夏曉華++霍蔚然++李墨溢++董慧++夏曉培++杜啟艷++常重杰

摘要：為了檢測除草劑乙氧氟草醚對水生生物的毒性，以泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）為試驗對象，通過急性毒性試驗、微核試驗、單細(xì)胞凝膠電泳試驗，來檢測其對泥鰍的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，乙氧氟草醚對泥鰍在24、48、72、96 h的半數(shù)致死濃度（LC50）分別為36.66、32.86、28.92、27.39 mg/L，安全濃度（SC）為7.92 mg/L。微核率和核異常率均隨著染毒濃度的增加和時間的延長不斷升高，呈現(xiàn)明顯的時間劑量效應(yīng)關(guān)系。在處理6 d的最高濃度，微核率和核異常率達(dá)到最大，分別為6.417‰±0.631‰和65.417‰±5.080‰。單細(xì)胞凝膠電泳試驗中，選取彗尾DNA含量、尾長、尾矩3個指標(biāo)作為檢測DNA受到損傷的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果處理6 d的16.00 mg/L濃度達(dá)到峰值，單細(xì)胞彗尾DNA含量為43.06%±2.54%，尾長為268.00 pix±8.49 pix，尾矩為89.31±1.82。試驗結(jié)果為乙氧氟草醚的合理使用以及環(huán)境污染監(jiān)測提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）；乙氧氟草醚；半數(shù)致死濃度；微核；單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)

中圖分類號：S966.4+91 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1522-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.029

Study on the Toxicity of Oxyfluorfen to Misgurnus anguillicaudatus

XIA Xiao-hua1， HUO Wei-ran1， LI Mo-yi2， DONG Hui1， XIA Xiao-pei1， DU Qi-yan1， CHANG Zhong-jie1

（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China；

2.The Affiliated High School of Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： In order to estimate the herbicide toxicity of oxyfluorfen to aquatic organisms， regarding the Misgurnus anguillicaudatus Cantor as the experimental object， we adapted the acute test， micronucleus test， single cell gelelectrophoresis to test its toxicity on M. anguillicaudatus. The results showed that， the half lethal concentration（LC50） of oxyfluorfen on the 24， 48， 72， 96 h were 36.66， 32.86， 28.92， 27.39 mg/L； respectively； the safe concentration（SC） was 7.92 mg/L. The micronucleus rate and nuclear anomalies in each experiment were increased with exposure time and concentration， which presents obvious time dose effect. The highest micronuclei and nuclear anomalies' rate reached the maximum which appeared in the highest concentration on 6 d. The results were permill 6.417‰±0.631‰， 65.417‰±5.080‰， respectively. In the comet assay， we chose the content of comet tail DNA， tail length and the olive tail moment（these three standards） to check the injure degree of DNA. The results showed that they reached to the peak value on 6 d and 16.00 mg/L. The peak value was 43.06%±2.54%， 268.00 pix±8.49 pix， 89.31±1.82， respectively. The studies showed scientific references for effective use of oxyfluorfen and environmental pollution monitoring.

Key words： Misgurnus anguillicaudatus Cantor； oxyfluorfen； LC50； micronucleus； single cell gel electrophoresis

現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖模式——嵌套養(yǎng)殖已經(jīng)被越來越多的養(yǎng)殖戶青睞，而市面上常見的嵌套養(yǎng)殖模式當(dāng)屬泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）-水稻模式。為了有效防治稻田病蟲害、雜草，提高水稻產(chǎn)量，施用農(nóng)藥是重要的農(nóng)藝措施之一，乙氧氟草醚便是常用的稻田除草劑。稻田中使用除草劑去除雜草的同時，大量散失的農(nóng)藥也將流入到稻田水體中，這會給水體里的生物特別是稻田里面嵌套養(yǎng)殖的泥鰍帶來很大毒害，不僅給農(nóng)戶造成經(jīng)濟損失，而且這些有毒物質(zhì)會通過食物鏈的富集、傳導(dǎo)作用轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，從而引起人和動物的積累性中毒，對人類的健康構(gòu)成了潛在的威脅[1]。因此應(yīng)合理使用農(nóng)藥，在有效防治病蟲草害的同時，降低農(nóng)藥對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染，達(dá)到可持續(xù)發(fā)展的目的。試驗以泥鰍為受試對象，通過急性毒性試驗、微核試驗、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測乙氧氟草醚對泥鰍遺傳物質(zhì)DNA的損傷程度，評估了乙氧氟草醚對稻田中嵌套養(yǎng)殖泥鰍的遺傳毒性水平，以期為合理使用除草劑、高效養(yǎng)殖泥鰍、推廣現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖模式嵌套養(yǎng)殖及環(huán)境污染監(jiān)測提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試泥鰍購自新鄉(xiāng)市海鴻農(nóng)貿(mào)市場，選擇發(fā)育狀況良好、體重13～16 g、平均體長9～12 cm的健壯泥鰍350尾，試驗前用曝氣3 d的自來水馴養(yǎng)一周，馴養(yǎng)期間死亡率小于2%，挑選健康、體表無損的個體作為試驗材料。試驗前1 d停止喂食，進(jìn)行饑餓處理，試驗期間不投喂。乙氧氟草醚除草劑購自新鄉(xiāng)市東海農(nóng)資市場，上?；莨饣瘜W(xué)有限公司出品，有效成分含量23.5%。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 在前期預(yù)備試驗的基礎(chǔ)上，確定最大零致死濃度為乙氧氟草醚稀釋液20.00 mg/L、最小全致死濃度為45.00 mg/L。正式試驗在這2個濃度之間設(shè)置20.83、25.00、30.00、36.00、43.20 mg/L 5個乙氧氟草醚稀釋液濃度梯度處理和1個空白對照處理，每處理投放10尾健康泥鰍，每24 h更換一次等體積等濃度的乙氧氟草醚稀釋液。試驗開始后12 h連續(xù)觀察，并記錄其中毒癥狀；及時清理死亡個體，記錄泥鰍在24、48、72、96 h的死亡數(shù)量。采用改進(jìn)寇氏法（Karber）[2，3]計算乙氧氟草醚對泥鰍的半數(shù)致死濃度（LC50），LC50的計算公式為：

LgLC50=Xm-i（∑p-0.5），

式中，Xm為死亡處理最大劑量的對數(shù)，i為相鄰處理濃度的對數(shù)之差，∑p為各處理死亡率之和。安全濃度SC的計算公式為：

SC=LC50（24 h）×0.3/[（LC50（24 h）/LC50（48 h）]3。

1.2.2 微核試驗 在急性試驗毒性的基礎(chǔ)上，于安全濃度和最大零致死濃度之間，設(shè)置5個乙氧氟草醚濃度處理，分別是0.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/L，每處理均隨機投放20尾健康泥鰍，每24 h更換一次等體積等濃度的乙氧氟草醚稀釋液。分別設(shè)置2、4、6 d 3個時間段，試驗步驟參照文獻(xiàn)[4]的方法完成。微核試驗處理的數(shù)據(jù)有：

核異常率=（異常核的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）× 1 000‰，

微核率=（雙核的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×1 000‰。

1.2.3 單細(xì)胞凝膠電泳試驗 單細(xì)胞（血細(xì)胞）懸浮液的制備步驟參照文獻(xiàn)[5]的方法。泥鰍的單細(xì)胞凝膠電泳試驗分別設(shè)置2、4、6 d 3個時間段處理，以試驗開始時間0為對照，各個時間段處理都設(shè)置4個乙氧氟草醚濃度，分別是8.00、12.00、16.00、20.00 mg/L；運用CASP彗星圖像分析軟件及統(tǒng)計軟件SPSS 11.0對各處理的彗尾DNA所占含量（Tail DNA，%）、尾長（TL，pix）和Olive尾距（OTM）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗

試驗觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍活動有相對明顯的影響。低劑量處理中，泥鰍基本上沒出現(xiàn)明顯的生理反應(yīng)；但在高劑量處理中，泥鰍不斷地快速游動，有狂游躍出水面的現(xiàn)象，最終逐漸失去游動能力、翻白肚直至死亡；不同濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的急性毒性試驗結(jié)果見表1。由表1可知，乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的24、48、72、96 h的 LC50分別為36.66、32.86、28.92、27.39 mg/L，SC為7.92 mg/L。

2.2 微核試驗

不同濃度的乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍的微核試驗結(jié)果見表2。從表2可見，對照處理的泥鰍紅細(xì)胞自發(fā)微核和核異常細(xì)胞率在各處理時間上無明顯個體差異；而乙氧氟草醚處理的濃度越高，在處理時間一定的條件下，泥鰍的血細(xì)胞微核率和核異常率越高，各乙氧氟草醚稀釋液濃度處理都與對照之間存在極顯著差異（P<0.01）；并在20.00 mg/L的濃度下達(dá)到最高，處理6 d的微核率達(dá)到6.417‰±0.631‰，核異常率達(dá)到65.417‰±5.080‰。并且處理6 d的微核率和核異常率都比處理4 d與2 d的高。

2.3 單細(xì)胞凝膠電泳試驗

乙氧氟草醚稀釋液處理泥鰍后單細(xì)胞（血細(xì)胞）凝膠電泳比較情況見圖1。由圖1可見，對照的細(xì)胞核呈圓球形，頭部DNA集中；而在乙氧氟草醚稀釋液各處理中，細(xì)胞核呈現(xiàn)彗星樣，具有長度不同的慧尾，而且隨著濃度的增加，彗星頭部逐漸縮小，變得發(fā)散。利用彗星圖像分析軟件CASP及統(tǒng)計軟件SPSS 11.0測量與統(tǒng)計分析單細(xì)胞凝膠電泳情況，結(jié)果見表3。從表3可見，在處理2 d的單細(xì)胞中，泥鰍的彗尾DNA含量、尾矩、尾長隨著乙氧氟草醚濃度的增加，各數(shù)值都明顯增大，與對照都存在極顯著差異（P<0.01）或顯著差異（P<0.05），并在20.00 mg/L時達(dá)到峰值，此時單細(xì)胞彗尾DNA含量為28.17%±1.32%，尾長為165.00 pix±4.24 pix，尾矩為31.34±5.25，說明在處理時間為2 d的情況下，乙氧氟草醚稀釋液隨著濃度的增加，對泥鰍細(xì)胞的DNA損傷也越嚴(yán)重。在處理4 d的單細(xì)胞中，試驗結(jié)果所呈現(xiàn)的趨勢大致與處理2 d相同，且3項數(shù)值在20.00 mg/L中同樣也達(dá)到峰值，單細(xì)胞彗尾DNA含量為29.99%±4.06%，尾長為219.00 pix±25.46 pix，尾矩為51.34±8.26，與對照相比都存在極顯著差異（P<0.01），并且較處理2 d而言，3項數(shù)值都有了大幅度提升，說明乙氧氟草醚稀釋液對泥鰍細(xì)胞DNA的損傷有時間劑量效應(yīng)。而在6 d的各處理中，3項數(shù)值在16.00 mg/L濃度中達(dá)到峰值，彗尾DNA含量為43.06%±2.54%，尾長為268.00 pix±8.49 pix，尾矩為89.31±1.82。

3 討論

3.1 乙氧氟草醚的毒性分類

急性毒性試驗結(jié)果顯示，低濃度處理24 h和48 h的泥鰍死亡率并沒有明顯的變化；高濃度處理中隨著乙氧氟草醚濃度的不斷升高，泥鰍的死亡率明顯上升，且隨著染毒時間的增加，泥鰍的死亡率均呈上升態(tài)勢，說明乙氧氟草醚對泥鰍毒性存在時間-劑量效應(yīng)。2009年新版的《國際海運危險貨物規(guī)則》中將化學(xué)物質(zhì)對魚類的毒性分為3個等級[6]，其中96 h的LC50大于10.00 mg/L時屬于低毒。本試驗中乙氧氟草醚對泥鰍的96 h的LC50為27.37 mg/L，大于10.00 mg/L，由此說明除草劑乙氧氟草醚對泥鰍屬于低毒。

3.2 乙氧氟草醚對泥鰍單細(xì)胞DNA的損傷程度

除草劑中的致變物質(zhì)能使泥鰍部分單細(xì)胞（血細(xì)胞）染色體發(fā)生斷裂或破壞其紡錘體，使之在有絲分裂過程中染色體斷片殘留于間期胞漿中形成微核；微核細(xì)胞率的高低可反映細(xì)胞染色體受損傷的程度[7]。試驗中，泥鰍單細(xì)胞的微核率和核異常率均隨著乙氧氟草醚濃度的升高和時間的延長而增加。高濃度處理的泥鰍單細(xì)胞微核率和核異常率明顯要比低濃度處理的高。這可能是由于處理濃度過高后，使泥鰍單細(xì)胞自身修復(fù)機制失效，不能夠進(jìn)行有效的自我修復(fù)，導(dǎo)致單細(xì)胞的核異常率和微核率提高造成的。

單細(xì)胞凝膠電泳試驗與經(jīng)典的染色體畸變、微核相比，不僅可以研究低劑量下的生物效應(yīng)，也可用于研究高劑量下的生物效應(yīng)；既可以用于活細(xì)胞DNA的檢測，也能用于死亡細(xì)胞DNA的分析。因此單細(xì)胞凝膠電泳試驗非常適用于評價受試對象的遺傳毒性。試驗中，處理與對照相比，彗尾DNA含量、尾長、尾矩3個指標(biāo)都隨著乙氧氟草醚濃度的升高以及處理時間的延長而有明顯的上升。當(dāng)處理時間為6 d、乙氧氟草醚處理濃度為16.00 mg/L時，彗尾DNA含量為43.06%±2.54%，尾長為268.00 pix±8.49 pix，尾矩為89.31±1.82，這3項數(shù)值均達(dá)到最大；而在之后的處理（6 d、20.00 mg/L）中3項數(shù)值都有明顯的下降，可能的原因是與DNA自身的修復(fù)機制有關(guān)，DNA在受到嚴(yán)重?fù)p傷時，會啟動SOS修復(fù)機制，使DNA的損傷程度減弱，導(dǎo)致拖尾出現(xiàn)不明顯現(xiàn)象。單細(xì)胞凝膠電泳試驗表明，乙氧氟草醚濃度越大，處理時間越長，對泥鰍DNA的損傷就越嚴(yán)重。

綜上所述，試驗證實了乙氧氟草醚對泥鰍單細(xì)胞的遺傳物質(zhì)具有一定的毒性效應(yīng)，為人們更好、更安全地使用此類除草劑提供了依據(jù)，值得養(yǎng)殖戶借鑒。并且合理使用農(nóng)藥是嵌套養(yǎng)殖技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵，這對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和環(huán)境保護(hù)及其他相關(guān)領(lǐng)域都具有重要意義。

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