李易　葉曦

[摘要] 目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對糖尿病腎?。―N）大鼠的保護作用。 方法 48只雄性SD大鼠隨機分為三組，每組16只。Control組給予正常飲食，DN組采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）50 mg/kg腹腔注射建立DN模型，EGCG組給予EGCG 50 mg/kg每天灌胃治療，同DN組大鼠予以相同體積生理鹽水。分別在6周和12周處死大鼠各半，收集血清和腎臟，采用ELISA、RT-qPCR和Western blot等方法檢測相關(guān)因子。 結(jié)果 與Control組比較，DN組血清中腎功能指標、炎癥因子以及血脂水平升高（P < 0.05），EGCG治療6周后，與DN組比較，EGCG組上述指標下降（P < 0.05）；與Control組比較，DN組大鼠血清中抗氧化因子含量降低（P < 0.05），治療6周后，與DN組比較，EGCG組上述指標升高（P < 0.05）；與Control組比較，DN組大鼠腎臟組織中p-PI3K和p-AKT的蛋白表達下調(diào)（P < 0.05），治療6周后，與DN組比較，EGCG組p-PI3K和p-AKT的蛋白表達水平上調(diào)（P < 0.05），治療12周后上述指標進一步改善。結(jié)論 EGCG可通過減少體內(nèi)炎癥反應與脂質(zhì)沉積，改善腎功能、增加抗氧化能力以及抗細胞凋亡等途徑治療DN大鼠腎臟損傷。

[關(guān)鍵詞] 表沒食子兒茶素沒食子酸酯；糖尿病腎??；磷脂酰肌醇-3-激酶；絲蘇氨酸蛋白激酶

[中圖分類號] R587 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（c）-0031-05

[Abstract] Objective To explore the protective effect of EGCG on diabetic DN rats. Methods 48 male SD rats were divided into 3 groups respectively， each group had 16 rats. Rats in the control group were given normal diet， while rats in the other groups were fed with a high-fat diet accompanied with intraperitoneal injection of STZ （50 mg/kg） to establish DN model. Then the rats in the EGCG group were given EGCG （50 mg/kg） by lavage every day， at the same time the DN group were given the same volume of saline. Half of the rats in each group were killed at 6 or 12 weeks respectively， the serum and kidney tissues were collected. The related factors were determined by ELISA， RT-qPCR and Western blot. Results Compared with the control group， the concentrations of indicaters of renal function， inflammatory and lipids in the DN group were increased （P < 0.05）， after EGCG treatment for 6 weeks， compared with the DN group， these indexes in the EGCG group were decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， the contents of anti-oxdators in the DN group were reduced （P < 0.05）， after EGCG treatment for 6 weeks， compared with the DN group， these parameters in the EGCG group were elevated （P < 0.05）. Compared with the control group， the protein expression levels of p-PI3K and p-AKT in kidney tissues of the DN group were downregulated， after treatment with EGCG for 6 weeks， compared with the DN group， those in the EGCG group were upregulated （P < 0.05）， while after EGCG treatment for 12 weeks， the improve effects above became more obvious. Conclusion EGCG may ameliorate the kidney injury by reducing inflammation and lipids deposition， improving the renal function， increasing the ability of anti-oxidation and anti-apoptosis in DN rats.

[Key words] Epigallocatechin-3-gallate； Diabetic nephropathy； Phosphatidylinositol 3-kinases； Serine-threonine kinase

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是以代謝紊亂為主要特點的內(nèi)分泌障礙疾病，胰島素分泌不足和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是其發(fā)病的原因[1]，其中，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是最常見的DM外周血管并發(fā)癥[2-4]。近年來，由DN引起的終末期腎臟疾病的發(fā)生率不斷升高[5-6]。大量文獻報道磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）信號通路與細胞凋亡發(fā)生發(fā)展相關(guān)[7-9]，因此對PI3K/AKT信號通路的調(diào)控可能是治療DN的新靶點。本實驗旨在研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）[10-12]對高脂飲食加鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的DN大鼠模型中PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 48只體重180～200 g雄性SD大鼠[合格證號：SYXK（滇）2011-0004]，由昆明醫(yī)科大學動物實驗動物學部提供。

1.1.2 藥品與試劑 EGCG（美國Apexbio公司），STZ（美國Sigma公司），葡萄糖（Glucose）等測定試劑盒（Bio-Swamp公司），ELISA試劑盒（南京建成），抗體（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 DN大鼠模型的建立 大鼠隨機分為正常對照（Control）組（n =16）、DN組（n =16）以及EGCG組（n =16）。Control組給予普通飼料喂養(yǎng)，DN組和EGCG組給予高脂飼料喂養(yǎng)，4周后，采用STZ溶液（50 mg/kg）腹腔注射造模。EGCG組給予EGCG 50 mg/kg每天灌胃治療，同時DN組予以相同體積生理鹽水灌胃，分別在6周和12周時處死大鼠各半。

1.2.2 標本采集 大鼠腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉，5000 r/min離心15 min，獲得血清。取血完成后處死大鼠，取腎臟組織冷藏。

1.2.3 相關(guān)生化指標檢測 相關(guān)生化指標采用ELISA試劑盒檢測。

1.2.4 RT-qPCR檢測 PCR擴增反應條件如下：95℃預變性2 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，循環(huán)次數(shù)40次；72℃最后再延伸5 min。引物序列為：PI3K正向：5'-CACCTTAAATGGTGAGCACGG-3'，反向：5'-ACACCCCAGCCAATCAAGTC-3'；AKT正向：5'-CCGCCTGATCAAGTTCTCCT-3'，反向：5'-TTCAGATGATCCATGCGGGG-3'。

1.2.5 Western blot檢測 取腎臟組織約100 mg勻漿，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗（1∶2000），4℃過夜，孵育二抗（1∶4000），以GAPDH作為內(nèi)參，每組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組不同時間腎功能指標比較

DN組大鼠血清中Scr、BUN、CysC以及RBP含量均明顯高于Control組（P < 0.05）；EGCG治療后，上述指標較DN組明顯下降（P < 0.05），治療12周后下降效果更加顯著（P < 0.05）。

2.2 三組不同時間血糖及胰島素水平比較

與Control組比較，在DN組大鼠血清中，血糖、胰島素的含量以及胰島素抵抗指數(shù)都明顯升高（P < 0.05）；經(jīng)EGCG灌胃治療后，各項指標均較DN組下降明顯（P < 0.05），且治療12周比治療6周效果更加明顯（P < 0.05）。

2.3 三組不同時間氧化和抗氧化指標比較

與Control組比較，DN組MDA含量升高明顯（P < 0.05），經(jīng)EGCG治療后MDA含量較DN組降低（P < 0.05）；與Control組比較，DN組SOD和GSH含量下降（P < 0.05），經(jīng)EGCG治療后SOD和GSH含量較DN組增多（P < 0.05）；且EGCG組各項指標治療12周均比治療6周變化明顯，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.4 三組不同時間炎癥因子比較

與Control組比較，DN組TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加明顯（P < 0.05）；經(jīng)EGCG治療后，各項指標均較DN組下降明顯（P < 0.05），且治療12周比治療6周下降更加顯著（P < 0.05）。

2.5 三組不同時間血脂指標比較

與Control組相比，DN組TC、TG和LDL-C水平升高（P < 0.05）；EGCG治療后，TC、TG和LDL-C水平較DN組降低（P < 0.05），且治療12周治療的效果比6周更加明顯，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.6 三組不同時間腎臟PI3K和AKT mRNA表達比較

PI3K和AKT mRNA水平在各組大鼠腎臟組織中的表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.7 三組不同時間腎臟PI3K和AKT的蛋白表達以及磷酸化程度比較

與Control組相比，DN組p-PI3K和p-AKT的表達水平顯著降低（P < 0.05），EGCG治療后，p-PI3K和p-AKT的表達水平較DN組升高（P < 0.05），且治療12周比6周升高更加明顯，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖2。

3 討論

現(xiàn)代藥理學證實，兒茶素具有降血糖、抗氧化與增強胰島素敏感性的作用[13]。研究表明，EGCG能夠抑制腎小球系膜細胞增殖，保護腎功能[14]。本實驗結(jié)果證實：EGCG能夠降低DN大鼠血液中的Scr、BUN、CysC以及RBP的含量，并且通過對大鼠炎癥、血脂、氧化和抗氧化等指標的檢測顯示，EGCG具有減輕

DN大鼠體內(nèi)IR、炎癥反應以及脂質(zhì)沉積，增強抗氧化能力的作用。近年來許多關(guān)于DN發(fā)生的分子機制研究認為，腎功能的損害與細胞凋亡過程調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)，其中，PI3K/AKT信號通路是保護腎臟細胞、抑制細胞凋亡的重要信號通路[15-19]。文獻報道，PI3K/Akt通路不僅是藥物保護腎臟細胞重要作用靶點，也是抑制細胞凋亡的上游通路，通過對PI3K/Akt信號通路磷酸化的激活可以抑制細胞凋亡[20]。本實驗通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，EGCG能明顯激活PI3K/AKT信號通路，增加PI3K和AKT的磷酸化，以達到對腎臟細胞的保護作用。

綜上所述，EGCG可降低DN大鼠體內(nèi)炎癥反應與脂質(zhì)沉積，改善腎功能以及增加抗氧化能力并且可能通過上調(diào)PI3K/AKT信號通路的磷酸化程度而發(fā)揮減輕和延緩DN大鼠腎損傷。

[參考文獻]

[1] 袁琳，白永生，周明眉，等.2型糖尿病大鼠的尿液代謝組學改變[J].中國實驗動物學報，2011，19（2）：111-114.

[2] 趙大鵬，隋艷波，欒仲秋，等.糖尿病腎病發(fā)病機制的研究進展[J].中國醫(yī)藥導報，2012，9（36）：47-48.

[3] Lim AK，Tesch GH. Inflammation in diabetic nephropathy [J]. Mediators of Inflammation，2012，2012（5）：146-154.

[4] 皮子鳳，門麗慧，張靜，等.五味子治療大鼠糖尿病腎病作用機制的血清代謝組學研究[J].分析化學研究報告，2015，43（2）：169-175.

[5] Cha SA，Yun JS，Lim TS，et al. Severe Hypoglycemia and Cardiovascular or All-Cause Mortality in Patients with Type 2 Diabetes [J]. Diabetes Metab J，2016，40（3）：202-210.

[6] Wheelock KM，Jaiswal M，Martin CL，et al. Cardiovascular autonomic neuropathy associates with nephropathy lesions in American Indians with type 2 diabetes [J]. J Diabetes Com？鄄plications，2016，30（5）：873-879.

[7] 祝冰晶，周向東.PI3K/AKT通路在肺癌轉(zhuǎn)移和耐藥中的研究[J].中國肺癌雜志，2011，14（8）：689-693.

[8] 黃成，李俊，馬陶陶.PI3K/Akt信號通路與肝纖維化[J].中國藥理學通報，2011，27（8）：1037-1041.

[9] 郝志楠，鄭勇斌，肖高春，等.PI3K/AKT及MEK/ERK信號通路抑制劑對結(jié)直腸癌血管內(nèi)皮細胞管道形成的作用[J].中國醫(yī)藥導報，2014，11（23）：30-35.

[10] 魏芳，劉浩，張配，等.EGCG對三陰乳腺癌細胞 MDA-MB-231的增殖抑制作用及機制[J].中國藥理學通報，2013，29（5）：680-684.

[11] 劉曉慧，揭國良，林康，等.EGCG和茶氨酸對細胞氧化損傷的協(xié)同保護和修復作用研究[J].茶葉科學，2014， 34（3）：239-247.

[12] 秦婧，洪莉.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對人宮頸癌細胞系HeLa細胞凋亡及bcl-2/bax表達的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2014，11（24）：29-32.

[13] 葛建，林芳，李明揆，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）生物活性研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2011， 38（2）：156-163.

[14] Xie J，Jiang LB，Zhang T，et al. Neuroprotective effects of Epigallocatechin-3-gallate（EGCG）in optic nerve crush model in rats [J]. Neuroscience Letters，2010，479（1）：26-30.

[15] Susztak K，Raff AC，Schiffer M，et al. Glucose-induced reactive oxygen species cause apoptosis of podocytes and podocyte depletion at the onset of diabetic nephropathy [J]. Diabetes，2006，55（1）：225-233.

[16] 孫文，馮麗園，趙宗江，等.三七總皂苷干預糖尿病腎病大鼠氧化應激及足細胞凋亡機制的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：1062-1067.

[17] Engelmann JA. Targeting PI3K signaling in cancer：opportunities，challenges and limitations [J]. Nat Rev Cancer，2009，9（8）：550-562.

[18] 祁慧薇，范理宏.PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路與非小細胞肺癌[J].中國肺癌雜志，2010，13（12）：1149-1154.

[19] 吳秋歌，蔣軍廣，王靜.PI3K/Akt抑制劑對肺腺癌A549細胞增殖活性的影響[J].中國老年學雜志，2011，2（31）：278-280.

[20] 向鏡芬，楊祥，龔劍鋒，等.PI3K/Akt信號通路在膿毒癥腎臟損傷誘導的自噬中的調(diào)節(jié)作用[J].中國病理生理雜志，2014，30（6）：1052-1058.

（收稿日期：2016-09-11 本文編輯：程 銘）