劉潮　韓利紅　宋培兵　王德琴　王海波　唐利洲

摘要：[目的]明確桑樹(shù)基因組中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)構(gòu)及其功能特征，為進(jìn)一步揭示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。[方法]利用生物信息學(xué)方法對(duì)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目、類型、結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域和密碼子使用偏性等進(jìn)行全面分析。[結(jié)果]基于桑樹(shù)全基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定出55個(gè)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因，占桑樹(shù)基因總數(shù)（29261）的1.88%。桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子存在6種內(nèi)含子數(shù)量類型及15種內(nèi)含子相位類型，其中27個(gè)基因含有2個(gè)內(nèi)含子，25個(gè)基因的相位類型為2-2型。保守結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白主要分為三大類（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），I類可分為IN和Ic兩個(gè)亞組，Ⅱ類根據(jù)聚類情況又可分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5個(gè)亞組。桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)有五類Motif的保守性較強(qiáng)，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白中均包含c端Motif 1，I類蛋白同時(shí)含有N端Motif 3。桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因啟動(dòng)子區(qū)富含PBF（C2H2鋅指因子）和AHL（擬南芥hook因子）元件。密碼子使用偏性分析結(jié)果顯示，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因的有效密碼子數(shù)（ENC）介于48.00-60.00，密碼子第3位GC含量（GC3s）介于0.330-0.722，平均親水性值（Gravy）均為負(fù)值；同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）>I.000的密碼子有29個(gè)，且以A（6個(gè)）或T（11個(gè)）結(jié)尾較G（4個(gè)）或c（8個(gè)）結(jié)尾的略多。[結(jié)論]桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族包含55個(gè)成員，內(nèi)含子相位類型一致的同組成員可能來(lái)源于同一祖先基因，且與基因復(fù)制和基因組重排有關(guān)；蛋白序列高度保守，在植物抵御環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用；基因密碼子使用偏性較弱，主要受堿基突變選擇壓力影響。

關(guān)鍵詞：桑樹(shù)；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；密碼子使用偏性；系統(tǒng)進(jìn)化；生物信息學(xué)

0引言

[研究意義]WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是僅存于高等植物中的一類鋅指蛋白，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，能對(duì)環(huán)境脅迫和病原侵染作出響應(yīng)。首先，WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白在植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是植物免疫系統(tǒng)各通路的中心組件，包括MTI、PTI、ETI、基本防御及系統(tǒng)獲得抗性（Birkenbihl et al.，2016）。其次，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物的應(yīng)激反應(yīng)中也起關(guān)鍵作用，其網(wǎng)絡(luò)涉及生物和非生物脅迫的各組成部分（Eulgem，2006；Zhu et al.，2013）。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)植物對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性，同時(shí)增強(qiáng)抗病性（Oiu and Yu，2009）。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還在植物種子發(fā)芽、衰老及其他發(fā)育反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Rushton et al.，2010；Verweij et al.，2016）。密碼子使用偏性是指各種生物體偏愛(ài)使用三聯(lián)密碼子（編碼相同氨基酸的同義密碼子）的現(xiàn)象，普遍存在于生物界中，且物種的親緣關(guān)系越近密碼子使用偏性越相似；密碼子使用偏性還與基因表達(dá)、蛋白質(zhì)功能等密切相關(guān)。因此，研究密碼子使用偏性對(duì)開(kāi)展基因進(jìn)化壓力研究、基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)及外源基因改良等均具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族含有60個(gè)高度保守的氨基酸WRKY功能域，包含N端的WRKYGQK保守的氨基酸和C端非典型的鋅指結(jié)構(gòu)（Rushton et al.，2010）。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)氨基酸組成的不同，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白分為三大類：第1類含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，具有Cys2-His2型（CX46CX22-23HX1H）鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅱ類和第Ⅲ類僅含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其中第Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)與第1類的類似，第Ⅲ類的鋅指結(jié)構(gòu)為Cys2-His-Cys型（CXvCXE3HTC），根據(jù)保守氨基酸殘基的差異，第Ⅱ類又可分為5個(gè)亞類（Eulgem et al.，2000）。至今，已有多種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因被鑒定（Wu et al.，2005；Ross et al.，2007；Ling et al.，2011；Huang et aL，2012；Dmg et aL，2015；Song et al，2016；Zhang et al.，2016），并證實(shí)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物的多種生理生化過(guò)程，包括衰老（zhang et al.，2016）、纖維發(fā)育（Ding et al.，2015）、生物和非生物脅迫（Song et al.，2016；Wei et al.，2016）等。不同物種或同一物種不同基因問(wèn)的密碼子使用偏性不同，與基因在進(jìn)化過(guò)程中所面對(duì)的選擇壓力不同有關(guān)。物種在進(jìn)化過(guò)程中受基因突變壓力和自然選擇壓力的雙重影響，但由于二者在基因進(jìn)化過(guò)程中所發(fā)揮作用的權(quán)重不同，導(dǎo)致密碼子使用偏性具有物種特異性（趙洋等，2016；曲俊杰等，2017）。密碼子使用偏性與GC含量有關(guān)時(shí)表示受突變壓力影響（Chen et al.，2004），與翻譯過(guò)程有關(guān)時(shí)表示受正向選擇壓力影響（Sharp et al.，2010）。因此，通過(guò)優(yōu)化密碼子可提高外源基因在寄主細(xì)胞中的表達(dá)水平（周宗梁等，2012；Zelasko et al.，2013）。[本研究切入點(diǎn)]桑樹(shù)（Morus notabilis）是一種常見(jiàn)的落葉喬木，其葉片是桑蠶的主要飼料，桑皮可用作造紙?jiān)?，桑果可供食用或釀酒，在我?guó)多個(gè)省份均有栽培，但目前針對(duì)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因及其蛋白的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]在桑樹(shù)基因組測(cè)序工作的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法全面預(yù)測(cè)分析桑樹(shù)基因組中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)構(gòu)及其功能特征，為進(jìn)一步揭示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1蛋白序列獲取與鑒定

桑樹(shù)全基因組蛋白序列從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得，以擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列為探針，在桑樹(shù)全基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp同源序列比對(duì)分析，通過(guò)NCBI在線工具CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，并剔除無(wú)WRKY結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。

1.2基因及其蛋白結(jié)構(gòu)分析

從NCBI中獲得桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因序列和CDS序列，使用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖；通過(guò)MEME SUITE（http：//meme-suite.org/tools/meme）預(yù)測(cè)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列保守氨基酸Motif，參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.3基因啟動(dòng)子區(qū)特征分析

通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的2 kb序列，以JASPAR（http：//iaspar.genereg.net/）數(shù)據(jù)庫(kù)分析啟動(dòng)子區(qū)富含轉(zhuǎn)錄調(diào)控基序。選擇植物啟動(dòng)子基序數(shù)據(jù)庫(kù)作為搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，相對(duì)閾值分?jǐn)?shù)選擇100%。

1.4蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

所有桑樹(shù)WRKY家族蛋白通過(guò)Clustal x進(jìn)行比對(duì)分析，選取WRKY和鋅指結(jié)構(gòu)域保守序列，采用MEGA 5.0中的NJ（Neighbor-jioining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，參數(shù)選擇Bootstrap為1000。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的繪制與優(yōu)化使用Itol在線工具（http：//itol.embl.de/）完成。

1.5基因密碼子使用偏性分析

利用CodonW 1.4.4對(duì)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因CDS序列密碼子的使用偏性進(jìn)行分析，包括密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、有效密碼子數(shù)（ENC）、密碼子第3位GC含量（GC3s）和平均親水性值（Gravy）等參數(shù)。以GC3s為橫坐標(biāo)、ENC為縱坐標(biāo)繪制ENC-plot圖譜。圖譜中的曲線為ENC預(yù)期值，表示密碼子使用偏性僅由堿基組成決定，計(jì)算公式為：ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+（1-GC3s）2]。分布點(diǎn)越靠近標(biāo)準(zhǔn)曲線表示密碼子使用偏性受堿基突變影響越大，越遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線表示密碼子使用偏性受自然選擇影響越大。使用EMBOSS explorer網(wǎng)站（http：//emboss.toulouse.inra.fr/）在線軟件Cusp對(duì)同義密碼子的相對(duì)使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定及其序列分析結(jié)果

基于桑樹(shù)全基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)BLASTp同源搜索和SMART保守結(jié)構(gòu)域鑒定，共獲得55個(gè)桑樹(shù)WRKV～錄因子基因（表1），占桑樹(shù)基因總數(shù)（29261）的1.88%。其中，蛋白氨基酸殘基數(shù)小于300 aa的基因序列占24%，介于300-650 aa的基因序列占71%，大于650 aa的基因序列占5%。

桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因存在6種內(nèi)含子數(shù)量類型（圖1）。其中，有27個(gè)基因含有2個(gè)內(nèi)含子，為數(shù)量最多的類型；有10個(gè)基因含有4個(gè)內(nèi)含子；WRKY9基因的內(nèi)含子數(shù)量達(dá)14個(gè)，為內(nèi)含子數(shù)量最多的類型。桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因內(nèi)含子相位類型有15種，呈多樣性。其中，有25個(gè)基因的內(nèi)含子相位為2-2型，是基因數(shù)量最多的類型；有6個(gè)基因的內(nèi)含子相位為2型。進(jìn)化組Ⅰ和進(jìn)化組Ⅱc中的基因內(nèi)含子數(shù)量和相位類型較多樣，說(shuō)明組內(nèi)基因來(lái)源較復(fù)雜；進(jìn)化組Ⅱa、進(jìn)化組Ⅱb、進(jìn)化組Ⅱd、進(jìn)化組Ⅱe和進(jìn)化組Ⅲ中的基因結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子相位類型高度一致，內(nèi)含子相位為2—2型，可能是由同一祖先基因復(fù)制而來(lái)。

2.2桑樹(shù)WRKY家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

利用MEGA 5.05對(duì)72個(gè)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白和55個(gè)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的保守結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要分為三大類（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），其中，第Ⅰ類根據(jù)WRKY保守結(jié)構(gòu)域處于N端或C端，可分為ⅠN和ⅠC兩個(gè)亞組；第Ⅱ類根據(jù)聚類情況又可分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5個(gè)亞組（圖2）。但MnWRKY49和MnWRKYlC未歸入以上分組。

2.3桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

使用MEME SUITE對(duì)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守氨基酸Motif進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有五類Moti啪保守性較強(qiáng)，其正則表達(dá)式如圖3所示。其中，Motif 1是WRKY Motif，在桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中高度保守；Motif 3為進(jìn)化組I N端的WRKY保守結(jié)構(gòu)域；Motif 2為鋅指結(jié)構(gòu)，僅MnWRKY28、MnWRKY43和MnWRKY54缺少該結(jié)構(gòu)域。55個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白均具有Motif 1，所有I類基因蛋白均具有Motif 1和Motif 3。Motif 4為未知結(jié)構(gòu)域，Motif 5為L(zhǎng)XsLXgLX3L基序，類似LRR結(jié)構(gòu)域，進(jìn)化組I、進(jìn)化組Ⅱa和進(jìn)化組Ⅱc的基因蛋白結(jié)構(gòu)包含Motif4，進(jìn)化組Ⅱa、進(jìn)化組Ⅱb和進(jìn)化組Ⅲ的基因蛋白結(jié)構(gòu)包含Motif 5。部分桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)存在變異，如進(jìn)化組Ⅱc中MnWRKY50和MnWRKY51的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)閃RKYGKK，MnWRKY28和MnWRKY54的鋅指結(jié)構(gòu)缺少CX.sCX22.23部分，進(jìn)化組Ⅲ中MnWRKYl9和MnWRKY23的鋅指結(jié)構(gòu)分別為CX7CX23HRC和CX7CX23HIC，保守氨基酸殘基發(fā)生變異。

2.4桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因啟動(dòng)子區(qū)特征分析結(jié)果

桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因啟動(dòng)子區(qū)均含有PBF結(jié)合元件（AAAGC），每個(gè)基因啟動(dòng)子平均含有4.8個(gè)元件（表2），PBF屬于Dof家族C2H2鋅指因子類，有助于bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA（Vicente-Carb aiosaet al.，1997）；另外兩種C2H2鋅指因子類（DOF2.4和DOF5.3）含量也較高。55個(gè)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因中有28個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)含有AHL20結(jié)合元件（AATTAAAT），AHLl2與AHL20轉(zhuǎn)錄因子均屬于擬南芥hook因子，能特異性結(jié)合與核基質(zhì)附著相關(guān)且富含AT的DNA序列，通過(guò)下調(diào)PAMP引發(fā)的NH01和FRKl可負(fù)調(diào)控植物對(duì)病原菌的先天性免疫作用（Lu et al.，2010）。此外，部分桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因啟動(dòng)子區(qū)含有bZIP、ERF、GT-1、MYB、TGA和WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列。

2.5桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因密碼子使用偏性分析結(jié)果

為了解桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因密碼子使用偏性，對(duì)ENC、GC3s和Gravy等參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因ENC介于48.00-60.00，GC3s介于0.330-0.722，Gravy均為負(fù)值（表3），表明桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白均為親水性蛋白，且多數(shù)具有強(qiáng)親水性。

ENC與GC3s的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，基因分布越靠近ENC-plot圖譜標(biāo)準(zhǔn)曲線表示密碼子使用受堿基突變壓力影響越大，基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方或遠(yuǎn)離曲線，表示基因受自然選擇壓力影響越大。GC3s分布則反映植物所受的選擇壓力，GC3s分布越廣泛，表明密碼子使用偏性受堿基突變壓力越大，GC3s分布范圍越小，表明密碼子使用偏性受正向選擇壓力影響越大（Kawabe and Mivashita，2003）。由圖4可知，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因的GC3s介于0.330-0.722，分布較廣泛，且多數(shù)基因ENC分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，表明桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因同時(shí)受到堿基突變和正向選擇壓力的影響。

RSCU是同義密碼子實(shí)際使用量與理論使用量的比值。RSCU>1.000，表示密碼子使用頻率高于其他同義密碼子；反之則使用頻率低。由表4可知，RSCU>I.000的密碼子有29個(gè)，且以A（6個(gè)）或T（11個(gè)）結(jié)尾較G（4個(gè)）或C（8個(gè)）結(jié)尾的略多，說(shuō)明桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因的密碼子使用偏性較弱，略偏好A或T結(jié)尾。

3討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白為植物特有轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物多種生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控。至今，多個(gè)已完成基因組測(cè)序植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因被鑒定，番茄基因組中有81個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因（Wu et al.，2005），黃瓜有55個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因（Ross et al.，2007），大豆有176個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因（Ling et al.，2011），棉花有113個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因（Huang et al.，2012），粳稻有98個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因（周宗梁等，2012），擬南芥有72個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因（Zelasko et al.，2013），蘋(píng)果有132個(gè)WRKY家族基因（谷彥冰等，2015）。Baranwal等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)基因組中含有54個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。同一家族基因的數(shù)量與植物進(jìn)化過(guò)程中基因復(fù)制、基因組重排等有關(guān)，如水稻、番茄、蘋(píng)果和棉花的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族均存在基因復(fù)制現(xiàn)象（Wu et al.，2005；Huang et al.，2012；周宗梁等，2012），但在WRKY轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量較少的黃瓜中未發(fā)現(xiàn)基因復(fù)制現(xiàn)象（Ross et al.，2007）。WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)目除了與物種基因組有關(guān)外，還與植物進(jìn)化過(guò)程中所受的環(huán)境壓力有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因數(shù)量為55個(gè)，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因相對(duì)較少的物種類型，說(shuō)明進(jìn)化過(guò)程中該家族基因受到的環(huán)境壓力較小。

基因結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子數(shù)量及相位類型是研究基因進(jìn)化的重要證據(jù)。根據(jù)剪接中位置的不同，內(nèi)含子分為3種相位類型，0型內(nèi)含子位于2個(gè)密碼子之間，1型內(nèi)含子位于密碼子的第1和第2堿基之間，2型內(nèi)含子位于密碼子的第2和第3堿基之間（Sharp，1981）。內(nèi)含子相位的改變會(huì)導(dǎo)致后續(xù)閱讀框發(fā)生變化，因此內(nèi)含子的相位通常比較保守。本研究中，桑樹(shù)WRKY家族蛋白主要分為三大類（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），且有2個(gè)蛋白（MnWRKY49和MnWRKYlC）未進(jìn)行分組，與Baranwal等（2016）將桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族分為四類的研究結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，同一進(jìn)化組的基因結(jié)構(gòu)內(nèi)含子數(shù)量和相位類型高度一致，進(jìn)化組Ⅱa和進(jìn)化組Ⅱb的內(nèi)含子相位類型全部為0型，進(jìn)化組Ⅱd、進(jìn)化組Ⅱe和進(jìn)化組Ⅲ全部為2型。約50%桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因包含2個(gè)內(nèi)含子，其中有25個(gè)基因的內(nèi)含子相位為2-2型，分別屬于進(jìn)化組Ⅱc、進(jìn)化組Ⅱd、進(jìn)化組Ⅱe和進(jìn)化組Ⅲ，推測(cè)其來(lái)源于共同的祖先基因。

本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，桑樹(shù)WRKY家族蛋白主要分為三大類，Ⅱ類又分為5個(gè)亞組。所有成員均含有保守基序WRKYGQK（MnWRKY50和MnWRKY51為WRKYGKK外），Ⅰ類和Ⅱ類還包含有保守的鋅指結(jié)構(gòu)C2H2（除MnWRKY28和Mn-WRKY54缺少外），Ⅲ類的鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC。Rinerson等（2015）研究認(rèn)為，植物中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因存在兩種可能的起源方式，一種起源于Ⅰ類蛋白C端WRKY結(jié)構(gòu)域，一種起源于藻類Ⅱa或Ⅱb的某一蛋白結(jié)構(gòu)域。桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)有五類Motif的保守性較強(qiáng)，所有桑樹(shù)WRKY蛋白中均包含C端Motif 1，Ⅰ類蛋白同時(shí)含有N端Motif 3。進(jìn)化組Ⅱa、進(jìn)化組Ⅱb和進(jìn)化組Ⅲ中含有類似LRR結(jié)構(gòu)域的Motif 5?？梢?jiàn)，植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族結(jié)構(gòu)上高度保守，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能起源于I類基因蛋白C端WRKY結(jié)構(gòu)域。

WRKY蛋白特異性結(jié)合DNA的最小基序TTGAC（C/T）稱作W-box。多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)基因啟動(dòng)子中均含有數(shù)量不定的W-box，彼此間或同向排列或形成回文結(jié)構(gòu)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，而調(diào)節(jié)下游功能基因或其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（Eulgem et al.，2000）。一些植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因啟動(dòng)子中也存在W-box，如擬南芥WRKYl8啟動(dòng)子中的W-box是起負(fù)調(diào)控作用的順式作用元件，能阻止擬南芥WRKYl8在抗病期間的過(guò)量表達(dá)，從而緩解該基因?qū)χ参锷L(zhǎng)造成的影響（Chen andChen，2002）。多種WRKY轉(zhuǎn)錄因子可形成復(fù)合物以調(diào)控植物的抗病性。Baranwal等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)WRKY基因上游啟動(dòng)子區(qū)富含AAAG、GAAAA和AGAAA等序列。本研究也發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因啟動(dòng)子區(qū)的AAAGC、AAAAAGT和GAAAAAG數(shù)量較多，且部分桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因啟動(dòng)子區(qū)含有bZIP、ERF、GT-1、MYB、TGA和WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，而這些轉(zhuǎn)錄因子大多與逆境脅迫有關(guān)。

桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因同時(shí)受堿基突變和正向選擇壓力的影響，其中以堿基突變選擇壓力占主導(dǎo)地位?；蛎艽a子使用偏性與植物基因組組成及其所處的脅迫環(huán)境有直接關(guān)系（宋輝等，2015）。雙子葉植物偏好A/T結(jié)尾的密碼子，單子葉植物偏好G/C結(jié)尾的密碼子（Tatarinova et al.，2010），偏性強(qiáng)的基因偏好使用G/C結(jié)尾的密碼子（Gu0 et al.，2007）。桑樹(shù)屬于雙子葉植物，雖然RSCU>1.000的密碼子中以A/T結(jié)尾的略多，但密碼子使用偏性并不強(qiáng)，多數(shù)屬于低表達(dá)基因。Baranwal等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達(dá)具有器官特異性，在54個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因中有13個(gè)基因在根部表達(dá)，25個(gè)基因在樹(shù)皮中表達(dá)，10個(gè)在雄蕊中表達(dá)，但總體來(lái)看，檢測(cè)到的表達(dá)基因數(shù)目較少，基因相對(duì)表達(dá)倍數(shù)不高。這在本研究中得到進(jìn)一步證實(shí)，即桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因密碼子使用偏性較弱。

4結(jié)論

桑樹(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族包含55個(gè)成員，內(nèi)含子相位類型一致的同組成員可能來(lái)源于同一祖先基因，且與基因復(fù)制和基因組重排事件有關(guān)；蛋白序列高度保守，多數(shù)含有完整的WRKYGQK和鋅指結(jié)構(gòu)，在植物抵御環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用；基因密碼子使用偏性較弱，主要受堿基突變選擇壓力影響，多數(shù)屬于低表達(dá)基因，表明桑樹(shù)受環(huán)境脅迫壓力較小。