張盈嬌，陳 建，夏 陳，鄧俊琳，李艷琳，李 娟

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610066)

高效液相色譜法測定藍(lán)莓葉中綠原酸的含量

張盈嬌，陳 建，夏 陳，鄧俊琳，李艷琳，李 娟

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610066)

采用高效液相色譜法測定藍(lán)莓葉中綠原酸的含量。所用色譜柱為Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，2.5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(體積比為13：87)，檢測波長327 nm。當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度為6～96μg/mL時，以綠原酸對照品溶液的峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)、綠原酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，二者呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=74.15X-432.3，R2=0.999，平均回收率為99.98%，RSD=0.506%(n=6)。按照以上色譜方法檢測了3種藍(lán)莓葉中綠原酸的含量，并與藍(lán)莓果實(shí)中綠原酸的含量比較，結(jié)果顯示，3種藍(lán)莓葉中的綠原酸含量顯著高于對應(yīng)品種果實(shí)中的綠原酸含量(P<0.05)。

HPLC；藍(lán)莓葉；綠原酸

藍(lán)莓果實(shí)中的花青素在保護(hù)視力、改善靜脈等血液循環(huán)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、延緩皮膚衰老方面有顯著作用[1-2]。藍(lán)莓葉中含有豐富的綠原酸、花色苷、多種微量元素等活性成分，但豐富的藍(lán)莓葉并未得到良好得利用[3-4]。綠原酸具有抗菌、抗病毒、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[5-6]，目前，鮮見藍(lán)莓葉中綠原酸的含量分析報道。本文通過對不同品種藍(lán)莓葉中綠原酸的含量測定，與藍(lán)莓果實(shí)中綠原酸的含量比較，為藍(lán)莓葉中綠原酸資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；TG-16S臺式高速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；KH2200DE型數(shù)控超聲清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙酸、磷酸為分析純，超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；藍(lán)莓品種：奧尼爾、圓藍(lán)、密斯特，均采自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所成都市青白江區(qū)科研基地；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號：GZDD-0038，質(zhì)量純度：≥98.731%)，貴州迪大生物科技責(zé)任有限公司。

1.2 方法

(1)檢測波長的選擇：精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 5 mg，用50%的甲醇溶液溶解并定容至50 mL的棕色容量瓶中，混勻，在波長為200～700nm范圍內(nèi)掃描。(2)色譜析條件：色譜柱：Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，2.5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(體積比為13∶87)、流速1mL/min、柱溫25℃、檢測波長327 nm、進(jìn)樣量20μL[7-9]。(3)線性關(guān)系考察：精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇溶解配制成96μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再將其稀釋為48、36、24、12、6μg/mL的溶液，按照1.2.2方法進(jìn)行高效液相色譜法分析。(4)供試品的制備：藍(lán)莓葉于50℃烘干，粉碎，過100目篩，置索氏提取器中40～50℃石油醚脫脂處理，過濾，揮干，精密稱取殘渣約15g，加入25mL甲醇-10%乙酸(85∶15)提取液，于0～4℃勻漿，移入50mL棕色容量瓶，超聲提取30min，定容，離心(12 000r/min)5min，上清液用0.22μm濾膜過濾，按照1.2(2)方法進(jìn)行檢測。

1.3 方法學(xué)考察

(1)精密度試驗(yàn)：取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2中(2)色譜條件連續(xù)檢測6次，以峰面積計算RSD。(2)重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，按照1.2(4)的方法制備5份樣品溶液，按照1.2(2)色譜方法進(jìn)行分析。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2(2)色譜條件，在8h內(nèi)測定5次。(4)加標(biāo)回收試驗(yàn)：精確稱取6份已知含量的同一樣品7.5g分別置于50mL容量瓶中，分別精確加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液25mL(含綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品866.667μg)，用甲醇-10%乙酸(85：15)定容，混勻，按照1.2(2)項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。(5)樣品的測定：將按1.2(4)所述方法制備的供試品溶液注入高效液相色譜儀，測定了3個藍(lán)莓品種葉片中綠原酸的含量(每個品種檢測5批平行樣品)，并與對應(yīng)的藍(lán)莓果實(shí)中的綠原酸含量進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

以波長為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在327nm處有較強(qiáng)的紫外吸收，故選擇327nm作為檢測波長。

2.2 線性關(guān)系

以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程：Y=74.15X-432.3，R2=0.999，結(jié)果表明，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6～96μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖1)。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 供試品檢測

圖2～4結(jié)果顯示，綠原酸與其他組分峰分離良好。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜

2.4 方法學(xué)考察

(1)精密度考察：同一標(biāo)準(zhǔn)品6次檢測結(jié)果的RSD為1.54%，表明該方法精密度良好。(2)重復(fù)性考察：5份樣品以峰面積計算RSD為6.679%，表明該方法穩(wěn)定，重復(fù)性良好。(3)穩(wěn)定性分析：標(biāo)準(zhǔn)品溶液5次檢測結(jié)果以峰面積計算RSD，RSD為2.15%，表明樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定。(4)加標(biāo)回收率結(jié)果：6份樣品加標(biāo)回收后計算回收率。結(jié)果平均回收率為99.98%，RSD=0.506%(n=6)，回收率良好。(5)樣品檢測結(jié)果：樣品檢測結(jié)果表明，3種藍(lán)莓葉中的綠原酸含量與對應(yīng)品種果實(shí)中綠原酸的含量有顯著差異(P<0.05)(附表)。

圖3 藍(lán)莓葉樣品色譜圖

圖4 藍(lán)莓果實(shí)中綠原酸的色譜圖

附表 藍(lán)莓葉和果實(shí)中綠原酸的含量

樣品名稱綠原酸含量(mg/g)奧尼爾葉9 969±0 21?圓藍(lán)葉6 287±0 32?密斯特葉12 124±0 51?奧尼爾果實(shí)0 099±0 004圓藍(lán)果實(shí)0 192±0 025密斯特果實(shí)0 187±0 031

注：*與對應(yīng)品種的果實(shí)有顯著差異(P<0.05)

3 結(jié)論

(1)本研究建立的高效液相色譜法可使雜質(zhì)峰和藍(lán)莓葉樣品峰實(shí)現(xiàn)良好得分離。本方法簡便、穩(wěn)定、可靠、精確，為藍(lán)莓葉中綠原酸含量的分析提供了一個新方法。(2)綠原酸分子式是C16H18O9，其分子具有鄰苯二酚的羧基結(jié)構(gòu)，在植物體中常以鹽的形式存在，提取時以含乙酸的甲醉溶液為提取液，使綠原酸呈分子狀態(tài)而被甲醇完全提取出[10]。(3)樣品含量分析結(jié)果表明，3種藍(lán)莓葉中的綠原酸含量遠(yuǎn)高于果實(shí)中的綠原酸含量?！?/p>

[1]楊貴云，錢炳俊，等.藍(lán)莓品種及提取方法對藍(lán)莓葉生物活性的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2014，32(1)：49-52.

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Quantitative Determination on Chlorlgenic Acid in Blueberry Leaf by HPLC

ZHANG Ying-jiao，CHEN Jian，XIA Chen，DENG Jun-lin，LI Yan-lin，LI Juan

(Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China)

An HPLC method for the quantitative determination of chlorlgenic acid in blueberry leaf was investigated.The operating conditions were Eclipse XDB C18column (250 mm×4.6 mm，2.5 μm)，mobile phase of acetonitrile-0.1%H3PO4(13：87，V/V)，at 1 mL/min and UV detection at 327 nm.There was a good linear relationship between the response and the concentration of sampleat the range of 6～96mg/L for chlorlgenic acid.The corresponding regression equation was Y=74.15X-432.3，R2=0.999.The average recovery was 99.98% and RSD was 0.506% (n=6).The results showed that this method was simple，specific and accurate.According to the above chromatographic method to detect content of chlorlgenic acid in three kinds of blueberry，and compared with the content of chlorlgenic acid in blueberry fruit，the results showed that three kinds of blueberry leaves the chlorlgenic acid content was higher than the content of chlorlgenic acid in fruit.

HPLC；blueberry leaf；chlorlgenic acid

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人才經(jīng)費(fèi)。

張盈嬌(1981— )，女，碩士，研究員，研究方向：功能食品及藥物化學(xué)。

陳建(1969— )，男，博士，研究員，研究方向：功能食(藥)品研究開發(fā)。