秦豫培，胡陽黔

（湖北醫(yī)藥學院附屬東風總醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北十堰442000）

臨床研究·論著

鋅指蛋白217在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義

秦豫培，胡陽黔

（湖北醫(yī)藥學院附屬東風總醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北十堰442000）

目的檢測鋅指蛋白217（ZNF217）在結(jié)腸癌中的表達，分析ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征及結(jié)腸癌患者生存與預后的相關(guān)性。方法利用免疫組織化學方法檢測84例結(jié)腸癌患者組織標本及相應癌旁組織中ZNF217的表達水平，并利用Spearman秩相關(guān)、K-M曲線及Cox比例風險回歸模型等統(tǒng)計方法分析ZNF217在結(jié)腸癌中的臨床相關(guān)性。結(jié)果免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中ZNF217陽性表達率高于癌旁組織。Spearman秩相關(guān)顯示ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，且與其他結(jié)腸癌患者臨床病理特征無相關(guān)性。K-M曲線顯示ZNF217表達水平與結(jié)腸癌患者術(shù)后總體生存率及無進展生存率呈負相關(guān)。Cox風險比例模型顯示ZNF217可作為判斷結(jié)腸癌預后獨立的預測指標。結(jié)論ZNF217在結(jié)腸癌組織中表達升高，且可作為判斷結(jié)腸癌患者生存及預后的獨立的潛在分子指標。

鋅指蛋白217；結(jié)腸癌；生存；預后

結(jié)腸癌是導致腫瘤相關(guān)死亡最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居所有腫瘤的第3位[1]。目前，結(jié)腸癌約占全球新發(fā)腫瘤總例數(shù)的10%，每年新發(fā)患者約為100萬[2]，截至目前，我國約有125萬人被診斷為結(jié)腸癌[3]。結(jié)腸癌患者常由于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機會，肝臟是結(jié)腸癌最主要的轉(zhuǎn)移定位病灶[4]。約50%～60%的結(jié)腸癌患者將發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，該類患者的5年總體生存率一般為5%左右[5-6]。近年來，根治性切除術(shù)后給予患者放化療等綜合性治療手段，已大幅延長結(jié)腸癌患者的5年生存率。然而，目前尚無有效治療方法可降低結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)移及復發(fā)的幾率。結(jié)腸癌的發(fā)病人數(shù)眾多，且缺少有效的治療手段，基于此，目前迫切尋找與結(jié)腸癌發(fā)生及進展相關(guān)的分子靶點。

鋅指蛋白217（zinc-finger protein 217，ZNF217）是庫普佛樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其首次發(fā)現(xiàn)于乳腺癌中，并被證實與乳腺癌的惡性表型及不良預后密切相關(guān)[7-8]。ZNF217在C段編碼8個可預測的C2H2鋅指基序和富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[9-10]。除可調(diào)控乳腺癌的進展外，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，ZNF217在包括胃癌[11]、卵巢癌[12]及前列腺癌等[13]腫瘤的發(fā)生及進展中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在結(jié)腸癌中，ZNF217表達被證實異常上調(diào)，并可促進腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[14]。然而，ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者生存及預后的關(guān)系，相關(guān)研究尚不充分。

本研究通過免疫組織化學方法檢測ZNF217在結(jié)腸癌及癌旁組織中表達，并利用一系列統(tǒng)計學方法及模型，分析ZNF217與結(jié)腸癌患者臨床病理特征、生存周期及預后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，ZNF217在結(jié)腸癌組織中表達升高，且可作為判斷結(jié)腸癌患者生存及預后的獨立的潛在分子指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2001年1月-2007年12月在湖北醫(yī)藥學院附屬東風總醫(yī)院消化內(nèi)科接受手術(shù)、腫瘤組織得到根治性切除并經(jīng)病理證實為結(jié)腸癌的腫瘤組織及癌旁組織標本84例，所有入選患者均持續(xù)隨訪，隨訪截止時間為患者死亡或至5年隨訪截止日，入組患者均具備完整隨訪資料。所有入組患者術(shù)前未進行任何抗腫瘤治療，術(shù)中取腫瘤組織及相應的癌旁組織，經(jīng)石蠟包埋，而后按實驗所需制成組織芯片。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學院附屬東風總醫(yī)院倫理委員會審核并批準，所有入選本研究的結(jié)腸癌患者均簽署知情同意書并同意使用其組織標本用于本項科學研究之中。

1.2 免疫組織化學檢測ZN F217在結(jié)腸癌及癌旁組織中表達

常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。檸檬酸鹽緩沖液高壓修復90 s。30 ml/L過氧化氫孵育25 min，磷酸鹽緩沖液5 min×5次。兔抗人ZNF217-抗（1∶150）4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液5 min×5次。加入聚合物增強劑，37℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液5 min×5次。加入酶標抗兔聚合物放大劑，37℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液5 min×5次。DAB顯色，蘇木素復燃，1 ml/L鹽酸酒精分化，PBS返藍，脫水，透明，封片。結(jié)果判定參照文獻判定方法，每個片子任選10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計陽性細胞百分率及著色程度。免疫組織化學染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師以雙盲的方式完成，兩者不一致的結(jié)果經(jīng)多鏡頭顯微鏡討論得出一致結(jié)果。百分率＜25%、不著色或較淡著色者為陰性，百分率＞35%、適中著色或深著色者為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以數(shù)據(jù)均數(shù)±標準差（±s）表示，用Spearman秩相關(guān)分析各組間計數(shù)資料的差異，用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗分析兩組生存周期之間的關(guān)系，采用Cox風險比例模型各指標與預后的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ZN F217蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達

免疫組織化學結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌患者組織中ZNF217表達上調(diào)，圖1所示為結(jié)腸癌及癌旁組織中ZNF217表達示例，ZNF217陽性染色特征為細胞核與細胞漿內(nèi)棕黃色顆粒狀著色。結(jié)腸癌患者癌組織及癌旁組織兩者之間ZNF217陽性比例分別為47/ 84（55.95%）和5/84（5.95%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=49.130，P=0.000），ZNF217在結(jié)腸癌組織陽性比例高于癌旁組織。

2.2 ZN F217的表達水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

將結(jié)腸癌患者分為ZNF217陽性組及ZNF217陰性組，利用Spearman秩相關(guān)分析ZNF217表達水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示：ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者TNM分期（P= 0.002）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P=0.000）密切相關(guān)，而與其他病理特征無相關(guān)性。見表1。

圖1 ZN F217蛋白在結(jié)腸癌組織期癌旁組織中的表達（×200）

表1 結(jié)腸癌患者不同臨床病理特征癌組織ZN F217陽性表達率的比較

2.3 ZN F217的表達水平與結(jié)腸癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線顯示，ZNF217陽性組的結(jié)腸癌患者的術(shù)后5年總體生存率和無進展生存率均低于ZNF217陰性組（χ2=8.156和5.217，P=0.048和0.019）。

2.4 ZN F217的表達水平與結(jié)腸癌患者預后的關(guān)系

續(xù)表1

利用Cox風險比例模型評估ZNF217表達水平及結(jié)腸癌臨床病理特征對結(jié)腸癌患者生存預期的影響。單因素分析結(jié)果顯示，TNM分期風險比（hazard ratio，HR）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、血管侵襲及ZNF217的表達水平與總體生存預期及無進展生存預期相關(guān)。多因素分析評估結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、血管侵襲及ZNF217表達水平均為結(jié)腸癌患者總體生存預期及無進展生存預期的獨立的判斷預后指標。見表2、3和圖2。

表2 結(jié)腸癌患者總體生存預期的單因素分析及多因素分析

表3 結(jié)腸癌患者無進展生存預期的單因素分析及多因素分析

圖2 結(jié)腸癌患者ZN F217不同表達術(shù)后生存率

3 討論

根據(jù)最新流行病學調(diào)查報告顯示，結(jié)腸癌患者的5年總體生存率僅為47.2%[15]。根治性切除術(shù)、常規(guī)化學治療及放射治療是結(jié)腸癌患者的主要治療手段[16]。然而，結(jié)腸癌患者就診時往往已處于進展期，通常已發(fā)生淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移。因此，鑒定結(jié)腸癌相關(guān)的診斷及治療靶點對改善結(jié)腸癌患者的生存及預后具有重要的意義。在本研究中，通過免疫組織化學技術(shù)檢測結(jié)腸癌及癌旁組織中ZNF217的表達水平，并利用Spearman秩相關(guān)、K-M生存分析及Cox風險比例模型等一系列統(tǒng)計方法分析ZNF217與結(jié)腸癌患者病理特征、生存及預后的關(guān)系，進一步證實ZNF217在結(jié)腸癌中有著極其重要的臨床相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，ZNF217在結(jié)腸癌中的表達水平高于癌旁組織，且結(jié)腸癌組織中ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者的TNMF分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及情況密切相關(guān)。更為重要的是，ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者的5年總體生存率、無進展生存率及預后亦密切相關(guān)。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)ZNF217在卵巢癌中高表達，并可活化PI3K/AKT信號通路而促進腫瘤細胞增殖[17]。此外，ZNF217可促進調(diào)控有絲分裂的重要激酶Aurora-A而調(diào)控乳腺癌細胞的增殖；此外，ZNF217還可通過促進Bcl-2蛋白的降解而抑制紫杉醇誘導的凋亡[18]。ZNF217是20q13.2染色體最為重要的基因之一，而研究證實20q13.2在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者中拷貝數(shù)增加[19]，因此，ZNF217在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者中的表達也可能表達上調(diào)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要機制之一，其主要標志為腫瘤細胞中上皮細胞鈣粘蛋白（epithelial-cadherin，E-cadherin）表達的缺失。而研究證實，ZNF217可抑制腫瘤細胞中E-cadherin的表達，并促進上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變（epithelial-mensenchymal transition，EMT）的發(fā)生，而最終促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[20]，這可能是ZNF217作為癌基因發(fā)揮作用的潛在機制。

值得注意的是，新近發(fā)表的一篇研究報道與本研究類似的結(jié)果，該研究發(fā)現(xiàn)ZNF217在結(jié)直腸癌組織中表達水平高于癌旁組織，且與患者的腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期密切相關(guān)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)沉默結(jié)直腸癌細胞系中ZNF217的表達水平可抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[14]。該研究部分研究結(jié)果與本研究吻合，然而在ZNF217與結(jié)腸癌患者腫瘤體積之間的相關(guān)性上，本研究與該研究結(jié)果出現(xiàn)分歧，其可能的原因是，上述研究分析ZNF217與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性上采用的分析方法為Pearson卡方分析，而本研究采用的分析方法為Speraman秩相關(guān)分析。值得注意的是，上述研究除分析ZNF217的臨床相關(guān)性外，還進行細胞水平的實驗證實ZNF217對結(jié)腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。而本研究未進行相關(guān)機制方面的實驗，這也是本研究的不足，下一步的實驗也將重點關(guān)注ZNF217對結(jié)腸癌細胞功能的影響。而本研究進一步通過K-M生存曲線及Cox風險比例模型分析ZNF217與結(jié)腸癌患者生存及預后的關(guān)系，使本研究可更深入的證實ZNF217與結(jié)腸癌患者的臨床相關(guān)性，對于鑒定結(jié)腸癌預后判斷分子指標方面的研究更有意義。

綜上所述，ZNF217在結(jié)腸癌組織中的表達水平較癌旁組織上調(diào)，上調(diào)的ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。此外，ZNF217的表達水平與結(jié)腸癌患者的5年總體生存率、無進展生存率及預后密切相關(guān)。本研究證實ZNF217在結(jié)腸癌發(fā)生及進展中發(fā)揮著重要的作用，為判斷結(jié)腸癌生存及預后的潛在分子靶點。

[1]JEMAL A,BRAY F,CENTER MM,et al.Global cancer statistics,2012[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians,2011,61(2)：69-90.

[2]CHU E.Colorectal cancer(CRC)continues to be a major public health problem in the United States and throughout the world[J]. Cancer Journal,2010,16(3)：195.

[3]CHEN W,ZHENG R,ZHANG S,et al.Report of incidence and mortality in China cancer registries,2009[J].Chinese Journal of Cancer Research,2012,25(3)：10-21.

[4]ALWAN A.World Health Organization[J].Disaster Medicine and Public Health Preparedness,2007,1(1)：7-8.

[5]VAN C E,CERVANTES A,NORDLINGER B,et al.Metastatic colorectal cancer：ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up[J].Annals of Oncology,2014,19(2)：29-30.

[6]DIN F V,THEODORATOU E,FARRINGTON S M,et al.Effect of aspirin and NSAIDs on risk and survival from colorectal cancer[J].Gut,2010,59(12)：1670-1679.

[7]NONET G H,STAMPFER M R,CHIN K,et al.The ZNF217 gene amplified in breast cancers promotes immortalization of human mammary epithelial cells[J].Cancer Research,2001,61(4)：1250-1254.

[8]COLLINS C,ROMMENS J M,KOWBEL D,et al.Positional cloning of ZNF217 and NABC1：genes amplified at 20q13.2 and overexpressed in breast carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(15)：8703-8708.

[9]COHEN P A,DONINI C F,NGUYEN N T,et al.The dark side of ZNF217,a key regulator of tumorigenesis with powerful biomarker value[J].Oncotarget,2015,6(39)：41566-41581.

[10]VANDEVENNE M,JACQUES D A,ARTUZ C,et al.New insights into DNA recognition by zinc fingers revealed by structural analysis of the oncoprotein ZNF217[J].Journal of Biological Chemistry,2013,288(15)：10616-10627.

[11]SHIDA A,FUJIOKA S,KURIHARA H,et al.Prognostic significance of ZNF217 expression in gastric carcinoma[J].Anticancer Research,2014,34(9)：4813-4817.

[12]SUN G,ZHOU J,YIN A,et al.Silencing of ZNF217 gene influences the biological behavior of a human ovarian cancer cell line[J].International Journal of Oncology,2008,32(5)：1065-1071.

[13]SZCZYRBA J,NOLTE E,HART M,et al.Identification of ZNF217,hnRNP-K,VEGF-A and IPO7 as targets for microRNAs that are downregulated in prostate carcinoma[J].International Journal of Cancer,2013,132(4)：775-784.

[14]ZHANG Z C,ZHENG L Q,PAN L J,et al.ZNF217 is overexpressed and enhances cell migration and invasion in colorectal carcinoma[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention,2015, 16(6)：2459-2463.

[15]ZENG H,ZHENG R,GUO Y,et al.Cancer survival in China, 2003-2005：a population-based study[J].International Journal of Cancer,2015,136(8)：1921-1930.

[16]BOZKURT O,INANC M,TURKMEN E,et al.Clinicopathological characteristics and prognosis of patients according to recurrence time after curative resection for colorectal cancer[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention,2014,15(21)：9277-9281.

[17]HUANG H N,LIN MC,HUANG W C,et al.Loss of ARID1A expression and its relationship with PI3K-Akt pathway alterations and ZNF217 amplification in ovarian clear cell carcinoma[J]. Modern Pathology,2014,27(7)：983-990.

[18]THOLLET A,VENDRELL J A,PAYEN L,et al.ZNF217 confers resistance to the pro-apoptotic signals of paclitaxel and aberrantexpressionofAurora-Ainbreastcancercells[J]. Molecular Cancer,2010,9(1)：1-17.

[19]HIDAKA S,YASUTAKE T,TAKESHITA H,et al.Differences in 20q13.2 copy number between colorectal cancers with and without liver metastasis[J].Clinical Cancer Research,2000,6(7)：2712-2717.

[20]BAI W D,YE X M,ZHANG MY,et al.MiR-200c suppresses TGF-beta signaling and counteracts trastuzumab resistance and metastasis by targeting ZNF217 and ZEB1 in breast cancer[J]. International Journal of Cancer,2014,135(6)：1356-1368.

Expression and clinical significance of ZNF217 in colon cancer

Yu-pei Qin,Yang-qian Hu
(Department of gastroenterology,Dongfeng General Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

ObjectiveTo explore the expression of ZNF217 in tissues of colon cancer(CRC),investigate the association of the expression levels of ZNF217 and clinicopathological features of CRC patients,and analyze the relevance of ZNF217 and survival and prognosis of CRC patients.MethodsExpressions of ZNF217 were analyzed by immunohistochemistry in 84 CRC patients.Spearman's rank test,K-M survival curves,and Cox proportional hazards risk were conducted to analyze the clinical relevance of ZNF217 in CRC.ResultsImmunohistochemistry revealed that the positive rate of ZNF217 was upregulated in CRC tissues comparewithadjacenttissues.SpearmanrankcorrelationshowedthatpositiveZNF217expressionwas significantly associated with TNM stage,lymph node status and venous invasion of CRC patients.Kaplan-Meier curves showed that positive ZNF217 expression was inversely correlated with 5 years overall and progression-free survival time of CRC patients.Cox proportional hazards risk analysis revealed that ZNF217 was an independent prognostic factor for CRC.ConclusionsZNF217 expression is upregulated in tissues of CRC,and ZNF217 is a potential survival and prognosis biomarker in CRC.

ZNF217;colon cancer;survival;prognosis

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.008

1005-8982（2017）08-0038-05

2016-01-25

胡陽黔，E-mai：huyangqian999@163.com