王偉 盧珊 葛冰 郜愛玲 金荷仙

摘 要 為篩選出大苞鞘石斛組培快繁體系各階段最適培養(yǎng)基配方，以大苞鞘石斛無菌苗莖段為外植體，通過正交試驗(yàn)研究不同因素對(duì)大苞鞘石斛植株再生的影響。結(jié)果表明：擬原球莖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為1/2MS+2，4-D 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，誘導(dǎo)出的擬原球莖直徑1.5 mm時(shí)將其從莖段上剝離，并接入原培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)15～20 d；擬原球莖增殖最適培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，繼代周期25～30 d；擬原球莖分化最適培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，分化培養(yǎng)需40 d；將分化的無菌苗繼代于花寶2號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L+IBA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%生根誘導(dǎo)效果最好，培養(yǎng)45 d；生根壯苗最佳培養(yǎng)基為花寶1號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭1 g/L，培養(yǎng)50 d。

關(guān)鍵詞 大苞鞘石斛；組織培養(yǎng)；再生體系；擬原球莖

中圖分類號(hào) Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to study the effects of different factors on the tissue culture and plant regeneration of Dendrobium wardianum， three kinds of factors of three levels were used by an orthogonal design. The stem segments of D. wardianum were used as the explants for tissue culture. Results showed that the optimum PLBs induction medium was 1/2MS+2，4-D 0.2 mg/L+Sugar 30 g/L. When the shoot bud diameter reached to 1.5 mm， it must be detached and transferred to the same media for 15-20 days. The optimum medium for PLBs proliferation was 1/2MS+NAA 1 mg/L+Sugar 30 g/L+CW 10% and the appropriate subculture cycle was about 25 to 30 days. The optimum PLBs differentiation medium was 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+Sugar 30 g/L+CW 10%. The aseptic seedling which obtained from the former culture stage was cultured on the root induction media of Hyponex No.2 3 g/L+Peptone 2 g/L+IBA 1 mg/L+Sugar 30 g/L+CW 10% for 45 days. The optimal medium of strong plantlets and rootage was Hyponex No.1 3 g/L+Peptone 2 g/L+Sugar 30 g/L+Activated carbon 1 g/L.

Key words Dendrobium wardianum； tissue culture； regeneration system； PLBs

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.011

大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum L.）又名騰沖石斛，藥用商品名為扁黃草[1]，含dendrowardine等生物堿[2]、多糖[3]、氨基酸及微量元素等活性成分[4-5]，產(chǎn)于中國(guó)云南高海拔地區(qū)，常附生于樹干上，對(duì)生境要求苛刻，自然狀態(tài)下繁育率極低，加之常被作為觀賞植物和中藥材使用，因此被盜挖者過度采集，野生資源數(shù)量已非常稀少。針對(duì)該現(xiàn)狀，對(duì)大苞鞘石斛種質(zhì)資源的保護(hù)和研究逐漸引起了各界學(xué)者的重視，研究重點(diǎn)主要集中在組織培養(yǎng)等人工快速繁育技術(shù)的探索，通過該技術(shù)可加速種群擴(kuò)繁與品種改良，Luan等[6]發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基中添加萘乙酸（NAA）0.5 mg/L、椰乳20%、蔗糖30 mg/L可作為大苞鞘石斛無菌播種培養(yǎng)基；張小娟等[7]認(rèn)為大苞鞘石斛擬原球莖可在MS（或B5）+ NAA 0.5 mg/L+6-芐基腺嘌呤（6-BA）0.2 mg/L+香蕉2.5%+椰乳2.5%+蔗糖25 g/L中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；吳元玲等[8]、劉曉東等[9]對(duì)大苞鞘石斛擬原球莖超低溫保存技術(shù)體系進(jìn)行了研究與探討；Sharma等[10]將大苞鞘石斛擬原球莖制作為人工種子且可在MS培養(yǎng)基上全部萌發(fā)；陳娜[11]、卓孝康等[12]，初步探討了大苞鞘石斛快繁體系的構(gòu)建，為實(shí)現(xiàn)大苞鞘石斛種質(zhì)資源的保護(hù)及再生奠定了基礎(chǔ)。

目前，對(duì)大苞鞘石斛無菌播種技術(shù)研究較為成熟，但通過外植體誘導(dǎo)擬原球莖的途徑建立快繁體系的研究甚少。通過大苞鞘石斛離體器官誘導(dǎo)擬原球莖，再利用擬原球莖的增殖分化培養(yǎng)獲得大量幼苗，這種快繁方法可建立高效的快繁體系，對(duì)推進(jìn)大苞鞘石斛工廠化育苗、遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究具有重要意義?；诖?，本試驗(yàn)以大苞鞘石斛無菌苗莖段為外植體，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究不同因素對(duì)大苞鞘石斛擬原球莖誘導(dǎo)、增殖與分化、生根誘導(dǎo)、生根壯苗等培養(yǎng)階段的影響，以期篩選出適宜的快繁方案，為大苞鞘石斛種質(zhì)資源的保育和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用原植物采自中國(guó)云南騰沖地區(qū)，經(jīng)上海辰山植物園黃衛(wèi)昌高級(jí)工程師鑒定為蘭科石斛屬大苞鞘石斛的新鮮植株，用無菌苗是利用以上植株所結(jié)蒴果無菌播種，選取長(zhǎng)勢(shì)健壯，莖長(zhǎng)2 cm以上。

1.2 方法

1.2.1 擬原球莖誘導(dǎo) 誘導(dǎo)階段Ⅰ：去除無菌苗葉片和根部，將莖段切為數(shù)段，每段保留1～2個(gè)具芽點(diǎn)的節(jié)，接入待檢培養(yǎng)基；誘導(dǎo)階段Ⅱ：當(dāng)芽點(diǎn)生長(zhǎng)出擬原球莖后，將其剝離并置于該培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)。設(shè)置L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究不同培養(yǎng)基、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）濃度和擬原球莖剝離直徑對(duì)擬原球莖誘導(dǎo)的影響，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類[MS、N6、1/2MS（MS培養(yǎng)基大量元素減半）]、2，4-D（0、0.2、1.0 mg/L）和誘導(dǎo)階段Ⅰ擬原球莖剝離直徑（1.0、1.5、2.0 mm）。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)結(jié)果。

誘導(dǎo)率/%=（誘導(dǎo)出擬原球莖的外植體數(shù)量/外植體總數(shù)量）×100

增殖系數(shù)=培養(yǎng)后擬原球莖總數(shù)量/接種擬原球莖數(shù)

1.2.2 擬原球莖增殖與分化 將誘導(dǎo)階段所得擬原球莖稱重，并利用接種勺接入增殖（分化）培養(yǎng)基。設(shè)置L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類（MS、1/2MS、N6）、NAA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和苯基噻二唑基脲（TDZ）（0、0.02、0.1 mg/L）。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)擬原球莖增殖與分化結(jié)果。

鮮重增殖倍數(shù)=培養(yǎng)后擬原球莖鮮重/接種擬原球莖鮮重

擬原球莖分化率/%=（分化的擬原球莖數(shù)量/擬原球莖總數(shù)）×100

1.2.3 無菌苗生根誘導(dǎo) 選取已分化且莖長(zhǎng)為15～20 mm的無菌苗（若有根需切除，將叢生芽拆分為單芽）接入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。設(shè)置L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類[花寶1號(hào)（花寶1號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L）]、花寶2號(hào)[（花寶2號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L）、CHB]、吲哚丁酸（IBA）（0.5、1.0、2.0 mg/L）和6-BA（0、0.1、0.5 mg/L）。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)結(jié)果。

生根率/%=（生根株數(shù)/總株數(shù)）×100

平均生根數(shù)（條）=生根根數(shù)/生根株數(shù)

1.2.4 無菌苗生根壯苗 選取已生根且莖長(zhǎng)大于25 mm的無菌苗（若根長(zhǎng)大于15 mm需將根切除，將叢生芽拆分為單芽）接入生根壯苗培養(yǎng)基。設(shè)置L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類[CHB（C）（CHB+活性炭1 g/L）、花寶1號(hào)（C）（花寶1號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L+活性炭1 g/L）、花寶2號(hào)（C）（花寶2號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L+活性炭1 g/L）]、IBA（0、0.5、1.0 mg/L）和蔗糖（10、30、50 g/L）。培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計(jì)生根情況。

平均生根數(shù)/條=生根根數(shù)/生根株數(shù)

平均根長(zhǎng)/mm=根長(zhǎng)總和/根總數(shù)量

1.2.5 培養(yǎng)條件 利用智能人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（23±1）℃，光照強(qiáng)度約2 000 Lux，光照時(shí)間16 h/d。以上待檢培養(yǎng)基每個(gè)處理分別接種8瓶，重復(fù)3次，pH5.6，附加蔗糖30 g/L（生根壯苗階段除外），椰乳10%（原球莖誘導(dǎo)、生根壯苗階段不添加），瓊脂7.6 g/L。

1.2.6 煉苗移栽 將生根壯苗培養(yǎng)瓶開蓋置于空調(diào)溫室[溫度（27±2）℃，光照強(qiáng)度約500 Lux，相對(duì)濕度60%～80%]中培養(yǎng)7 d，將苗取出洗凈，用1 000倍百菌清溶液浸泡20 min，水苔包裹其根部后種植于松皮1份、珍珠巖1份、蘭石0.5份的混合基質(zhì)中（基質(zhì)經(jīng)高壓蒸汽滅菌消毒），并在溫室中按常規(guī)水肥管理進(jìn)行苗期養(yǎng)護(hù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)擬原球莖誘導(dǎo)的影響

外植體在6 d啟動(dòng)，節(jié)間部位隆起，9 d擬原球莖可見并繼續(xù)膨大，20 d擬原球莖直徑1.5 mm左右時(shí)（圖1-A），需將其從莖段上剝離，并繼續(xù)在原培養(yǎng)基中誘導(dǎo)。剝離并轉(zhuǎn)接3 d擬原球莖啟動(dòng)，一周后增殖為8個(gè)（圖1-B），15～20 d接入增殖、分化培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。方差分析結(jié)果表明，2，4-D對(duì)擬原球莖誘導(dǎo)試驗(yàn)中誘導(dǎo)率的影響達(dá)到顯著水平，而各因素對(duì)增殖系數(shù)的影響未達(dá)到顯著水平（表1）。對(duì)擬原球莖誘導(dǎo)，比較各因素R值可知，對(duì)大苞鞘石斛擬原球莖增殖系數(shù)起主導(dǎo)作用的為擬原球莖的剝離直徑；影響擬原球莖誘導(dǎo)率的三因素主次程度為2，4-D>培養(yǎng)基>剝離直徑（表2）。根據(jù)各因素水平均值（ki）大小，可初步推斷影響擬原球莖誘導(dǎo)的最優(yōu)水平組合為1/2MS、2，4-D 0.2 mg/L、剝離直徑1.5 mm，此條件下，增殖系數(shù)為12.42，誘導(dǎo)率達(dá)91.67%。

2.2 不同因素對(duì)擬原球莖增殖與分化的影響

誘導(dǎo)出的擬原球莖團(tuán)繼代后15～25 d生長(zhǎng)最快，形成桑葚狀聚合體（圖1-C），培養(yǎng)30 d后，最早生成的擬原球莖開始分化為苗（圖1-D），而新增殖出的無芽點(diǎn)的擬原球莖則繼續(xù)增殖。由方差分析結(jié)果可知，NAA對(duì)鮮重增殖倍數(shù)、分化率和株高影響達(dá)到顯著差異水平（表1）。通過比較表3的R值可知，各因素中對(duì)大苞鞘石斛擬原球莖增殖與分化起主導(dǎo)作用為NAA。擬原球莖增殖最佳水平組合為1/2MS、NAA 1 mg/L和TDZ 0 mg/L，擬原球莖鮮重增殖倍數(shù)最大，達(dá)7.35；擬原球莖分化的最佳配方為1/2MS、NAA 0.5 mg/L和TDZ 0 mg/L，利用該水平組合在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示擬原球莖分化率為35.71%，分化苗株高為14.39 mm，具有2葉，色澤深綠，長(zhǎng)勢(shì)旺盛且整齊，適合作為生根誘導(dǎo)階段的外植體進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 不同因素對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

接入7 d，無菌苗根莖處可見不定根，25 d節(jié)間伸長(zhǎng)開始高生長(zhǎng)，部分幼苗生長(zhǎng)出分蘗，45 d可繼代（圖1-E、F）。方差結(jié)果顯示，各因素對(duì)生根誘導(dǎo)的影響具有一定差異性，培養(yǎng)基對(duì)平均根數(shù)的影響達(dá)到顯著水平，而6-BA對(duì)生根率的影響達(dá)到顯著水平（表1）。根據(jù)表4各因素R值大小可知，影響生根率強(qiáng)弱的因素表現(xiàn)為6-BA>培養(yǎng)基>IBA；對(duì)平均根數(shù)影響大小排序?yàn)榕囵B(yǎng)基>6-BA>IBA。生根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)配方為花寶2號(hào)、IBA 1 mg/L和6-BA 0 mg/L，生根率達(dá)100%，平均根數(shù)為4.75條。

2.4 不同因素對(duì)生根壯苗的影響

觀察顯示，接入5～25 d無菌苗根系生長(zhǎng)明顯，20～40 d高生長(zhǎng)旺盛節(jié)間伸長(zhǎng)快，少部分植株老化死亡，并由新生萌蘗接替生長(zhǎng)，35～50 d莖稈明顯增粗（圖1-G）。由方差分析結(jié)果可知，培養(yǎng)基對(duì)莖高影響達(dá)到極顯著性水平，對(duì)莖粗影響達(dá)到顯著水平（表1）。由表5各因素R值大小可知，培養(yǎng)基對(duì)于莖高、莖粗、平均根長(zhǎng)的影響起主導(dǎo)作用，而影響平均根數(shù)各因素的主次程度為蔗糖>培養(yǎng)基>IBA。大苞鞘石斛生根壯苗階段的最佳培養(yǎng)配方組合為花寶1號(hào)（C）、IBA 0 mg/L和蔗糖30 g/L。該條件下，無菌苗莖高達(dá)42.49 mm，莖粗3.26 mm，平均根數(shù)4.32條，平均根長(zhǎng)41.43 mm。

2.5 移栽馴化培養(yǎng)

煉苗移栽培養(yǎng)30 d后，莖基部老葉易黃化脫落，69%植株已生出1片新葉，新生葉質(zhì)地硬且厚（圖1-H），根生長(zhǎng)明顯，新生根3.1條/株，且新生根易吸附于樹皮上生長(zhǎng)，成活率為92%。

3 討論

大苞鞘石斛可利用多種組織器官誘導(dǎo)擬原球莖，如Sharma等[13]、陳娜[11]成功利用大苞鞘石斛莖尖、無菌萌發(fā)的種胚、幼苗根頸等誘導(dǎo)出了擬原球莖及可轉(zhuǎn)化為擬原球莖的愈傷組織；而本試驗(yàn)成功利用大苞鞘石斛莖節(jié)上尚未分化的腋芽來誘導(dǎo)擬原球莖。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在莖段上誘導(dǎo)出的擬原球莖需在直徑1.5 mm時(shí)剝離母體，若直徑過大或不剝離會(huì)直接分化成苗，過小則會(huì)增加死亡率；剝離母體后，誘導(dǎo)時(shí)間需控制在15～20 d，過長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致擬原球莖團(tuán)變異或死亡。李守嶺等[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用齒瓣石斛莖段誘導(dǎo)擬原球莖無需剝離即可在莖節(jié)處增殖，可能是由于培養(yǎng)條件（如激素種類）或外植體基因型導(dǎo)致。

擬原球莖增殖分化階段為石斛屬植物擴(kuò)繁的關(guān)鍵時(shí)期，研究表明，外源激素、碳源類型和濃度[15-16]、多胺類物質(zhì)[17-18]、光照條件[19]、超聲處理[20]和低溫處理[15]都對(duì)石斛擬原球莖增殖分化有促進(jìn)作用。其中，激素處理是最常使用的方法，研究者常添加細(xì)胞分裂素并配合一定量的生長(zhǎng)素提高增殖分化效果，王一諾等[21]認(rèn)為重唇石斛增殖效果最佳激素組合為6-BA 2.0 mg/L+6-糠氨基嘌呤（KT）0.2 mg/L+NAA 0.4 mg/L，徐玲等[22]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛擬原球莖分化添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L效果最好。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大苞鞘石斛僅添加NAA 1 mg/L擬原球莖增殖效果最好，NAA 0.5 mg/L分化效果最好，該結(jié)果與尹明華等[23]研究結(jié)果相似，認(rèn)為NAA濃度低有利于鐵皮石斛擬原球莖分化，濃度提升有利于增殖。

IBA為石斛屬植物生根誘導(dǎo)中常用的外源激素，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大苞鞘石斛生根誘導(dǎo)最佳濃度為1 mg/L IBA；而生根壯苗階段則采用無激素培養(yǎng)，可能是由于大苞鞘石斛較易產(chǎn)生不定根，且誘導(dǎo)階段無菌苗體內(nèi)已有IBA積存。蔗糖在組培中的作用主要為提供碳源和調(diào)節(jié)滲透壓，根據(jù)培養(yǎng)目的和外植體的不同，蔗糖濃度也需要調(diào)整，李璐等[24]研究結(jié)果顯示，無激素的1/2MS培養(yǎng)基中添加白糖20 g/L有利于春石斛壯苗生根，添加白糖10 g/L適宜鐵皮石斛壯苗生根，而本試驗(yàn)中生根壯苗蔗糖最適濃度為30 g/L。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，（1）誘導(dǎo)階段：以大苞鞘石斛具有1～2個(gè)芽點(diǎn)的無菌苗莖段為外植體，接入擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+2，4-D 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，當(dāng)節(jié)間誘導(dǎo)出的擬原球莖直徑達(dá)1.5 mm時(shí)將其剝離，并接入原培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)15～20 d，誘導(dǎo)率達(dá)91.67%；（2）增殖階段：將誘導(dǎo)出的或繼代的擬原球莖團(tuán)拆散，接入增殖培養(yǎng)基1/2MS+NAA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，繼代周期25～30 d，擬原球莖鮮重增殖倍數(shù)達(dá)7.35； （3）分化階段：將擬原球莖團(tuán)接入分化培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，培養(yǎng)40 d，分化率達(dá)35.71%，未分化的擬原球莖團(tuán)可拆散后繼續(xù)作增殖培養(yǎng)；（4）生根壯苗階段：將分化的無菌苗接入花寶2號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L+IBA 1 mg/L+蔗糖 30 g/L+椰乳10%進(jìn)行生根誘導(dǎo)，培養(yǎng)45 d，生根率達(dá)100%；而后接入花寶1號(hào)3 g/L+蛋白胨2 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭1 g/L進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d即可煉苗出瓶或作為誘導(dǎo)階段的外植體；（5）將生根苗煉苗后種植于松皮1份、珍珠巖1份、蘭石0.5份的混合基質(zhì)中30 d，新生根3.1條/株，成活率為92%。本試驗(yàn)為大苞鞘石斛快繁體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供了參考依據(jù)。

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