm濾器除菌，避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 動物分組雌性C57BL/6實驗小鼠35只，適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組（5只/組）和模型一、二、三組，模型組每組10只。四組均給予普通飼料，各組分籠飼養(yǎng)，造模前禁食12 h，自由飲水。

1.3.3 糖尿病模型的復制禁食結(jié)束后，正常對照組腹腔注射同體積的0.1 mol/L，pH 4.5檸檬酸緩沖液，模型一、二、三組分別每天1次、連續(xù)5 d腹腔注射40、50和60 mg/kg的1%STZ溶液。每周測量1次空腹血糖，監(jiān)測小鼠體重動態(tài)變化，連續(xù)5周?？崭寡侵颠B續(xù)2周≥11.1 mmol/L為建模成功。

1.3.4 小鼠IAA檢測注射STZ 1周后小鼠眼眶靜脈叢取血，每只采血100 μl，室溫下血液自然凝固，收集血清。酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中IAA，嚴格按試劑盒說明操作。

1.3.5 小鼠體征末次注射STZ后每天觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、毛發(fā)顏色、排尿量及死亡情況等；每天測定各組小鼠的攝食量和飲水量。

1.3.6 小鼠組織取材造模后第5周分別取小鼠眼球血。斷頸椎處死后置于75%乙醇中消毒3 min，將小鼠仰臥位置于解剖盤上，打開腹腔，取出脾組織、胰腺。胰腺組織用75%乙醇沖洗后置于4%甲醛溶液中固定、石蠟包埋用于病理；取脾制成單細胞懸液用于流式檢測脾臟內(nèi)脾iNKT細胞比例；血液上清凍存用于IAA檢測；血細胞用于測試iNKT頻率。

1.3.7 流式細胞術檢測全血iNKT細胞頻率收集各組小鼠各期全血（每只120 μl）置于流式管，牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）阻斷后加入（異硫氰酸熒光素fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的anti-CD4、NK 1.1-PE-NKH各2μl，4℃避光孵育20 min。然后加紅細胞裂解液1 ml，避光8 min，觀察澄清透亮后離心棄上清液，PBS重復洗滌2次，重懸，加PBS定容500 μl，用美國BD FACS公司流式細胞儀Calibur上機檢測，流式細胞分析軟件（FlowJo）進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.8 流式細胞術檢測脾臟CD4+NK1.1+細胞比例斷頸椎處死小鼠，分離脾臟并剪碎，置于200目篩網(wǎng)中央，加PBS液，用注射器針芯研磨，收集過濾的細胞液，1 000轉(zhuǎn)/min，5 min，4℃，離心去上清液，PBS清洗1次。樣品稀釋液重懸脾細胞沉淀，加入含5 ml小鼠淋巴細胞分離液的10 ml離心管中，2 000轉(zhuǎn)/min，15 min，4℃，離心，吸取淋巴細胞，PBS清洗2次，計數(shù)。取1×106細胞，100 μl PBS重懸，取FITC-CD4單抗、PE-NK1.1單抗各2 μl加入每管細胞中，4℃避光孵育25 min后，PBS清洗2次，500 μl PBS重懸，使用流式細胞儀檢測。

1.3.9 小鼠胰腺組織HE染色二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水洗；蘇木素染色15 min，水洗；1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水返藍15 min，水洗；1%乙醇伊紅染色3 min；最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用重復測量的多因素方差分析，陽性率比較用確切概率（Monte Carlo）計算，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體征變化

對各組小鼠日?；顒訝顟B(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組C57BL/6小鼠均表現(xiàn)為毛發(fā)順滑有光澤，精神狀態(tài)良好，反應靈敏。模型組小鼠均有不同程度地表現(xiàn)為活動少，精神萎靡，毛發(fā)黃干欠光澤，易脫毛，反應遲鈍等現(xiàn)象，尤以模型三組最為明顯。模型三組的攝食量和飲水量高于正常對照組；模型三組的墊料比正常對照組的墊料濕度大，多尿癥狀明顯。

2.2 小鼠體重的動態(tài)變化

對照組與模型一組、模型二組、模型三組腹腔注射STZ后1、2、3、4及5周的小鼠體重變化比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的體重比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2372.911，P=0.000）。②對照組與各模型組的體重變化比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=248.281，P=0.000），模型三組小鼠體重與其余各組相比體重增加最少。③對照組與各模型組的體重變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.953，P=0.000）。見表1和圖1。

圖1 不同組小鼠體重隨時間變化趨勢

表1 不同組小鼠各時間點體重比較情況（±s）

表1 不同組小鼠各時間點體重比較情況（±s）

組別例數(shù)0周1周2周3周4周5周對照組5 1 5 . 4 6 ± 0 . 2 1 1 6 . 6 0 ± 0 . 2 0 1 7 . 8 4 ± 0 . 2 4 1 8 . 2 8 ± 0 . 2 3 1 9 . 3 8 ± 0 . 2 6 1 9 . 7 8 ± 0 . 1 5模型一組1 0 1 5 . 4 7 ± 0 . 2 6 1 5 . 9 1 ± 0 . 2 5 1 7 . 2 4 ± 0 . 2 7 1 7 . 6 8 ± 0 . 2 3 1 8 . 7 4 ± 0 . 3 9 2 0 . 0 2 ± 0 . 2 0模型二組1 0 1 5 . 5 1 ± 0 . 2 5 1 5 . 9 3 ± 0 . 1 8 1 6 . 8 6 ± 0 . 1 7 1 6 . 7 0 ± 0 . 2 1 1 8 . 5 8 ± 0 . 2 5 1 9 . 6 9 ± 0 . 2 3模型三組1 0 1 5 . 1 2 ± 0 . 9 6 1 5 . 3 1 ± 0 . 1 0 1 5 . 6 2 ± 0 . 1 4 1 6 . 1 0 ± 0 . 1 0 1 6 . 3 9 ± 0 . 1 0 1 7 . 6 0 ± 0 . 2 1

2.3小鼠空腹血糖變化

對照組與模型一組、模型二組、模型三組腹腔注射STZ后1、2、3、4及5周的空腹血糖濃度變化比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的空腹血糖濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 3 662.117，P=0.000）。②對照組與各模型組的空腹血糖濃度變化比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=996.495，P= 0.000），模型三組小鼠與其余各組比較，空腹血糖濃度值最大。③對照組與各模型組的血糖濃度變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=536.259，P=0.000）。見表2和圖2。

圖2 不同組小鼠空腹血糖濃度隨時間變化趨勢圖

表2 不同組小鼠各時間點空腹血糖濃度比較情況（±s）

表2 不同組小鼠各時間點空腹血糖濃度比較情況（±s）

組別例數(shù)0周1周2周3周4周5周對照組5 6 . 1 4 ± 0 . 1 9 4 . 6 6 ± 0 . 1 9 6 . 6 6 ± 0 . 1 7 7 . 5 6 ± 0 . 1 7 6 . 8 6 ± 0 . 1 4 6 . 5 1 ± 0 . 1 8模型一組1 0 6 . 1 7 ± 0 . 4 8 5 . 1 9 ± 0 . 4 0 6 . 1 2 ± 0 . 4 0 6 . 9 9 ± 0 . 3 9 8 . 0 3 ± 0 . 3 8 4 . 8 7 ± 0 . 4 0模型二組1 0 4 . 4 7 ± 0 . 3 8 6 . 0 9 ± 0 . 1 2 1 0 . 5 1 ± 0 . 4 3 1 1 . 8 6 ± 0 . 2 3 1 5 . 4 2 ± 0 . 3 4 7 . 1 4 ± 0 . 3 4模型三組1 0 4 . 7 0 ± 0 . 2 2 1 0 . 6 8 ± 0 . 4 6 1 6 . 8 5 ± 0 . 4 8 1 9 . 7 0 ± 0 . 6 3 1 6 . 4 4 ± 0 . 3 9 7 . 3 0 ± 0 . 3 1

2.4 小鼠血清中I AA抗體陽性率

陽性率比較采用確切概率（Monte Carlo）計算。造模后第1周，對照組、模型一組、模型二組及模型三組小鼠血清中IAA抗體陽性例數(shù)分別為0、1、3及9只，陽性率分別為0%、10%、30%及90%，四組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00）。兩兩比較結(jié)果：模型三組與對照組比較（χ2=7.813，P=0.005）；模型三組與模型一組比較（χ2=9.800，P=0.002）；模型三組與模型二組比較（χ2=5.208，P=0.022）。

2.5 小鼠胰島組織病理變化

胰島界限清晰，β細胞數(shù)量較多且均勻分布。胰島多為圓形或橢圓形的細胞團，分散于胰腺腺泡之間，組織切片可見胰島組織無淋巴細胞浸潤（見圖3）。胰島明顯萎縮，胰島細胞不規(guī)則，數(shù)目明顯減少，分布稀疏，細胞核固縮。胰島β細胞有空泡變性（見圖3）。

2.6 小鼠外周血C D 4+N K1.1+淋巴細胞亞群比例

與對照組比較，模型二、三組外周血iNKT細胞比例下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型三組下降尤為明顯（見圖4、5）。

圖3 小鼠胰島組織（×400）

圖4 外周血中C D 4+N K1.1+淋巴細胞亞群流式圖

圖5 外周血中C D 4+N K1.1+淋巴細胞亞群條形圖

2.7 小鼠脾細胞懸液C D 4+N K1.1+淋巴細胞亞群比例

與對照組比較，模型二、三組脾細胞懸液中iNKT細胞比例下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型三組下降尤為明顯。見圖6、7。

圖6 脾中C D 4+N K1.1+淋巴細胞亞群流式圖

圖7 脾中C D 4+N K1.1+淋巴細胞亞群條形圖

3 討論

多次低劑量STZ注射誘導的糖尿病最早是在1976年由LIKE等人[14]建立，這種方法能引發(fā)機體對胰島的自身免疫應答，誘導產(chǎn)生自身免疫介導的動物模型，能很好的模仿人類T1DM的癥狀。由于STZ具有半衰期長、造?？焖俜€(wěn)定、中樞選擇性不強、組織毒性較小及致死率低等優(yōu)點[15]，因此被廣泛應用來復制T1DM動物模型。

近來實驗已經(jīng)證明，STZ通過其本身含有的葡萄糖部分結(jié)構(gòu)被胰島B細胞上低親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporters2，GLUT2）轉(zhuǎn)運，可以特異性地作用于胰島B細胞并引起其結(jié)構(gòu)破壞和胰島素分泌功能障礙[16-18]，但關于STZ的用藥次數(shù)和用藥劑量文獻報道不一[19-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠均有不同程度地表現(xiàn)為活動少、精神萎靡、毛發(fā)黃干欠光澤、易脫毛及反應遲鈍等現(xiàn)象，尤以模型三組最為明顯。飲水量和攝食量數(shù)據(jù)顯示，模型三組的攝食量和飲水量高于正常對照組，墊料濕度大，多尿癥狀明顯。小鼠體重的動態(tài)曲線顯示模型三組較其余三組體重增加緩慢?？崭寡亲兓@示，模型一組血糖變化不明顯，模型二組和模型三組注射STZ后第1周開始升高，第4～5周達高峰，隨后下降，尤以模型三組血糖變化明顯。血清中IAA抗體陽性率模型一組為10.00%，模型二組為30.00%，模型三組為90.00%，IAA陽性表明進展為糖尿病的自身免疫傾向，是診斷T1DM的重要參考指標。胰島病理改變顯示正常對照組胰島界限清晰，β細胞數(shù)量較多且均勻分布。胰島多為圓形或橢圓形的細胞團，分散于胰腺腺泡之間，組織切片可見胰島組織無淋巴細胞浸潤。模型三組胰島明顯萎縮，胰島細胞不規(guī)則，數(shù)目減少，分布稀疏，細胞核固縮，胰島β細胞有空泡變性。綜合小鼠一般表現(xiàn)、體重、血糖、自身抗體和胰島病理變化，模型二、三組符合T1DM，造模是成功的，尤以模型三組更為典型，筆者認為T1DM造模STZ最佳劑量是60 mg/kg。但實驗中也觀察到模型二組血糖在注射STZ后第5周達到高峰，隨后開始下降；模型三組血糖在注射STZ后第4周達到高峰，隨后開始下降。由于本實驗只觀察6周，因此，對模型的穩(wěn)定性還需進一步研究。

近年來發(fā)現(xiàn)，iNKT細胞在自身免疫性疾病中有重要作用，且與T1DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關。多數(shù)T1DM患者體內(nèi)iNKT細胞的數(shù)量和功能都低于正常水平[4-6]。本研究還在STZ誘導T1DM模型中觀察iNKT的變化，發(fā)現(xiàn)小鼠外周血和脾細胞懸液iNKT細胞比例下降，與文獻報道情況一致，說明iNKT細胞可能參與STZ誘導T1DM的發(fā)生，這為今后進一步研究iNKT細胞在T1DM發(fā)病中的作用提供一個可借助的模型基礎。

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Study on model of type 1 diabetes in C57BL/6 mice induced by different dose of streptozotocin and detection of iNKT cell*

Dong-zhi Chen1,Xiao-lin Yin1,Yong-fu Lou1,Fei Yang1,Yuan-yuan Wang1, Jia-lin Liu1,Ming Meng1,Ming-hui Hou2
(1.Department of Medicine,Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China;2.The Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China)

ObjectiveTo establish an animal model of type 1 diabetes mellitus similar to human and study the modeling optimal dose of streptozotocin(STZ).MethodsA total of 35 female C57BL/6 mice were randomly divided into control group(n=5)and model group1,2,3(the dose of STZ was 40 mg/kg,50 mg/kg, 60 mg/kg respectively)with 10 mice in each group.By intraperitoneal injection to the model group of different doses of STZ for 5 days.Blood glucose and body weight before and 1,2,3,4,5 weeks after injection were determined.Possitive rate of insulin autoantibodies(IAA)in mice were determined.The conditions of mice eating,drinking and urination were observed.Flow cytometry(FACS)analysis was used to analyze the proportion of iNKT cells in blood and spleen cell suspension.HE staining was used to observe the pathological changes of pancreatic islets.ResultsCompared with the control group,the amount of drinking water,food intake and urine volume were significantly increased,and the weight was significantly reduced in model group 3.Compared with the control group,the change of blood glucose in model group 3 was obvious,and the first week afterinjection of STZ the blood glucose increased rapidly,and reached its peak in the fourth week and then decreased,the difference was significant(P＜0.05).Compared with the control group,the three groups of model group were significantly decreased in the number of islet cells,.The positive rates of IAA in model group 2 and 3 were 30%and 90%respectively.Compared with the control group,the proportion of CD4+NK1.1+lymphocytes in peripheral blood and CD4+NK1.1+lymphocytes in spleen were significantly decreased in model group 3,and the differences were significant(P＜0.05).ConclusionsThe optimal dose of STZ is 60 mg/ kg in inducing and establishing of type 1 diabetes mellitus in female C57BL/6 mice.

Type 1 diabetes mellitus;streptozotocin;C57BL/6 mice;iNKT cell

R587.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.001

1005-8982（2017）08-0001-06

2016-12-14

國家自然科學基金（No：81373197）；河北省自然科學基金（No：H2014201133，No：H2015201131）；河北大學醫(yī)學學科建設項目（No：2014A1001）；國家級大學生創(chuàng)新項目基金（No：201510075030）

孟明，E-mail：mengming127@163.com；Tel：15832213318