代東伶周少明柳國勝文飛球周建利

1. 深圳市兒童醫(yī)院(廣東深圳 518036)；2. 暨南大學(xué)第一醫(yī)院（廣東廣州 510630）

脂質(zhì)代謝相關(guān)基因變異與肥胖兒童非酒精性脂肪肝易感性分析

代東伶1,2周少明1柳國勝2文飛球1周建利1

1. 深圳市兒童醫(yī)院(廣東深圳 518036)；2. 暨南大學(xué)第一醫(yī)院（廣東廣州 510630）

目的探討兒童脂質(zhì)代謝相關(guān)基因變異與非酒精性脂肪肝（NAFLD）易感性。方法納入6～18歲的肥胖伴脂肪肝兒童，進(jìn)行超聲檢查、常規(guī)體檢及生化檢測，并提取外周血 DNA，對36個脂質(zhì)代謝相關(guān)目標(biāo)基因進(jìn)行二代測序，分析這些基因變異與脂肪肝的相關(guān)性。結(jié)果符合納入標(biāo)準(zhǔn)的368例肥胖兒童中檢出NAFLD 183例，占比為49.7%。在肥胖兒童中隨機(jī)選取NAFLD及non-NAFLD各100例，NAFLD兒童的體質(zhì)量、腰圍、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、三酰甘油（TG）、膽固醇、低密度脂蛋白（LDL）和載脂蛋白B（ApoB）均高于non-NAFLD兒童，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；而兩組間天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、載脂蛋白A1（ApoA1）、空腹血糖、胰島素、高密度脂蛋白（HDL）、游離脂肪酸（FFA）以及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；兩組的膽紅素水平均在正常范圍。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，編碼微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)運蛋白（MTTP或MTP）的基因MTTP rs2306986（OR=2.70，95%CI：1.38～5.27）、MTTP rs3792683（OR=7.34，95%CI：2.04～26.50）及編碼含patatin樣磷脂酶域3的基因PNPLA3 rs738409位點變異（OR=2.11，95%CI：1.31～4.48）是影響NAFLD發(fā)生的獨立危險因素。結(jié)論MTTP rs2306986、MTTP rs3792683、PNPLA3 rs738409基因變異可能增加兒童NAFLD易感性。

基因?qū)W； 脂質(zhì)代謝； 非酒精性脂肪肝； 肥胖； 單核苷酸多態(tài)性

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一組疾病，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至可以進(jìn)展為肝細(xì)胞癌[1]。隨著肥胖兒童發(fā)病率增加，NAFLD成為了兒童最常見的肝病之一[2,3]。NAFLD發(fā)病機(jī)制仍不清楚。研究顯示，NAFLD具有遺傳傾向[4]。盡管胰島素抵抗、不健康的飲食及久坐等生活方式被認(rèn)為與脂肪肝相關(guān)，但是針對家族的研究和種族變異等結(jié)果顯示遺傳因素對于兒童脂肪肝具有更重要的決定作用，因為兒童受到諸如疾病時間、不良生活習(xí)慣、其他疾病以及藥物等外界因素影響更少[5]。

脂質(zhì)向肝細(xì)胞內(nèi)流或合成速度超過脂質(zhì)流出或分解速度而導(dǎo)致脂肪變性的發(fā)生[6]。而脂質(zhì)代謝通路涉及胰島素抵抗，脂肪合成、分解，跨膜內(nèi)流，以及脂質(zhì)氧化、過氧化和炎癥細(xì)胞因子釋放等過程。因此，脂質(zhì)代謝通路中任一環(huán)節(jié)基因變異都可能導(dǎo)致兒童脂肪肝的發(fā)生。為了研究脂質(zhì)代謝通路相關(guān)基因變異對兒童NAFLD易感性的影響，本研究選擇影響肝臟脂質(zhì)代謝的重要的基因進(jìn)行測序，包括影響脂質(zhì)合成（ACSs、LPL、TNF、LEP、SREBP、FASN、DGAT、FDFT、PXR），肝臟脂質(zhì)內(nèi)流（FABP、FATP、LEP），脂質(zhì)氧化（ACACB、CYP2E1、DLAT、CIC、PPARs、LEP、ADIPOQ、CPT、LIPE、LIPC、ATGL、PNPLA3、UCP2）以及脂質(zhì)流出（MTTP、PEMT、ApoB100、SREBP-1c）的基因。并根據(jù)其在肝臟脂質(zhì)代謝中的作用以及對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析后挑選出來。

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機(jī)挑選深圳市3所小學(xué)及中學(xué)學(xué)生總共2 236名，年齡6～18歲，進(jìn)行常規(guī)體檢，檢出肥胖兒童。然后采用隨機(jī)、雙盲的方法挑選出NAFLD和non-NAFLD兒童各100例。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡6～18歲；②肥胖標(biāo)準(zhǔn)參照Cole等[7]制定的不同年齡及性別的體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI），見表1；③NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Lin等[8]超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除慢性肝病、長期服藥引起脂肪肝、貧血、甲狀腺功能低下以及其他已知的慢性疾病如乙肝、丙肝、自身免疫性疾病及Wilson病等。

本研究獲得醫(yī)院倫理委員會同意，并與家長簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 體格測量 由經(jīng)驗豐富的專業(yè)人員測量身高（精確到0.1 cm）、體質(zhì)量（精確到0.1 kg）、腰圍（精確到0.1 cm）及血壓。BMI=體質(zhì)量/身高的平方(kg/m2)。1.2.2 生化指標(biāo)檢測 抽取清晨空腹靜脈血5 mL [其中2 mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆胅，檢測肝功能等生化指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、膽紅素以及空腹血糖、胰島素、血脂、載脂蛋白（Apo）A1、ApoB、脂蛋白水平。胰島素抵抗是通過抗胰島素抵抗指數(shù)穩(wěn)態(tài)模式評估法檢測，穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）=空腹胰島素×空腹血糖/22.5。

表1 中國學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查BMI分類標(biāo)準(zhǔn) （kg/m2）

1.2.3 肝臟超聲及氫質(zhì)子磁共振成像檢查 由同一名超聲醫(yī)師進(jìn)行肝臟超聲檢查（Siemens Antares，探頭為 2～5 MHz），由同一名影像科醫(yī)師對超聲圖像進(jìn)行閱圖，該醫(yī)師對研究對象臨床及實驗室結(jié)果均不知情。脂肪肝的評分根據(jù)肝臟脂肪變性及脂質(zhì)浸潤的特點進(jìn)行診斷，包括肝臟回聲質(zhì)地、回聲穿透深度及血管清晰度[8]。超聲診斷為脂肪肝的，進(jìn)一步用氫質(zhì)子磁共振成像確認(rèn)，方法為以肝臟為中心的標(biāo)準(zhǔn)軀干磁共振相控陣列線圈3T成像。然后有2名醫(yī)師采用Osirix閱圖并測算肝臟質(zhì)子密度脂肪分?jǐn)?shù)（proton density fat fraction，PDFF）。

1.2.4 基因檢測 ①脂質(zhì)代謝相關(guān)基因pane（lLMRG panel）：根據(jù)基因在脂質(zhì)代謝通路中的作用及對文獻(xiàn)的分析，找出36個基因設(shè)計成panel。②目標(biāo)基因捕獲測序（target region sequencing，TRS）：EDTA處理的外周血2 mL按照說明書（Qiagen，Valencia，CA）提取基因組DNA。將質(zhì)檢合格的基因組DNA打斷為150～250 bp片段，并純化，末端補平、3’端加“A”、接頭連接，對連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，樣品與探針的雜交，利用單鏈DNA片段與單鏈RNA探針在序列上的互補配對原則，將probe對應(yīng)的目標(biāo)DNA形成DNARNA 雜交體（iGeneTech，China），實現(xiàn)目標(biāo)區(qū)域的雜交，磁珠捕獲，構(gòu)建捕獲目標(biāo)區(qū)域 DNA 文庫。洗滌純化后對捕獲后產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序采用Illumina Hiseq Xten測序儀，下機(jī)原始數(shù)據(jù)為雙端100 bp序列（以下簡稱PE100序列），其中測序質(zhì)量值＞30（即正確率＞99.9%）的堿基在85%以上。質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)利用bwa mem軟件與人類參考基因組（Feb. 2009，hg19，GRCh37）進(jìn)行比對，生成比對BAM文件。利用GATK（Genome Analysis Toolkit）從比對的結(jié)果中進(jìn)行突變篩選，最后對篩選出來的結(jié)果用ANNOVAR軟件進(jìn)行注釋。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2、校正χ2或Fisher精確概率法檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用logistic逐步回歸分析，分析影響NAFLD的主要因素。

2 結(jié)果

表2 兩組研究對象臨床資料及實驗室指標(biāo)比較

2.1 一般資料

共檢出肥胖兒童368例，肥胖率16.46%。在肥胖兒童中進(jìn)行肝臟超聲檢查，檢出NAFLD 183例，占全體調(diào)查兒童的8.2%，占肥胖兒童的49.7%。肥胖兒童中，選擇NAFLD和non-NAFLD兒童各100例，兩組研究對象的一般特點及實驗室結(jié)果見表2。NAFLD兒童的體質(zhì)量、腰圍、ALT、TG、膽固醇、LDL和ApoB均高于non-NAFLD兒童，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），而兩組兒童的性別、年齡、身高、收縮壓、BMI以及各項檢測指標(biāo)（AST、ALP、ApoA1，空腹血糖、胰島素，HDL、FFA、HOMA-IR、總膽紅素和直接膽紅素）的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 基因檢測結(jié)果

對36個基因進(jìn)行測序，共得到79個突變位點，兩組間進(jìn)行比較，其中3個差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，即MTTP rs2306986、MTTP rs3792683和PNPLA3 rs738409。見表3。

表3 3個具有顯著性差異的SNPs測序結(jié)果NAFLD和non-NAFLD兩組間比較 [n(%)]

2.3 影響NAFLD發(fā)生的危險因素分析

將體質(zhì)量、腰圍、ALT、TG、膽固醇、LDL、ApoB、HOMA-IR，MTTP rs2306986、MTTP rs3792683、PNPLA3 rs738409基因型等變量納入logistic逐步回歸分析。結(jié)果顯示PNPLA3 rs738409（OR=2.11，95%CI：1.31～4.48）、 MTTP rs2306986（OR=2.70，95%CI：1.38～5.27）和MTTP rs3792683變異（OR=7.34，95%CI：2.04～26.50）是影響NAFLD發(fā)生的獨立危險因素。見表4。

表4 基因變異對NAFLD影響的logistic回歸分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示兒童脂肪肝與體質(zhì)量、腰圍、ALT、TG、膽固醇、LDL及ApoB顯著相關(guān)，而BMI、收縮壓、HDL、FFA，胰島素、血糖及HOMA-IR等指標(biāo)無顯著性差異。我們分析其原因在于本研究選取的研究對象都是肥胖兒童，因此BMI在兩組沒有差別，但是體質(zhì)量和脂質(zhì)分布仍然存在差異，所以體質(zhì)量和腰圍兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；肝細(xì)胞內(nèi)TG合成后需要與Apo B、膽固醇等結(jié)合成極低密度脂蛋白（VLDL）而轉(zhuǎn)運出肝臟；VLDL含三酰甘油多，LDL含膽固醇及膽固醇酯最多；VLDL和LDL之間可以相互轉(zhuǎn)換。NAFLD兒童因ApoB異常而與TG及膽固醇結(jié)合形成VLDL及LDL減少，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積從而形成脂肪肝。本研究結(jié)果說明肥胖兒童脂肪肝的發(fā)生與機(jī)體脂質(zhì)代謝關(guān)系密切，而與胰島素抵抗及血糖水平則沒有明顯相關(guān)性。

目前NAFLD發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，對于兒童NAFLD研究更少，目前學(xué)界廣泛接受的“2次打擊”學(xué)說認(rèn)為：過多脂質(zhì)在肝臟沉積、肝脂肪變性，形成第1次打擊；線粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的增加導(dǎo)致大量反應(yīng)性氧化物釋放，線粒體DNA破壞，炎性反應(yīng)細(xì)胞因子釋放， 導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、炎癥及纖維化形成，即第2次打擊[9]。本研究結(jié)果證實,脂肪肝兒童血清TG水平明顯升高，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，而LDL及ApoB反饋性升高，但是并不能完全代償脂質(zhì)在肝細(xì)胞的蓄積，從而導(dǎo)致了脂肪肝的發(fā)生；本實驗結(jié)果顯示血清水平并沒有隨著脂質(zhì)增加而增加，說明肝細(xì)胞內(nèi)FFA可能通過β氧化和脂質(zhì)過氧化消耗以維持平衡，該過程導(dǎo)致相應(yīng)的氧化產(chǎn)物及過氧化產(chǎn)物增加，形成二次打擊導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，ALT明顯升高，但是因為兒童病程相對較短，氧化應(yīng)激尚未導(dǎo)致肝臟線粒體破壞及毛細(xì)膽管損傷，因此AST和膽紅素在兩組之間并沒有顯著性差異。

非酒精性脂肪肝是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，接觸相似危險因素的個體間NAFLD的發(fā)病率差異較大，疾病進(jìn)程亦不盡相同。近年來研究表明，兒童NAFLD主要發(fā)生于肥胖兒童。一項大型研究發(fā)現(xiàn)肥胖兒童脂肪肝檢出率為23.33%，正常兒童脂肪肝檢出率為5.26%[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）和隱源性肝硬化的發(fā)生呈家族聚集現(xiàn)象，不同種族NAFLD發(fā)病率之間存在差異，提示單核苷酸多態(tài)性可能會增加NAFLD的易感性和嚴(yán)重程度。這一事實說明遺傳因素及基因多態(tài)性與NAFLD發(fā)病及進(jìn)程有關(guān)[12]。對于兒童患者，因為受到環(huán)境因素影響相對較小，遺傳性因素影響更大，因此，研究NAFLD遺傳易感性相對意義更大。

肝臟脂代謝紊亂，TG合成增加，脂肪酸分泌及氧化障礙，脂質(zhì)蓄積為非酒精性脂肪肝的始動因素[13]。肝臟的脂質(zhì)代謝過程會受到機(jī)體整體環(huán)境的影響，更重要的是肝臟作為一個獨立的臟器，其本身的脂質(zhì)代謝平衡發(fā)揮著重要的作用，可能存在某個共同的機(jī)制導(dǎo)致不同病理狀態(tài)的個體出現(xiàn)脂質(zhì)在肝細(xì)胞中蓄積從而形成脂肪肝。近年來基因芯片技術(shù)及高通量二代測序技術(shù)[14]，在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)普遍應(yīng)用于實驗研究及臨床診斷，已有報道應(yīng)用基因芯片捕獲聯(lián)合二代測序技術(shù)來檢測非酒精性脂肪肝相關(guān)基因。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PNPLA 3 rs738409 位點變異在肥胖NAFLD兒童更為多見，與non-NAFLD兒童比較具有顯著性差異，說明該位點變異可能與肥胖兒童脂肪肝發(fā)生有關(guān)。有學(xué)者證實PNPLA3 rs738409 位點變異與肝臟脂肪含量升高及NAFLD組織學(xué)嚴(yán)重程度有關(guān)[15]，G等位基因與NAFLD兒童更早地出現(xiàn)癥狀有關(guān)[16]，是亞洲人NAFLD易感性最強(qiáng)的危險因子，血清ALT水平更高[17]。 PNPLA3 I148M等位基因被證實增加兒童NAFLD發(fā)病風(fēng)險[18-20]。

PNPLA 3基因編碼產(chǎn)物是一種脂肪滋養(yǎng)蛋白（adiponutrin），在肝臟中表達(dá)最多，可調(diào)節(jié)TG的分解或合成。一項全基因組研究檢測9 229個非同義突變基因，發(fā)現(xiàn)PNPLA3 rs738409 I148M與NAFLD進(jìn)展關(guān)系最為密切[5]。成人PNPLA 3 rs738409多態(tài)性可能與肥胖個體慢性肝病發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)[21]；盡管降低中心性肥胖、BMI、血脂水平及胰島素抵抗[22]。兒童PNPLA3 rs738409 G與肝臟脂肪變性、NASH、纖維化密切相關(guān)，且PNPLA3 148MM攜帶者發(fā)生NASH的風(fēng)險最大，PNPLA3 148II攜帶者的風(fēng)險最小[5]。針對多種族肥胖兒童進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PNPLA3 G等位基因攜帶者的肝臟脂肪含量比C等位基因攜帶者高[23]；皮下脂肪庫儲存量減少而肝臟的脂肪沉積[23]。

微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)運蛋白（MTTP）的作用為參與肝臟TG變?yōu)閂LDL過程，將脂肪轉(zhuǎn)運出肝臟，因此肝臟脂質(zhì)排出受MTTP變化影響[24]。MTTP啟動子區(qū)域-493位點G/T多態(tài)性與低水平轉(zhuǎn)錄相關(guān)，可以導(dǎo)致MTTP降低，TG無法排出肝臟促進(jìn)NAFLD發(fā)病[25]。有證據(jù)顯示該基因G等位基因純合子NAFLD兒童脂肪變性及NASH病理學(xué)評分比雜合子或者T等位基因純合子兒童均高[26]。MTTP 297H多態(tài)性可以降低血清ApoB水平，但是增加NAFLD發(fā)病風(fēng)險[27]。

本研究結(jié)果證實肥胖NAFLD兒童MTTP rs2306986、MTTP rs3792683位點變異率與對照組兒童比較具有顯著性差異，推測這兩個位點變異可能使ApoB異常，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)含量比對照組兒童高，從而增加肥胖兒童NAFLD發(fā)病風(fēng)險；有報道[28]MTTP rs1800591等位基因G/T位點具有類似作用，其原因可能會使MTTP表達(dá)降低，VLDL及CM合成不足，導(dǎo)致ApoB降解增加，引起肝臟脂質(zhì)代謝失調(diào)，從而使NAFLD發(fā)病增加[29]。因為TG轉(zhuǎn)變?yōu)閂LDL需要ApoB和MTTP的協(xié)同作用。ApoB是肝臟VLDL和小腸CM組裝和分泌所必須的一種蛋白質(zhì)[30]。 MTTP則將膽固醇、磷脂和TG轉(zhuǎn)運給ApoB形成前VLDL，進(jìn)而與MTTP穩(wěn)態(tài)的TG融合，形成成熟的VLDL[31]。 研究報道基因分析證實了MTTP在脂質(zhì)代謝中的重要作用，肝臟特異性MTTP敲除可以引起VLDL、TG顯著降低并導(dǎo)致肝臟脂肪變性[32]。

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Variation in genes related to lipid metabolism and the susceptibility of nonalcoholic fatty liver disease in obese children

DAI Dongling1,2, ZHOU Shaoming1, LIU Guosheng2, WEN Feiqiu1, ZHOU Jianli1
(1. Shenzhen Children's Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong, China；2. First Af fi liated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong, China)

ObjectiveTo explore the association between variation in genes related to lipid metabolism and the susceptibility of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).MethodsObese children with fatty liver aged 6～18 years old were included. All of them got ultrasonic testing, routine examination and biochemical detection. In addition, the DNA of peripheral blood was extracted and the 36 target genes related to lipid metabolism were detected by next generation sequencing.ResultsIn 368 obese children who met the inclusion criteria, 183 children (49.7%) were detected to have NAFL . 100 children with NAFLD and 100 children without NAFLD were randomly selected from obese children. The levels of body mass, waistline, alanine aminotransferase (ALT), triacylglycerol (TG), cholesterol, low density lipoprotein (LDL) and apolipoprotein B (ApoB) in NAFLD children were all higher than those in non-NAFLD children, and there were signi fi cant differences (P all＜0.05). However, the levels of aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), apolipoprotein A1 (ApoA1), fasting blood glucose, insulin, high density lipoprotein (HDL), free fatty acid (FFA) and insulin resistance index (HOMA-IR) were not signi fi cantly different between the two groups (P all＞0.05). The levels of bilirubine in the two groups were within normal range. Logistic regression analysis showed that the genes of MTTP rs2306986 (OR=2.70, 95%CI: 1.38～5.27) and MTTP rs3792683 (OR=7.34, 95%CI: 2.04～26.50) that encode microsomal triglyceride transfer protein (MTTP or MTP), and the mutation of rs738409 (OR=2.11, 95%CI:1.31～4.48) in gene PNPLA3 that encode patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 are the independent risk factors for the occurrence of the disease.ConclusionGenovariation of MTTP rs2306986, MTTP rs3792683, and PNPLA3 rs738409 may increase susceptibility to NAFLD in children.

genetics; lipid metabolism; non-NAFLD; obesity; single nucleotide polymorphism

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.04.001

2016-08-24)

（本文編輯：鄒 強(qiáng)）

深圳市科創(chuàng)委創(chuàng)新基金項目（No.JCYJ20150403100317080）

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