章惠萍，易文晶，崔大偉(.杭州市腫瘤醫(yī)院，杭州市第一人民醫(yī)院吳山院區(qū)檢驗科，杭州 0002；2.江蘇大學醫(yī)學院檢驗醫(yī)學系，江蘇鎮(zhèn)江 220；.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，浙江省臨床體外診斷技術(shù)重點實驗室，杭州 000)

·調(diào)查研究·

2013～2016年東部沿海地區(qū)甲型H1N1流感病毒分子特征分析*

章惠萍1，易文晶2,3，崔大偉3
(1.杭州市腫瘤醫(yī)院，杭州市第一人民醫(yī)院吳山院區(qū)檢驗科，杭州 310002；2.江蘇大學醫(yī)學院檢驗醫(yī)學系，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，浙江省臨床體外診斷技術(shù)重點實驗室，杭州 310003)

目的 通過分析東部沿海地區(qū)(江蘇、浙江和上海)甲型H1N1流感病毒[A(H1N1) pdm09]的分子特征，為防控A(H1N1) pdm09流感提供科學依據(jù)。方法 從GISAID數(shù)據(jù)庫中獲得江浙滬地區(qū)2013～2016年分離的A(H1N1) pdm09病毒株和WHO推薦疫苗株的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因序列。運用MEGA6.0軟件分析HA和NA的分子特征、關(guān)鍵氨基酸位點和耐藥位點的變異情況。結(jié)果 進化樹分析顯示江浙滬地區(qū)A(H1N1) pdm09病毒株與WHO參考株的HA、NA基因序列差異較小，與WHO推薦疫苗株A/California/07/2009(H1N1)間的同源性分別為97.0%～99.5%和97.9%～99.6%；與WHO推薦疫苗株A/South_Africa/3626/2013(H1N1)間的同源性分別為98.0%～99.8%和98.6%～99.9%。病毒氨基酸變異分析顯示70株A(H1N1)pdm09病毒的HA蛋白均發(fā)生83位(P83S)、203位(S203T)和321位(I321V)突變，且2016年分離株出現(xiàn)A195V突變；HA的裂解位點未發(fā)生變異，仍為IQSR↓GLF；2013年有2株NA蛋白出現(xiàn)H275Y耐藥位點的變異。結(jié)論 2013～2016年東部沿海地區(qū)A(H1N1) pdm09流感病毒的HA和NA蛋白與WHO推薦疫苗株具有高度同源性，關(guān)鍵的氨基酸位點發(fā)生變異與病毒的毒力及對藥物的敏感性相關(guān)，因此我們要密切關(guān)注A(H1N1) pdm09病毒，防止其再次發(fā)生暴發(fā)。

甲型H1N1流感病毒；分子特征；進化樹；變異

2009年3月，墨西哥和美國等地首次發(fā)生了甲型H1N1流感病毒[A(H1N1)pdm09]流感大流行，流感病毒在隨后的幾個月里迅速蔓延到世界各地[1-2]，此后受到高度關(guān)注。該甲流病毒由人流感病毒、豬流感病毒以及禽流感病毒的基因片段共同重組而成[1,3]。該病毒細胞膜蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)的基因極易發(fā)生抗原漂移，且二者決定的關(guān)鍵的氨基酸位點對病毒的突變和耐藥起決定性作用[4-5]。因此，本研究利用生物信息學方法，對2013年至2016年東部沿海地區(qū)感染A(H1N1) pdm09病毒患者的基因序列進行分子特征和氨基酸變異情況的分析，進而為東部沿海地區(qū)A(H1N1) pdm09流感病毒的防控提供相關(guān)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 從全球禽流感共享數(shù)據(jù)庫(the Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data, GISAID)中下載江蘇、浙江、上海地區(qū)2013～2016年人感染A(H1N1)pdm09病毒的基因序列，同時下載WHO推薦疫苗株A/California/07/2009(H1N1)(作為原始參考株)和A/South_Africa/3626/2013(H1N1)(作為對比參考株)的基因序列。

1.2 方法 采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)version 6.0將下載的序列進行比對，用鄰接法(Neighbour-Jioning, N-J)構(gòu)建HA、NA的氨基酸種系進化樹，采用Bootstrap法(replication=1 000)進行檢驗。同時進行病毒氨基酸比對，分析病毒氨基酸重要位點的變異情況。

2 結(jié)果

2.1 A(H1N1)pdm09病毒代表株同源性和系統(tǒng)進化樹

2.1.1 HA蛋白同源性和系統(tǒng)進化樹 用2013～2016年東部沿海地區(qū)70株A(H1N1)pdm09病毒代表株和2株WHO推薦參考株構(gòu)建HA氨基酸系統(tǒng)進化樹，見圖1。結(jié)果顯示A/California/07/2009(H1N1)參考株與A/Shanghai-Minxing/SWL11041/2015差異最小，同源性為99.5%，同屬組1(Group 1)；A/South_Africa/3626/2013(H1N1)參考株與A/Shanghai-Changning/SWL1621/2013差異最小，同源性為99.8%，同屬組2(Group 2)。Group 1中，各年份各地區(qū)的病毒株均有分布，同源性為98.5%～100%；Group 2中，各年份各地區(qū)病毒株均有分布，同源性為99.4%～100%；組3(Group 3)為浙江和上海地區(qū)近兩年的病毒株，同源性為99.4%～100%。

2.1.2 NA蛋白同源性和系統(tǒng)進化樹 構(gòu)建了A(H1N1)pdm09 病毒代表株的NA蛋白系統(tǒng)進化樹，見圖2。結(jié)果顯示A/California/07/2009(H1N1)參考株與A/Shanghai-Minxing/SWL1660/2013差異最小，同源性為99.6%；A/South_Africa/3626/2013(H1N1)參考株與A/Shanghai-Baoshan/SWL1970/2015差異最小，同源性為99.9%，同屬組3(Group 3)。組1(Group 1)中，各地區(qū)近兩年病毒株均有分布，同源性為99.5%～100%；組3(Group 3)中，各年份各地區(qū)病毒株均有分布，同源性為99.1%～100%。

注：●WHO推薦疫苗株；■上海地區(qū)病毒株；▲浙江地區(qū)病毒株；◆江蘇地區(qū)病毒株。

圖1 A(H1N1)pdm09病毒禽流感HA蛋白系統(tǒng)進化樹

注：●WHO推薦疫苗株；■上海地區(qū)病毒株；▲浙江地區(qū)病毒株；◆江蘇地區(qū)病毒株。

圖2 A(H1N1)pdm09病毒NA蛋白系統(tǒng)進化樹

2.2 HA和NA蛋白關(guān)鍵位點變異情況分析 HA蛋白受體結(jié)合關(guān)鍵氨基酸位點分析：將2013～2016年70株代表株和2株人感染A(H1N1)pdm09病毒參考毒株進行對比，70株病毒株在3個關(guān)鍵位點83位、321位、203位均相對于2009年A/California/07/2009(H1N1)參考株發(fā)生了P83S、I321V、S203T突變；這3個位點與2013年A/South_Africa/3626/2013(H1N1)參考株突變情況相同。值得注意的是，在195位上A/Shanghai-Minxing/1229/2016病毒株發(fā)生A195V突變。東部沿海地區(qū)70株A(H1N1) pdm09切割位點序列均為IQSR↓GLF，與WHO推薦疫苗株相比皆無改變。此外，為了探討70株病毒株對神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物的敏感性和耐藥性，我們對70株A(H1N1)pdm09病毒的NA的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)NA中與耐藥有關(guān)的氨基酸位點有1株發(fā)生H275Y變異，而氨基酸位點S247N均未發(fā)生變異。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)東部沿海地區(qū)病毒株的基因序列和WHO推薦的2株疫苗株高度同源；江浙滬三省的病毒株總體來講各年份各地區(qū)散在分布。HA進化樹可見病毒株與WHO推薦疫苗株處于同一主要分支，表明東部沿海地區(qū)流行的毒株具有代表性，對東部沿海地區(qū)的病毒株進行監(jiān)測可能對及時掌握全國流感流行情況有代表性意義。

流感病毒的致病性與HA抗原決定簇位點的變異最為相關(guān)[5-7]，但只有在HA區(qū)4個以上氨基酸序列中的2～3個抗原決定簇位點發(fā)生替換現(xiàn)象，才能說明該變異具有流行病學意義[7]。此次我們用東部沿海地區(qū)病毒代表株HA基因組序列與WHO推薦的疫苗株進行比較，發(fā)現(xiàn)HA區(qū)的抗原決定簇只有1個氨基酸位點發(fā)生替換，其中涉及了A與V兩個抗原決定簇。有研究顯示，HA中氨基酸位點P83S、S203T、1321V突變在流行早期已經(jīng)成為3個適應(yīng)性突變，并在以后流行的甲型H1N1流感病毒中穩(wěn)定遺傳[6]，本次分析也符合此觀點。因此可以推測東部沿海地區(qū)70株病毒株的HA基因基本處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

通過比較HA的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，分析的70株病毒株在HA切割位點處的氨基酸序列均為IQSR↓GLF，與參考株在HA切割位點處的氨基酸序列相一致。A(H1N1)pdm09流感病毒的組織嗜性由上述關(guān)鍵氨基酸的切割位點決定，該切割位點發(fā)生突變更容易導致高致病性病毒的產(chǎn)生，進而引起更高的發(fā)病率和致死率，然而這70株病毒株不符合高致病性毒株的分子特征[RXR/KR↓GLT(X為堿性氨基酸)][5, 7-9]。這些結(jié)果提示我們東部沿海地區(qū)70株A(H1N1)pdm09均為非高致病性毒株。

為了分析東部沿海地區(qū)的A(H1N1)pdm09毒株的藥物敏感性，我們對病毒耐藥相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點進行了比較。在NA蛋白中，氨基酸S247N與H275Y的任一位點突變均可導致A(H1N1)pdm09流感病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物(如奧司他韋，扎那米韋)的敏感性下降[5,10,11]。在選取的東部沿海地區(qū)流行的70株A(H1N1)pdm09流感病毒中有2株氨基酸位點發(fā)生了H275Y變異，而氨基酸位點S247N均未發(fā)生突變。分析結(jié)果提示，雖然目前東部沿海地區(qū)的A(H1N1)pdm09流感病毒對奧司他韋耐藥現(xiàn)象仍屬罕見，暫不會發(fā)生新型耐藥性流感的暴發(fā)，但是耐藥毒株已經(jīng)出現(xiàn)，需要密切監(jiān)測病毒變化，防止耐藥毒株的進一步擴散和傳播。

迄今為止大多數(shù)A(H1N1)pdm09病毒毒株的抗原特征仍可以由疫苗預防，但是隨著A(H1N1) pdm09流感持續(xù)發(fā)生，臨床在關(guān)注該病毒本地流行進化的同時，也應(yīng)時刻警惕耐藥毒株轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢株的可能性，由此來指導臨床治療用藥，進而有效地預防A(H1N1)pdm09流感的再次暴發(fā)。

本研究對GenBank上登錄的東部沿海地區(qū)甲型流感病毒HA及NA基因的氨基酸序列進行比較，通過進化樹、同源性和基因變異的分析，初步探討甲流病毒H基因與N基因大致的變異趨勢，為防控甲流疫情提供科學依據(jù)。但因甲流毒株在基因庫上登錄的資料并不完全，本研究尚存在著一定的局限性，提示我們在甲流防控工作中應(yīng)加強對病毒基因型變異的監(jiān)測，以便做更全面準確的分析。

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(本文編輯：劉群)

Molecular characteristics analysis of influenza A(H1N1) pdm09 virus in the eastern foreland during 2013-2016

ZHANGHui-ping1,YIWen-jing2,3,CUIDa-wei3
(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,HangzhouCancerHospital,WushanDistrictofHangzhouFirstPeople′sHospital,Hangzhou310002,Zhejiang; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 3.DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,CollegeofMedicine,ZhejiangUniversity,KeyLaboratoryofClinicalInVitroDiagnosticTechniquesofZhejiangProvince,Hangzhou310003,Zhejiang,China)

Objective To provide scientific basis for the prevention and control of influenza A(H1N1) pdm09 influenza by analyzing the molecular characteristics of influenza A(H1N1) pdm09 virus in the eastern foreland(Jiangsu, Zhejiang and Shanghai). Methods The gene sequences of hemagglutinin(HA) and neuraminidase(NA) of influenza A(H1N1) pdm09 virus strains isolated from Jiangsu, Zhejiang and Shanghai regions during 2013-2016 and the vaccine strains recommended by WHO were obtained from the GISAID database. The molecular characteristics and variations of key amino acid sites and drug resistant loci of HA and NA were analyzed by the MEGA6.0 software. Results Phylogenetic tree analysis showed that there were little discrepancies of HA and NA gene sequences between influenza A(H1N1) pdm09 virus strains from Jiangsu, Zhejiang and Shanghai regions and reference strains recommended by WHO, and that the homologies between these isolated strains and reference strain A/California/07/2009(H1N1) were 97.0%-99.5% and 97.9%-99.6%, respectively, and 98.0%-99.8% and 98.6%-99.9% between these isolated strains and reference strain A/South_Africa/3626/2013(H1N1). Viral amino acid variation analysis showed that the mutations of HA protein, including P83S, S203T and I321V, existed in 70 influenza A(H1N1) pdm09 virus strains, and that the A195V mutation was found in the isolated strains from 2016. The cleavage site, IQSR↓GLF, of HA remained no change. In addition, the variation of H275Y resistant locus in NA protein was found in 2 strains from 2013. Conclusion The HA and NA proteins of influenza A(H1N1) pdm09 virus strains from the eastern foreland during 2013-2016 are highly homologous with the vaccine strains recommended by WHO. The variations of key amino acid sites are associated with the virulence of viruses and the sensitivity of drugs. Therefore, we should pay closely attention to the variations of influenza A(H1N1) pdm09 viruses so as to prevent its outbreak again.

influenza A(H1N1) pdm09 virus; molecular characteristics; phylogenetic tree; variation

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(2015KYB149)；浙江省自然科學基金(LY16H200001)；浙江省教育廳項目(Y201534117)。

章惠萍，1985年生，女，技師，大學本科，從事醫(yī)學微生物檢驗工作。

崔大偉，副主任技師，博士，E-mail：cuidawei1978@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.20

R512.5

A

2017-01-04)