雷燕 肖洋 王娟 張文文 戚瑞榮 張會(huì)軍 王學(xué)鵬

摘要[目的]對(duì)江蘇省吳中地區(qū)養(yǎng)殖池塘患病的中華絨螯蟹進(jìn)行診斷。[方法]結(jié)合臨床流行病學(xué)調(diào)查和分子生物學(xué)鑒定，對(duì)江蘇省吳中地區(qū)發(fā)病的中華絨螯蟹進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與鑒定。參考GenBank中白斑癥病毒（WSSV）的基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，以從中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺、肌肉等組織提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[結(jié)果]經(jīng)過(guò)解剖觀察，發(fā)現(xiàn)病蟹內(nèi)臟器官無(wú)明顯變化。從病蟹的肝胰腺和肌肉中未分離到致病菌。通過(guò)PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性產(chǎn)物，測(cè)序比對(duì)顯示擴(kuò)增條帶的基因序列與WSSV的基因序列同源性高達(dá)99.6%。病理切片顯示鰓和肝胰腺可見(jiàn)大量細(xì)胞核腫大細(xì)胞，與WSSV引起對(duì)蝦組織的病變相一致。[結(jié)論]經(jīng)初步診斷，確定引起中華絨螯蟹發(fā)病死亡的病原為WSSV。

關(guān)鍵詞中華絨螯蟹；白斑癥病毒；診斷；組織病理變化

中圖分類號(hào)S945.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）05-0089-03

Abstract[Objective] To diagnose the diseased Eriocheir sinensis in culture pond of Wuzhong Region of Jiangsu Province. [Method] The laboratory detection and identification were made on diseased E. sinensis by using clinical epidemiological investigation and molecular biological identification. One pair of specific primers were designed according to WSSV sequence in GenBank. DNA was extracted from the gill， hepatopancreas， muscle and other organs of E. sinensis and taken as templates to make PCR amplification. [Result] It was found that there was no obvious change of visceral organs in diseased E. sinensis by anatomical observation. No pathogenic bacterium was isolated from liver and muscle of diseased E. sinensis. Specific products with predicted size were obtained from diseased E. sinensis by PCR. The sequencing comparison results showed that the homology of nucleotide sequences between the amplified brands and WSSV was 99.6%. By observing the pathological sections， it was found that there were a large number of cells with enlargement nucleus in the gill and liver of diseased E. sinensis， which was accordant with the lesions of shrimp infected by WSSV. [Conclusion] The pathogen of diseased E. sinensis was confirmed as WSSV by tentative diagnosis.

Key wordsEriocheir sinensis；White spot syndrome virus（WSSV）；Diagnosis；Histopathological changes

基金項(xiàng)目浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012F20029）；中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)學(xué)科項(xiàng)目；溫州市重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（C2012004-02）；浙江省重大科技專項(xiàng)（2012C12017-3）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011N0006）。

作者簡(jiǎn)介雷燕（1983—），男，四川綿陽(yáng)人，工程師，碩士，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害研究。

通訊作者，副教授，博士，從事水生動(dòng)物病害防控研究。

收稿日期2016-12-29

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱河蟹，隸屬甲殼綱（Crustacea）十足目（Decapoda）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬（Eriocheir），是一種重要的經(jīng)濟(jì)蟹類。我國(guó)中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，已經(jīng)形成規(guī)?；?。然而，細(xì)菌性疾病與病毒性疾病不斷發(fā)生[1-3]，嚴(yán)重影響中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖。隨著消費(fèi)量的不斷增加，為了提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，在生產(chǎn)中常采用多品種混養(yǎng)的養(yǎng)殖模式，如克氏原螯蝦與中華絨螯蟹混養(yǎng)等[4]。然而，近年來(lái)，進(jìn)入6月后經(jīng)常發(fā)生克氏原螯蝦大批量死亡后，處于相同養(yǎng)殖池塘中的中華絨螯蟹隨后出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)池塘的克氏原螯蝦和中華絨螯蟹全部死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

2015年6月，江蘇省蘇州市吳中地區(qū)的克氏原螯蝦與中華絨螯蟹混養(yǎng)池塘的克氏原螯蝦出現(xiàn)大面積發(fā)病死亡，約7 d后大部分克氏原螯蝦發(fā)病池塘的中華絨螯蟹也出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象。發(fā)病河蟹的主要外觀癥狀為全身無(wú)力，解剖未見(jiàn)其他明顯病變。筆者參照文獻(xiàn)[5-6]從細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)和組織病理學(xué)3個(gè)方面對(duì)江蘇省吳中地區(qū)發(fā)病中華絨螯蟹進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并結(jié)合臨床流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)鑒定對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

發(fā)病中華絨螯蟹于2015年6月取自江蘇省蘇州市吳中地區(qū)部分克氏原螯蝦和中華絨螯蟹混養(yǎng)池塘，共選取10只發(fā)病的中華絨螯蟹；2只正常的中華絨螯蟹，采自江蘇省南京市某中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘。

2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL2000 DNA Marker，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的白斑癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）基因的保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性的檢測(cè)引物序列，上游引物WSSV-F為5-GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3；下游引物WSSV-R為5-CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)441 bp，引物由華大基因有限公司合成。

1.2.2流行病學(xué)調(diào)查及臨床檢查。

對(duì)發(fā)病養(yǎng)殖池塘的水溫、水質(zhì)指標(biāo)、水源以及發(fā)病中華絨螯蟹苗種來(lái)源、傳染性、發(fā)病率和死亡率等進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，觀察發(fā)病中華絨螯蟹在養(yǎng)殖池塘中的活動(dòng)情況，分別選取正常中華絨螯蟹和發(fā)病中華絨螯蟹，觀察其體表癥狀，然后打開(kāi)中華絨螯蟹的背殼，觀察內(nèi)臟組織器官的病變情況。

1.2.3細(xì)菌檢查。

無(wú)菌條件下，分別從發(fā)病中華絨螯蟹和正常中華絨螯蟹的肝胰腺和肌肉中，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)菌分離，將分離后的培養(yǎng)皿包裝好并帶回實(shí)驗(yàn)室，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.4DNA提取。

分別取中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺和肌肉等組織器官，用玻璃組織勻漿器研磨后置于-20 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，備用。DNA提取采用酚-氯仿法，提取的DNA于-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR檢測(cè)。

采用設(shè)計(jì)合成的特異性引物WSSV-F和WSSV-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×Taq PCR MasterMix 10.0 μL，滅菌雙蒸水6.0 μL，DNA模板3.0 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃循環(huán)變性30 s，56 ℃退火復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行含EB（溴化乙錠）的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，將陽(yáng)性目的條帶利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，并將其送至華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.6病理學(xué)觀察。

在解剖并完成細(xì)菌分離培養(yǎng)后，分別取正常和發(fā)病的中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺組織，用波恩氏液固定，梯度酒精脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，切片機(jī)切片，厚度5～6 μm，最后用蘇木精-伊紅（H-E）染色，于Nikon E800 顯微鏡下觀察組織病變并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)病情況和流行病學(xué)調(diào)查

近年來(lái)，江蘇地區(qū)小龍蝦、河蟹混養(yǎng)池塘經(jīng)常發(fā)生小龍蝦發(fā)病大量死亡后中華絨螯蟹也大量死亡的情況，主要發(fā)生在每年6月，池塘水溫升至28 ℃左右，發(fā)病率為60%，發(fā)病池塘死亡率達(dá)80%，嚴(yán)重時(shí)養(yǎng)殖池塘每天死亡河蟹200～300只，直至全部死亡。發(fā)病過(guò)程中使用抗生素?zé)o明顯治療效果，使用水質(zhì)、底質(zhì)改良劑調(diào)水、改底有一定的效果。發(fā)病中華絨螯蟹趴在水草上，活力差，四肢無(wú)力，解剖各個(gè)內(nèi)臟組織器官無(wú)明顯病變。

2.2細(xì)菌的分離結(jié)果

從發(fā)病池塘選取的10只發(fā)病中華絨螯蟹的肝胰腺和肌肉接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，28 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h后，僅見(jiàn)2只中華絨螯蟹的肝胰腺中長(zhǎng)出少量細(xì)菌；從正常中華絨螯蟹也未分離出細(xì)菌。

2.3病毒的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，以中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺、肌肉組織抽提的DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到與預(yù)期目的條帶大小相符的特異性片段，其中10只發(fā)病中華絨螯蟹的組織病料中均能擴(kuò)增出441 bp大小的目的條帶（圖1），而2只正常中華絨螯蟹未擴(kuò)增出目的條帶。將擴(kuò)增的陽(yáng)性目的條帶送至華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中WSSV的基因序列同源性為99.6%。

2.4組織病理變化觀察結(jié)果

染色后進(jìn)行觀察，感染W(wǎng)SSV的中華絨毛蟹鰓內(nèi)可見(jiàn)大量細(xì)胞核腫大細(xì)胞，零星細(xì)胞壞死（圖2B、C）；肝胰腺腺管上皮中大量細(xì)胞核腫大細(xì)胞，腺管間少量細(xì)胞增生、增生細(xì)胞有壞死，腺管間輕微水腫（圖2E、F），而正常中華絨螯蟹的鰓（圖2A）和肝胰腺（圖2D）未見(jiàn)明顯病變。

3討論

白斑癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）是當(dāng)今對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)危害的最大的病毒[7-9]，目前已經(jīng)在我國(guó)蝦類養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛流行。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，WSSV的致病力呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，其宿主范圍也在不斷擴(kuò)大。

江蘇省是河蟹的主要養(yǎng)殖區(qū)域，近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，河蟹疾病也呈暴發(fā)性發(fā)生，每年進(jìn)入6月后水溫升至28 ℃左右，養(yǎng)殖的小龍蝦和河蟹就陸續(xù)發(fā)病，死亡量巨大，使用各種抗生素?zé)o明顯效果，可能是病毒感染所致。

克氏原螯蝦是WSSV的易感宿主之一，曾作為WSSV的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[10-11]，因此在大力發(fā)展蝦蟹混養(yǎng)的同時(shí)，要注意防范WSSV帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。WSSV為一種無(wú)包涵體病毒，宿主范圍廣，流行范圍大，傳染性強(qiáng)，目前尚無(wú)有效的治療藥物，還不能有效地控制疫情。

WSSV主要侵害皮下組織、表皮角質(zhì)層組織、觸角腺、造血組織、鰓、血淋巴器官等組織器官，在對(duì)蝦嚴(yán)重患病組織中可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核腫大細(xì)胞。對(duì)發(fā)病的中華絨螯蟹鰓和肝胰腺進(jìn)行組織切片觀察，其鰓和肝胰腺均可見(jiàn)大量核腫大細(xì)胞，該病變與WSSV引起的蝦組織病變相一致。

該研究對(duì)江蘇省吳中地區(qū)的蝦蟹混養(yǎng)池塘的發(fā)病中華絨螯蟹進(jìn)行了調(diào)查研究，通過(guò)流行病學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)和組織病理學(xué)3個(gè)方面的調(diào)查，確定引起中華絨螯蟹發(fā)病的病原為WSSV。該研究結(jié)果可為今后中華絨螯蟹養(yǎng)殖疾病的防控提供理論依據(jù)。

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