孫海柏，張麗霞，秦中華，郭明日，張東，白虹

（1.天津市醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070；2.天津市海河醫(yī)院，天津300350）

利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)（Xpert M TB/R I F）快速診斷淋巴結(jié)核及其耐藥性

孫海柏1，張麗霞2，秦中華2，郭明日2，張東2，白虹1

（1.天津市醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070；2.天津市海河醫(yī)院，天津300350）

目的探討Xpert MTB/RIF試驗(yàn)在診斷淋巴結(jié)核及其對(duì)利福平耐藥的意義。方法選取156例疑似膿腫性淋巴結(jié)核患者的膿液分別進(jìn)行960液體變色培養(yǎng)基培養(yǎng)、涂片鏡檢、傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)以及Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)，分析Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)MTB及其耐藥性的敏感性和特異性。結(jié)果以液體變色培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)淋巴結(jié)核的敏感性和特異性分別為（95.42%，84.00%），Kappa值為0.77，兩者一致性較好。以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥的敏感性和特異性分別為（70.0%，98.42%）兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Xpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)淋巴結(jié)核及其耐藥性與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較具有較高的敏感性和特異性，并且檢測(cè)時(shí)間短、及時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。

淋巴結(jié)核；利福平耐藥；敏感性；特異性；Xpert MTB/RIF

頸部淋巴結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌侵入頸部淋巴結(jié)所致的一種淋巴結(jié)病變，按病程可分為結(jié)節(jié)型、浸潤(rùn)型、膿腫型及潰瘍型[1]。以膿腫性淋巴結(jié)核最為常見，治療不及時(shí)或不理想結(jié)核桿菌還要破壞掉病變處大量組織甚至骨組織，留下功能障礙，所以尋找及時(shí)準(zhǔn)確快速的實(shí)驗(yàn)室診斷方法至關(guān)重要。利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin,Xpert MTB/RIF）檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌與TB培養(yǎng)法有較高一致性[2]。本文利用目前快速檢測(cè)結(jié)核菌的方法Xpert MTB/RIF對(duì)患者的膿液直接進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其敏感性和特異性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年8月-2016年10月于天津市海河醫(yī)院確診淋巴結(jié)核的住院患者156例：?jiǎn)渭冾i部淋巴結(jié)結(jié)核例58例，淋巴結(jié)結(jié)核合并肺結(jié)核89例，腋窩淋巴結(jié)結(jié)核合并肺結(jié)核2例，腹股溝淋巴結(jié)結(jié)核合并肺結(jié)核7例。納入標(biāo)準(zhǔn)：淺表淋巴結(jié)經(jīng)B超檢查提示淋巴結(jié)有液化、壞死，或肉眼見膿腫和（或）竇道形成未進(jìn)行過(guò)抗結(jié)核治療的首診患者；其中，男性41例，女性115例；年齡17～80歲。

1.2 儀器與試劑

PLR-線性探針雜交酶顯色法診斷試劑盒（Geno Type MTBDR pIus，德國(guó)Hain Life-science公司），Hotstar Taq酶（德國(guó)Qiagen公司），MGIT960液體培養(yǎng)基及藥敏管（美國(guó)BD公司）；Hain GT Blot-48全自動(dòng)雜交儀（德國(guó)Hain Lifescience公司），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（Polymerase chain reaction，PCR）（德國(guó)Hain Lifescience公司），Eppen-dorf 5804R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），生物安全柜（山東省青島市海爾公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

BACTEC MGIT960液體培養(yǎng)及耐藥性檢測(cè)、痰抗酸染色均按照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行操作，線性探針?lè)z測(cè)淋巴結(jié)核及其對(duì)利福平耐藥性，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，配對(duì)計(jì)數(shù)資料χ2檢驗(yàn)，行×列表資料χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Kappa一致性系數(shù)，敏感性及特異性分析。

2 結(jié)果

2.1 患者M(jìn) G I T960液體培養(yǎng)、Xpert M TB/R I F檢測(cè)以及抗酸染色淋巴結(jié)核膿標(biāo)本情況

3種方法所需檢測(cè)時(shí)間分別為（4～8周、2h及2h），陽(yáng)性率分別為（83.90%，82.80%和69.23%），χ2=12.39，P＜0.01以MGIT960液體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測(cè)的敏感性與特異性分別為（95.42%和84.00%），Kappa值為0.77，一致性較好（見表1）。

表1156 例患者M(jìn) G I T960培養(yǎng)檢測(cè)及Xpert M TB/R I F陰陽(yáng)性比較例

2.2 Xpert M TB/R I F法等級(jí)與抗酸染色陽(yáng)性等級(jí)

采用行×列表資料χ2檢驗(yàn)，χ2=72.66，P＜0.01，故兩種檢測(cè)的方法等級(jí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Xpert MTB/RIF“極低”級(jí)中5例抗酸染色為陰性的情況，Xpert MTB/RIF低組“低”級(jí)中6例抗酸染色為陰性的情況，Xpert MTB/RIF“中”級(jí)以及“高”級(jí)中未出現(xiàn)抗酸染色陰性的例數(shù)（見表2）。

表2156 例標(biāo)本抗酸染色法陽(yáng)性級(jí)別與Xpert M TB/R I F法檢測(cè)結(jié)果比較例

2.3 Xpert M TB/R I F技術(shù)與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)?zāi)退幮詸z測(cè)結(jié)果

156例檢測(cè)標(biāo)本以藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)156例菌株的RFP耐藥性，其中有19例標(biāo)本在檢測(cè)中未檢測(cè)出來(lái)，137例標(biāo)本檢測(cè)后敏感性、特異性分別為（70.00%和98.42%），檢測(cè)結(jié)果（χ2=0.50）（見表3）。

表3137 例菌株比例法藥敏試驗(yàn)利福平耐藥性與Xpert M TB/R I F方法利福平耐藥性檢測(cè)比較例

2.4 Xpert M TB/R I F法對(duì)利福平耐藥基因突變位點(diǎn)檢測(cè)

分析線性探針?lè)z測(cè)為陽(yáng)性的9例標(biāo)本耐藥基因突變位點(diǎn)分析結(jié)構(gòu)圖（見表4）。

表4 Xpert M TB/R I F耐藥基因突變位點(diǎn)分析及構(gòu)成比

3 討論

本研究選取肺外結(jié)核中的淋巴結(jié)核病為例，用Xpert MTB/RIF與金標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法MGIT960培養(yǎng)法、抗酸染色法進(jìn)行比較分析，本實(shí)驗(yàn)中抗酸染色的的陽(yáng)性率僅為69.23%較低，傳統(tǒng)結(jié)核菌培養(yǎng)法雖然敏感性及特異性較高，結(jié)核分枝桿菌（結(jié)核桿菌）生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求高，繁殖速度慢所以其檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需4～8周，不能及時(shí)為臨床提供治療依據(jù)，痰涂片對(duì)標(biāo)本含菌量要求高，導(dǎo)致其診斷結(jié)核病的敏感性較低，在MTB培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中敏感性僅為45%～48%[3-6]Xpert MTB/RIF利福平耐藥性遺傳學(xué)基礎(chǔ)是rpoB基因內(nèi)81bp利福平耐藥決定區(qū)（RIF）的突變[7]。Xpert MTB/RIF技術(shù)是利用MTB耐藥性與基因突變有關(guān)的分子機(jī)制，以rpoB基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)引物探針選擇性覆蓋rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)81 bp核心區(qū)，以檢測(cè)標(biāo)本是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及利福平是否耐藥[8]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)僅需要2 h，儀器自動(dòng)檢測(cè)是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）及是否對(duì)利福平耐藥。因此，該方法適合于各種標(biāo)本類型進(jìn)行檢測(cè)，所以對(duì)肺外結(jié)核病的早期診斷及其耐藥性的檢測(cè)占很大優(yōu)勢(shì)。

研究結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF與MGIT960培養(yǎng)法對(duì)于MTB的檢測(cè)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MGIT 960培養(yǎng)和藥敏結(jié)果為參照，Xpert MTB/RIF診斷淋巴結(jié)核的敏感性與特異性分別為（95.42%和84.00%）較高Kappa值為0.77，一致性較好，Xpert MTB/RIF對(duì)利福平檢測(cè)的敏感性/特異性分別為70.00%和98.42%，Kappa值2.54。表明兩種方法對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)具有極好的一致性。與國(guó)內(nèi)穆成等[9]報(bào)道的關(guān)于結(jié)核分支桿菌的檢測(cè)的敏感性90.6%稍微偏低，特異性98.7%相近。

本研究中Xpert MTB/RIF檢測(cè)中與痰抗酸染色比較分析有11例標(biāo)本痰涂片為陰性而Xpert MTB/ RIF檢測(cè)為陽(yáng)性可能與留取的標(biāo)本中捕獲到的結(jié)核菌量較少有關(guān)系。Xpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥性與MGIT960藥敏不一致的情況，可能是由于rpoB區(qū)內(nèi)其他突變所致或者由于其他基因突變導(dǎo)致，理論上標(biāo)本中含有一種以上的MTB混合培養(yǎng)或污染時(shí)，若其中一種具有突變探針未涵蓋的突變，將出現(xiàn)野生型帶型[10]，所以不能完全排除部分突變?yōu)闊o(wú)義突變的原因。

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R522

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.028

1005-8982（2017）08-0137-03

2016-11-01

白虹，E-mail：hongbai25@163.com