呂鎮(zhèn)城　陳康　彭永宏

摘 要 以對5-LOX的抑制活性為抗炎活性評價指標，在活性跟蹤下從五指毛桃中分離到6個化合物，經波譜數(shù)據(jù)分析后被鑒定為：羽扇豆醇棕櫚酸酯（1）、β-香樹脂醇乙酸酯（2）、補骨脂素（3）、芹菜素（4）、壬二酸（5）和胡蘿卜苷（6），其中，化合物5、1對5-LOX表現(xiàn)出強的抑制活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為13.74 μg/mL和13.96 μg/mL；化合物1為首次從五指毛桃中分離得到。本研究結果可為五指毛桃的抗炎作用研究及其臨床應用提供理論參考。

關鍵詞 五指毛桃；抗炎活性；5-LOX 抑制活性；化學成分；結構鑒定

中圖分類號 R284.2 文獻標識碼 A

Abstract To investigate the anti-inflammatory activity of the roots of Ficus hirta Vahl. 5-lipoxygenase（5-LOX）inhibitory activity was selected as the evaluation index. Six compounds were separated from this material by 5-lipoxygenase inhibitory activity-guided isolation. Their structures were identified as lupeol palmitate（1）， β-amyrin acetate（2）， psoralen（3）， apigenin（4）， azelaic acid（5）， daucosterol（6）on the basis of NMR spectroscopic analyses. Compound 5 and 1 exhibited strong in vitro inhibitory activity on 5-LOX with IC50 values 13.74 μg/mL and 13.96 μg/mL， respectively. Compound 1 was reported for the first time from F. hirta roots. The results may provide theoretical supports for the anti-inflammatory effect and clinical application of F. hirta roots.

Key words Ficus hirta Vahl. roots； anti-inflammatory activity； 5-LOX inhibitory activity； chemical constituents； structure identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.024

五指毛桃（Ficus hirta Vahl.）別名五爪龍，是?？疲∕oraceae）植物粗葉榕的干燥根，為嶺南習用草藥。據(jù)中醫(yī)典籍記載，五指毛桃性平，味甘、辛，有健脾補肺、利濕舒筋之功[1]。作為中醫(yī)常用中藥，五指毛桃臨床上被用于脾虛浮腫、肺癆咳嗽、盜汗、慢性盆腔炎等癥，在民間特別是嶺南地區(qū)也被廣泛用于保健養(yǎng)生，其藥食兩用歷史悠久[2-3]。

目前，人們已經從五指毛桃中分離鑒定出多種化合物，如香豆素、黃酮、烯萜、甾醇和皂苷等[4-6]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，五指毛桃具有良好的抗腫瘤作用[7]。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)五指毛桃具有良好的5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）抑制活性。5-LOX是生物體內一種重要的雙加氧酶，是催化花生四烯酸生成白三烯類（leukotrienes，LTs）的關鍵酶，LTs是重要的炎癥介質，在許多疾病中扮演著重要的角色[8]。近年來，許多學者致力于以5-LOX為靶標來開發(fā)5-LOX抑制劑，從而為抗炎藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。但是，五指毛桃的抗炎活性成分至今尚未明確。因此，本研究以5-LOX抑制活性為指標，在活性跟蹤下對五指毛桃抗炎活性物質的化學成分進行分離純化和結構鑒定，以明確其抗炎活性成分，為深入研究五指毛桃的抗炎作用機理及其在臨床上的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 五指毛桃由廣東省河源五指毛桃GAP生產基地提供，經華南師范大學彭永宏教授鑒定后可知其為桑科植物粗葉榕的干燥根，憑證標本（編號15023）保存于華南師范大學生命科學學院。

薄層色譜硅膠及柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（GE Healthcar公司）；5-LOX和去甲二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA）（Cayman 公司）；其它試劑為分析純。

1.1.2 儀器設備 Bruker DRX-600型超導核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；RY-1G熔點儀（天津市新天光分析儀器技術有限公司）；RV10旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；UV-2450紫外可見分光光度計 （日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離 取10 kg五指毛桃，用95%乙醇提取3次，每次7 d，經減壓濃縮得提取物浸膏；用水將浸膏分散后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚部浸膏224 g，乙酸乙酯部浸膏171 g，水部浸膏445 g。由于乙酸乙酯部的5-LOX抑制活性最好，因此，選擇乙酸乙酯部進行分離純化。乙酸乙酯部171 g經硅膠柱以石油醚 ∶ 乙酸乙酯（V ∶ V=5 ∶ 1～1 ∶ 10）梯度洗脫，收集到20個餾分Fr1～Fr20，并選擇活性強的Fr4、Fr5、Fr8和Fr17 4個餾分作進一步的分離純化。Fr4餾分先后以石油醚-氯仿（V ∶ V=7 ∶ 3）經硅膠柱反復層析后得化合物1（0.29 g），經Sephadex LH-20柱層析得化合物2（0.048 g），以石油醚-氯仿-乙酸乙酯（V ∶ V ∶ V=5 ∶ 3 ∶ 1）經硅膠柱反復層析后得化合物3（4.63 g）。Fr5餾分以石油醚-氯仿-甲醇（V ∶ V ∶ V=6 ∶ 10 ∶ 1）經硅膠柱反復層析后得化合物4（0.43 g）。Fr8餾分以氯仿-乙酸乙酯（V ∶ V ∶ =7 ∶ 5）經硅膠柱反復層析后，上Sephadex LH-20柱層析，得化合物5（0.28 g）。Fr17餾分以石油醚-氯仿-甲醇（V ∶ V ∶ V=3 ∶ 10 ∶ 1）經硅膠柱反復層析后得化合物6（0.27 g）。

1.2.2 5-LOX抑制活性測定 5-LOX抑制活性測定參考Gaffney[9]的方法，NDGA為陽性對照，抑制率按下列公式計算：

抑制率/%=[（A0-A1）/A0]×100，其中A0和A1分別表示空白組和處理組。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

在活性跟蹤下，對五指毛桃活性成分進行分離純化，從中得到6個化合物，并結合光譜分析法鑒定其結構（圖1）。

化合物1：白色粉末， m.p. 54～56 ℃， 分子式為C46H80O2。1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 0.77 （3H， s， H-24）， 0.83（3H， s， H-28）， 0.86 （3H， s， H-25）， 0.92（3H， s， H-27）， 1.01（3H， s， H-26）， 1.24（3H， s）， 1.67（3H， s， H-30）， 2.27 （lH， d， H-19）， 4.46 （lH， dd， H-3）， 4.56（lH， br d， J=6 Hz， H-29a）， 4.67（lH， br d， J=6 Hz， H-29b）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC： 80.6（C-1）， 23.7（C-2）， 38.3（C-3）， 37.8（C-4）23.7（C-5）， 23.7（C-6）， 55.4（C-7）， 16.7（C-8）， 34.8（C-9）， 40.8（C-10）， 18.2（C-11）， 42.8（C-12）， 14.5（C-13）， 27.4（C-14）， 35.5（C-15）， 43.0（C-16）， 18.0（C-17）， 40.0（C-18）， 29.8（C-19）， 48.0（C-20）， 150.9（C-21）， 109.3（C-22）， 20.9（C-23）， 48.3（C-24）， 37.8（C-25）， 25.2（C-26）， 22.6（C-27）， 50.3（C-28）， 37.1（C-29）， 16.2（C-30）， 22.7（C-31）， 31.9（C-32）， 29.3（C-33）， 29.6（C-34）， 29.6（C-35）， 29.6（C-36）， 29.7（C-37）， 29.7（C-38）， 29.7（C-39）， 29.8（C-40）， 29.2（C-41）， 29.2（C-42）， 25.1（C-43）， 34.2（C-44）， 173.7（C-45）， 14.1（C-46）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物1為羽扇豆醇棕櫚酸酯，該化合物為首次從五指毛桃中分離得到。

化合物2：白色粉末，m.p. 238～240 ℃，分子式C32H52O2。 1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 0.79（3H， s）， 0.87（3H×2， d）， 0.92（3H， s）， 0.97（3H， d）， 1.00（3H， s）， 1.06（3H， s）， 2.05（3H， s， -OCOCH3）， 4.50（1H， m， H-3）， 5.18（1H， t， H-12）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC： 38.4（C-1）， 23.2（C-2）， 80.9（C-3）， 37.7（C-4）， 55.2（C-5）， 18.2（C-6）， 32.8（C-7）， 40.0（C-8）， 46.7（C-9）， 36.7（C-10）， 23.6（C-11）， 124.3（C-12）， 139.6（C-13）， 42.0（C-14）， 28.7（C-15）， 26.1（C-16）， 33.7（C-17）， 59.0（C-18）， 39.6（C-19）， 39.6（C-20）， 31.2（C-21）， 41.5（C-22）， 28.0（C-23）， 16.8（C-24）， 15.5（C-25）， 16.8（C-26）， 23.3（C-27）， 28.7（C-28）， 17.5（C-29）， 21.4（C-30）， 21.3（C-31）， 171.0（C-32）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物2為β-香樹脂醇乙酸酯。

化合物3：白色固體，m.p. 161～163 ℃，分子式C11H6O3。1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 6.31（1H，d， J=10.1Hz， H-4）， 6.79（1H， d， J=2.2Hz， H-9）， 7.39（1H， s， H-13）， 7.63（1H， s， H-10）， 7.70（1H， d， J=2.2Hz， H-7）， 7.77（1H， d， J=9.6Hz， H-5）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC：161.0（C-1）， 114.5（C-2）， 144.1（C-3）， 119.8（C-45）， 124.8（C-5）， 156.3（C-6）， 99.7（C-7）， 151.9（C-8）， 115.3（C-9）， 106.4（C-10）， 146.9（C-11）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致， 故鑒定化合物3為補骨脂素。

化合物4：黃色粉末，m.p. > 300 ℃，分子式C15H10O5。1H-NMR（400MHz， DMSO-d6）δH： 12.97（1H，s， 5-OH）， 10.82（1H， brs， OH）， 10.37（1H， brs， OH）， 6.80（1H， s， H-3）， 6.19（1H， J=2.1Hz， H-6）， 6.48（1H， d， J=2.1Hz， H-8）， 7.93（2H， d， J=8.7Hz， H-2， 6）， 6.93（2H， d， J=8.7Hz， H-3， 5）. 13C-NMR（100MHz， DMSO-d6）δC： 164.1（C-1）， 103.2 （C-2）， 182.2（C-3）， 161.8（C-4）， 99.2（C-5）， 164.5（C-6）， 94.4（C-7）， 157.7（C-8）， 104.1（C-9）， 121.6（C-1′）， 128.9（C-2′）， 116.4（C-3′）， 161.6（C-4′）， 116.4（C-5′）， 128.9（C-6′）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物4為芹菜素。

化合物5：白色粉末，m.p. 101～102 ℃，分子式C9H16O4。1H-NMR（400MHz， CD3OD）δH： 2.24-2.27（4H， t， J=7.2Hz， H-2， 8）， 1.54-1.59（4H， M， H-3， 7）， 1.37-1.53（6H， m， H-4， 5， 6）. 13C-NMR（100MHz， CD3OD）δC： 176.3（C-1， 9）， 33.6（C-2， 8）， 24.6（C-3， 7）， 28.6（C-4， 5， 6）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物5為壬二酸。

化合物6：白色粉末，m.p. 289～290 ℃，分子式C35H60O6。1H-NMR（400MHz， DMSO-d6）δH： 0.88-0.94（9H， m， 3×CH3）， 0.96（3H， s， 26-H）， 0.99（3H， d， 21-H）， 1.12（s， CH3-19）， 1.45（s， CH3-20）， 1.77（s， CH3-18）， 2.48（m， H-4）， 2.88（m， H-4）， 3.11（m， glc-2）， 3.33（m， glc-5）， 3.36-3.38（m， glc-3， glc-4）， 3.40（m， H-3）， 3.45（dd， J=11， 4.4Hz， glc-6a）， 3.62（dd， J=11， 3.3Hz， glc-6b）， 4.43（d， J=7.3Hz， glc-1）， 5.31（brd， J=4.5Hz， H-6）. 13C-NMR（100MHz， DMSO-d6）δC： 36.64（C-1）， 29.69（C-2）， 77.28（C-3）， 39.50（C-4）， 140.84（C-5）， 121.89（C-6）， 31.84（C-7）， 31.80（C-8）， 50.01（C-9）， 39.2（C-10）， 20.16（C-11）， 39.29 （C-12）， 42.27（C-13）， 56.59（C-14）， 24.49（C-15）， 29.69（C-16）， 55.83（C-17）， 11.95（C-18）， 19.54（C-19）， 39.92（C-20）， 19.19（C-21）， 34.20 （C-22）， 26.39（C-23）， 45.54（C-24）， 29.09（C-25）， 18.99（C-26）， 19.95（C-27）， 20.16（C-28）， 12.14（C-29）， 101.75（C-1′）， 77.28（C-2′）， 77.18 （C-3′）， 70.49（C-4′）， 73.88（C-5′）， 61.83（C-6′）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物6為胡蘿卜苷。

2.2 對5-LOX的抑制活性測定結果

不同極性浸膏對5-LOX的抑制活性（圖2）顯示，乙酸乙酯部的活性最好，IC50值為34.28 μg/mL。以NDGA為陽性對照，測定6個化合物對5-LOX的IC50值（表1），結果顯示化合物1和5表現(xiàn)出良好的抑制活性，IC50值分別為13.96和13.74 μg/mL?；衔?次之，IC50值為28.11 μg/mL?；衔?、4、6的活性相對較弱，IC50值分別為49.97、44.41和35.56 μg/mL。

3 討論

在5-LOX抑制活性的跟蹤下，對五指毛桃抗炎活性成分進行分離純化，從中得到6個化合物，并運用光譜法鑒定其結構?；衔?（羽扇豆醇棕櫚酸酯）和化合物5（壬二酸）表現(xiàn)出良好的活性，其中化合物1為首次從五指毛桃中分離得到。壬二酸在臨床上常用于治療痤瘡，其作用機制是通過清除皮孔上的細菌而實現(xiàn)[16-17]。此外，壬二酸還能降低被認為是促進痤瘡細菌生長的角質蛋白的累積[17]。羽扇豆醇棕櫚酸酯是羽扇豆醇的衍生物，后者是被認為具有抗炎及抗癌作用的烯萜類化合物[18]。研究指出，羽扇豆醇棕櫚酸酯對胰蛋白酶具有抑制活性，是胰蛋白酶的非競爭性抑制劑[19-20]。此外，羽扇豆醇棕櫚酸酯還能夠通過顯著降低乳酸脫氫酶的釋放來改善關節(jié)炎癥狀[21]。

綜上，以對5-LOX的抑制活性為指標，考察五指毛桃的抗炎活性成分，從中分離得到6個化合物，其中壬二酸和羽扇豆醇棕櫚酸酯對5-LOX表現(xiàn)出強的抑制活性，羽扇豆醇棕櫚酸酯為首次從該植物中分離得到，并首次報道這2個化合物對5-LOX具有抑制活性，可為深入研究五指毛桃的抗炎作用機理及其臨床應用提供理論參考。

參考文獻

[1] 廣東中藥志編委會. 廣東中藥志（上）[M]. 廣州： 廣東科技出版社， 1994： 163.

[2] 李紅英. 自擬五指毛桃液治療慢性盆腔炎的療效觀察[J]. 現(xiàn)代醫(yī)院， 2005， 5（5）： 49.

[3] 謝新建， 賴映君， 鄒國強. 抗癆丸聯(lián)合化療治療80例肺結核的療效觀察[J]. 國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報， 2009， 15（16）： 101-102.

[4] 楊 杰， 衛(wèi)東鋒， 王文瀟， 等. 五指毛桃水提物對免疫抑制小鼠細胞免疫的影響[J]. 中藥藥理與臨床， 2015， 31（6）： 111-114.

[5] 鄭蓉蓉， 軋 霽， 王文婧， 等. 五指毛桃的化學成分研究[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（21）： 3 696-3 701.

[6] 軋 霽， 張曉琦， 王 英， 等. 五指毛桃黃酮和香豆素類成分研究[J]. 林產化學與工業(yè)， 2008， 28（6）： 49-52.

[7] Zeng Y W， Liu X Z， Lv Z C， et al. Effects of Ficus hirta Vahl. （Wuzhimaotao）extracts on growth inhibition of HeLa cells[J]. Exp Toxicol Pathol， 2011， 64（7-8）： 743-749.

[8] Haeggstrom J Z， Funk C D. Lipoxygenase and leukotriene pathways： biochemistry， biology， and roles in disease[J]. Chem Rev， 2011， 111（10）： 5 866-5 898.

[9] Gaffney B J. Lipoxygenases： structural principles and spectroscopy[J]. Annu Rev Biophys Biomol Struct， 1996， 25（1）： 431-459.

[10] 張曉琦， 戚 進， 葉文才， 等. 蒼耳莖化學成分的研究[J]. 中國藥科大學學報， 2004， 35（5）： 404-405.

[11] 張建烽， 李友賓， 錢士輝， 等. 白首烏化學成分研究[J]. 中國中藥雜志， 2006， 31（10）： 814-816.

[12] 白鋼鋼， 袁 斐， 毛坤軍， 等. 明黨參根皮化學成分研究[J]. 中草藥， 2014， 45（12）： 1 673-1 676.

[13] 楊彥霞， 閆福林， 王 翔. 石榴花化學成分研究[J]. 中藥材， 2014， 37（5）： 804-807.

[14] 孔麗娟， 梁僑麗， 吳啟南， 等. 黑三棱的化學成分研究[J]. 中草藥， 2011， 42（3）： 440-442.

[15] 朱小迪， 李永慈， 王建忠， 等. 黃心衛(wèi)矛化學成分的分離與鑒定[J]. 中成藥， 2011， 33（1）： 107-110.

[16] Vargas-Diez E， Hofmann M A， Bravo B， et al. Azelaic acid in the treatment of acne in adult females： case reports[J]. Skin Pharmacol Physiol， 2014， 27（Suppl 1）： 18-25.

[17] Kircik L H. Efficacy and safety of azelaic acid （AzA） gel 15% in the treatment of post-inflammatory hyperpigmentation and acne： a 16-week， baseline-controlled study[J]. J Drugs Dermatol， 2011， 10（6）： 586-590.

[18] Saleem M. Lupeol， a novel anti-inflammatory and anti-cancer dietary triterpene[J]. Cancer Lett， 2009， 285（2）： 109-115.

[19] Hodges L D， Kweifio-Okai G， Macrides T A. Antiprotease effect of anti-inflammatory lupeol esters[J]. Mol Cell Biochem， 2003， 252（1-2）： 97-101.

[20] Rajic A， Kweifio-Okai G， Macrides T， et al. Inhibition of serine proteases by anti-inflammatory triterpenoids[J]. Planta Med， 2000， 66（3）： 206-210.

[21] Kweifio-Okai G， De Munk F， Rumble B A， et al. Antiarthritic mechanisms of amyrin triterpenes[J]. Res Commun Mol Pathol Pharmacol， 1994， 85（1）： 45-55.