馬玲 王志強(qiáng) 覃紹敏 吳健敏

摘要：熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（TAIL-PCR）是一種以PCR為基礎(chǔ)的染色體步移，主要用于分離已知基因的側(cè)翼序列，具有簡便、快速、高效、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。文章從TAIL-PCR的原理、優(yōu)勢(shì)及局限性、反應(yīng)體系優(yōu)化等方面對(duì)TAIL-PCR的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，其中在畜牧獸醫(yī)中主要用于已知基因側(cè)翼克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型外源基因插入位點(diǎn)確定。但由于基因組DNA的龐大和復(fù)雜性，使得從基因組中克隆獲得目的基因仍存在諸多限制因素，如特異性引物錯(cuò)配和隨機(jī)引物結(jié)合位點(diǎn)不確定，易造成非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；模板GC含量異?；虼嬖诟叨戎貜?fù)序列時(shí)，即使使用多種簡并引物也難以獲得陽性產(chǎn)物。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況對(duì)TAIL-PCR進(jìn)行靈活調(diào)整。當(dāng)模板較復(fù)雜時(shí)，可借鑒連接介導(dǎo)PCR原理，給引物加上接頭，提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性；當(dāng)模板較簡單或序列較清晰時(shí)，可根據(jù)模板特點(diǎn)（如高GC含量）或已知模板序列設(shè)計(jì)引物、調(diào)整反應(yīng)條件，增加操作的簡便性；還可參考Suppression-PCR原理，選擇引物和反應(yīng)條件，獲得較長的擴(kuò)增片段。此外，TAIL-PCR可與多種技術(shù)聯(lián)合使用，促使其在畜牧獸醫(yī)中獲得更廣泛深入的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： TAIL-PCR；染色體步移；研究進(jìn)展；應(yīng)用

中圖分類號(hào)： Q813 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）05-0926-07

Advances in TAIL-PCR and its application in animal

husbandry and veterinary

MA Ling 1， WANG Zhi-qiang 2，3， QIN Shao-min1， WU Jian-min1 *

（1 Guangxi Veterinary Research Institute / Guangxi Key Laboratory of Animal Epidemic Etiology and Diagnostic， Nanning 530001， China； 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresearches， Nanning 530004， China； 3 College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530004， China）

Abstract：Simple， rapid， high efficient and specific， thermal asymmetric interlaced PCR（TAIL-PCR）， a kind of chromosome walking based on PCR， was mainly used to isolate the flanking sequences of target DNA segments. The principle， advantage， disadvantage and reaction system optimization of TAIL-PCR as well as some critical problem were summarized. In animal husbandry and veterinary medicine， TAIL-PCR was mainly used to isolate exogenous gene insertion sites and clone flanking sequences of the known genes in transgenic animals. Being limited by the complexity of genome DNA， there were so many limited factors preventing cloning target genes from genome， such as amplification of nonspecific products caused by mismatch of specific primers and arbitrary primers， and the difficulties in obtaining positive products even using multiple degenerate primers caused by abnormal template GC content and highly repeated sequences. So the adjustments should be made depend on actual situation. When the templates were complex， adapter could be added to the primers to improve the specificity based on the principle of LM-PCR； while when the template were simple or the sequence were clear， primers could be designed and reaction conditions could be set based on the characters of the templates（high GC content） or known template sequence， which made it easier to operate； and the suitable primers and reaction conditions could be chosen to get longer amplification products based on the principle of Suppression-PCR. Moreover， TAIL-PCR could be used with other technologies to facilitate its application in animal husbandry and veterinary.

Key words： TAIL-PCR； chromosome walking； research progress； application

0 引言

獲得較完整基因序列是研究基因結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控的必要條件，確定外源基因的插入位點(diǎn)是建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物模型和插入突變體后的首要步驟，掌握反轉(zhuǎn)錄病毒科病毒在宿主基因組中的整合位點(diǎn)是研究病毒致病機(jī)理的根本前提，而開展這些研究均需要從已知基因序列出發(fā)，通過染色體步移逐步獲得其上、下游未知序列或與其有線性關(guān)系的目標(biāo)序列。近年來，PCR和生物信息學(xué)的發(fā)展促使染色體步移變得越來越簡單、快捷，相繼出現(xiàn)了多種以PCR為基礎(chǔ)的染色體步移技術(shù)，包括反向PCR、連接介導(dǎo)PCR、抑制PCR、鍋柄PCR、高通量染色體步移等（李付鵬等，2010；雷明等，2016；彭雷等，2016），但這些方法大多存在操作繁瑣、試驗(yàn)周期較長的缺陷，而且有的依賴于酶切和連接，受酶切位點(diǎn)、連接效率影響較明顯，有的則因基因組DNA結(jié)構(gòu)限制了反應(yīng)效率。熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-

PCR）具有簡便、快速、高效、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多個(gè)學(xué)科研究領(lǐng)域（Liu and Whittier，1995；鄭岑等，2009；陳笑蕓等，2013），成功獲得多種動(dòng)植物和微生物基因啟動(dòng)子序列、基因全長，并用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物外源基因插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的克隆。為此，本文基于TAIL-PCR的原理和特點(diǎn)，總結(jié)近年來該方法的研究進(jìn)展，以期為TAIL-PCR的推廣應(yīng)用提供參考。

1 TAIL-PCR原理

1. 1 基本原理

TAIL-PCR原理是根據(jù)已知序列和物種保守氨基酸設(shè)計(jì)3個(gè)高DNA熔解溫度（Melting temperature，Tm）的嵌套式特異性引物（Specific primer，SP1/2/3）和多個(gè)低Tm的隨機(jī)簡并引物（Arbitrary primer，AD），然后以基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)3輪半巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)（李付鵬等，2010）。由于引物對(duì)的Tm存在明顯差別，TAIL-PCR通常被設(shè)計(jì)成熱不對(duì)稱的多級(jí)反應(yīng)（Liu and Whittier，1995）。其中，第1輪擴(kuò)增包括5個(gè)使SP與已知序列基因退火并延伸的高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)、1個(gè)使AD與未知序列模板退火并延伸的低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)及促使2種引物退火并延伸的10個(gè)較低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)和12個(gè)熱不對(duì)稱交錯(cuò)循環(huán)（圖1）；第2和3輪擴(kuò)增則分別包括10個(gè)熱不對(duì)稱交錯(cuò)循環(huán)和20個(gè)較低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)。

第1輪擴(kuò)增以SP1和AD為引物，可獲得三類產(chǎn)物：SP1和AD（I類）、SP1（II類）、AD（III類）擴(kuò)增產(chǎn)物。第2輪擴(kuò)增以SP2和AD為引物，以1000倍稀釋的第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，起始的高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)更有利于I類產(chǎn)物的大量擴(kuò)增；在隨后的循環(huán)中，由于缺少SP2結(jié)合位點(diǎn)和模板量較少，II類、III類產(chǎn)物也相對(duì)較少。第3輪擴(kuò)增以SP3和AD為引物，20個(gè)較低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)雖然有利于2種引物退火，但不足以使模板量較少的II類、III類產(chǎn)物擴(kuò)增到可見程度，從而進(jìn)一步特異性擴(kuò)增I類產(chǎn)物。通過上述反應(yīng)，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物占有絕對(duì)比例，可通過膠回收或直接測(cè)序獲得目的基因的序列而獲得已知基因的側(cè)翼序列。

1. 2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)TAIL-PCR的原理可發(fā)現(xiàn)，引物錯(cuò)配可直接導(dǎo)致非特異性（II類、III類）產(chǎn)物的擴(kuò)增。因此，引物設(shè)計(jì)是TAIL-PCR的關(guān)鍵，要求即使在低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)中也不能產(chǎn)生引物二聚體。

除Tm較高（58～68 ℃）外，3個(gè)SP間應(yīng)相距100 bp以上，以便于通過電泳區(qū)分各級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)而初步判斷反應(yīng)特異性。SP錯(cuò)配可導(dǎo)致II類產(chǎn)物擴(kuò)增（鄭岑等，2009），尤其當(dāng)SP的3'端GC含量較高時(shí)，因此設(shè)計(jì)SP時(shí)需注意3'端GC含量。通過TAIL-PCR的反應(yīng)流程（圖1）可知，第1輪擴(kuò)增對(duì)整個(gè)流程影響較大，是控制特異性擴(kuò)增的關(guān)鍵，如TAIL-PCR最終未能獲得滿意結(jié)果，可重新設(shè)計(jì)SP1用于試驗(yàn)。

AD的Tm需比SP低10 ℃以上，且使用5個(gè)簡并堿基（簡并度128～256），同時(shí)設(shè)4種3'序列：AGA/AGG/

GAA/GGA，以增加AD在已知基因側(cè)翼序列中的結(jié)合位點(diǎn)，便于目的基因的擴(kuò)增。一般情況下，TAIL-PCR的成功率為60.0%～80.0%，擴(kuò)增片段0.3～1.0 kb，甚至2.0 kb，若僅獲得250 bp以下的擴(kuò)增產(chǎn)物，則需更換AD。此外，不同AD在不同物種中的應(yīng)用效果也有差異，可同時(shí)采用多個(gè)AD進(jìn)行擴(kuò)增篩選（陳笑蕓等，2013）。

1. 3 反應(yīng)條件

在TAIL-PCR中，高、較低和低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)的退火溫度分別設(shè)為63、44和30 ℃。其中，高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)中的退火溫度可比SP的Tm高1～5 ℃，以提高反應(yīng)特異性。為減少錯(cuò)配，可使用較低濃度的SP（0.15～0.20 μmol/L），但AD使用濃度宜高（3.00～5.00 μmol/L），以滿足結(jié)合效率；使用含有次黃嘌呤的AD時(shí)，用量減半。此外，如需直接測(cè)序TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、3輪擴(kuò)增中添加25 μmol/L dNTP可滿足擴(kuò)增要求。在TAIL-PCR中，低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)和簡并引物的使用可提高引物正確結(jié)合的概率。

2 TAIL-PCR優(yōu)勢(shì)及局限性

與反向PCR、連接介導(dǎo)PCR等相比，TAIL-PCR無需進(jìn)行酶切、連接、加尾等模板前期處理，也不需要Southern blotting、引物標(biāo)記等后期處理，操作簡便，同時(shí)避免了酶切、連接對(duì)反應(yīng)效率的影響和連接過程可能出現(xiàn)的嵌合體；對(duì)模板的含量和純度也沒有更高要求，操作過程基本與PCR類似，可實(shí)現(xiàn)大量樣品的自動(dòng)化加樣、擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較強(qiáng)，可直接用于雜交探針和序列測(cè)定（鄭岑等，2009；Chen et al.，2016）。在適用性方面，TAIL-PCR可用于包括哺乳動(dòng)物基因組在內(nèi)各種復(fù)雜、簡單樣品的檢測(cè)，整個(gè)反應(yīng)流程可在24 h內(nèi)完成，極大節(jié)省了時(shí)間，成功率在60.0%～

80.0%。

TAIL-PCR由三級(jí)連續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)組成，第1輪擴(kuò)增的產(chǎn)物對(duì)后續(xù)反應(yīng)有較大影響，因此試驗(yàn)前須優(yōu)化各反應(yīng)條件，且TAIL-PCR的引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件相對(duì)復(fù)雜，給其推廣應(yīng)用帶來了困難。如同一簡并引物在不同物種中的擴(kuò)增效果明顯不同，需同時(shí)采用多個(gè)通用引物平行擴(kuò)增以獲得理想的結(jié)果；而第1輪擴(kuò)增中II、III類產(chǎn)物可能會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或僅獲得小片段的擴(kuò)增產(chǎn)物（Liu and Chen，2007；陳笑蕓等，2013）。分子生物學(xué)的發(fā)展對(duì)染色體步移技術(shù)提出了更高要求，包括希望獲得更長的側(cè)翼基因序列、進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間、從含量較低或較高GC含量樣品中擴(kuò)增出目的基因等，因此需要圍繞TAIL-PCR開展多方面的優(yōu)化設(shè)計(jì)，通過與生物信息學(xué)等方法聯(lián)用，提高反應(yīng)成功率，擴(kuò)大推廣應(yīng)用面。

3 TAIL-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

3. 1 引物篩選優(yōu)化

為提高反應(yīng)效率、獲得更長的基因片段，Liu和Chen（2007）改進(jìn)優(yōu)化TAIL-PCR反應(yīng)體系，以LAD代替AD，并根據(jù)LAD的5'端序列合成引物AC1，同時(shí)參照Suppression-PCR原理抑制500 bp以下片段的擴(kuò)增，最終建立了高效TAIL-PCR（High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR，hiTAIL-PCR）。hiTAIL-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0～3.0 kb為主，遠(yuǎn)大于TAIL-PCR的0.3～1.0 kb。Liu和Chen（2007）研究證實(shí)，hiTAIL-PCR的成功率可達(dá)93.3%，且大多數(shù)目的基因通過兩輪PCR即可獲得，有效節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。此外，在第1輪擴(kuò)增中如將兩種LAD混合使用，可使成功率提高到97.4%。

與hiTAIL-PCR相似，Wang等（2011b）在TAIL-PCR基礎(chǔ)上，于AD的5'端添加31 bp基因片段（Fusion primer），以此作為第1輪PCR擴(kuò)增的引物，相當(dāng)于給擴(kuò)增產(chǎn)物連上“接頭”，在第2、3輪擴(kuò)增中分別根據(jù)“接頭”序列設(shè)計(jì)FSP1、FSP2引物與特異性引物配對(duì)擴(kuò)增，增強(qiáng)反應(yīng)特異性，成功率超過85.0%。此外，該方法在反應(yīng)條件上也進(jìn)行優(yōu)化，僅在第1輪擴(kuò)增中使用超級(jí)循環(huán)，使整個(gè)反應(yīng)可在4 h內(nèi)完成，極大節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間，并獲得2.0 kb以上的片段。優(yōu)化后的TAIL-PCR通用性良好，可從7種薔薇科植物中擴(kuò)增獲得21個(gè)目的基因片段、從玫瑰中擴(kuò)增獲得4個(gè)MYB基因片段、從矮牽牛的MADS-Box轉(zhuǎn)錄因子家族中擴(kuò)增獲得3個(gè)啟動(dòng)子序列，以及日本落葉松TCTP基因的5'側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)序列（Zhang et al.，2013）和沙雷氏菌ChrT基因5'和3'側(cè)翼序列（Deng et al.，2015）。

TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常需要克隆才能獲得目的基因序列，為控制克隆時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物插入載體的方向，Tan等（2005）建立了SiteFinding-PCR，即設(shè)計(jì)2種SiteFinder引物（5'端為含Not I酶切位點(diǎn)和6個(gè)N的基因片段，3'端分別為GCCT/GCGC），并根據(jù)SiteFinder 5'端設(shè)計(jì)部分序列重復(fù)的巢式引物SFP1和SFP2。在其反應(yīng)程序中，首先采用SiteFinder進(jìn)行1個(gè)反應(yīng)的單引物擴(kuò)增，然后在體系中加入特異性引物和SFP1，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的二溫式PCR擴(kuò)增，兩輪擴(kuò)增結(jié)束后以Not I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，連接至經(jīng)Not I和EcoR V雙酶切的pBlueScript SK（+）載體上，最后以M13R和特異性引物配對(duì)，PCR篩選目標(biāo)產(chǎn)物。采用優(yōu)化后的TAIL-PCR，Tan等（2005）在噬藍(lán)藻體中擴(kuò)增獲得4617 bp的目的片段、從15種擬南芥的變異體中擴(kuò)增獲得14個(gè)T-DNA插入位點(diǎn)（未優(yōu)化的TAIL-PCR僅擴(kuò)增獲得9個(gè)）。該方法首先根據(jù)Suppression-PCR原理，使非目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)而抑制其擴(kuò)增；其次是進(jìn)一步簡化PCR反應(yīng)條件，縮短反應(yīng)時(shí)間，并通過酶切位點(diǎn)控制基因片段插入載體的方向，以便于PCR鑒定，是一種簡便、快捷擴(kuò)增大片段側(cè)翼序列的方法。

但SiterFinder中6個(gè)N的使用增加了自我配對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)，為此，Luo等（2011）設(shè)計(jì)了11條CLP簡并引物，僅使用4個(gè)N，并將3'端的堿基增加到7個(gè)。這7個(gè)堿基中，有的含有6 bp的酶切位點(diǎn)，有的是2個(gè)3 bp的重復(fù)序列，有的則是4 bp的酶切位點(diǎn)及1個(gè)嘌呤堿和1個(gè)嘧啶堿。此外，在第1輪擴(kuò)增中只添加特異性引物進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的普通反應(yīng)，快速冷卻后加入CLP，進(jìn)行1個(gè)變性溫度80 ℃、退火溫度43 ℃的循環(huán)，此舉可增加CLP結(jié)合到新合成單鏈DNA上的機(jī)會(huì)；在第2輪擴(kuò)增中，以特異性引物和根據(jù)CLP 5'端序列合成的引物RL進(jìn)行二溫式PCR擴(kuò)增。采用優(yōu)化后的TAIL-PCR，分別擴(kuò)增獲得創(chuàng)傷弧菌rpoB基因的3044和4055 bp片段、溶藻弧菌轉(zhuǎn)座酶基因的3820 bp片段、霍亂弧菌sto基因的1632 bp片段。該方法較TAIL-PCR和SiteFinding-PCR更簡便快速，且特異性強(qiáng)，但由于沒有任何一條CLP可同時(shí)擴(kuò)增出上述基因片段，即要求在擴(kuò)增不同樣品基因時(shí)需分別設(shè)計(jì)引物。此外，Wu等（2015）設(shè)計(jì)22條簡并引物從T-DNA插入突變體庫中擴(kuò)增T-DNA插入位點(diǎn)，結(jié)果證實(shí)使用較多的AD可將TAIL-PCR成功率從39.0%提升至69.0%，對(duì)于仍難以擴(kuò)增的樣品，可結(jié)合高通量測(cè)序獲得其插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。

可見，TAIL-PCR引物的篩選優(yōu)化主要是通過設(shè)計(jì)較長或較多的簡并引物，但簡并引物的設(shè)計(jì)需要參考生物密碼子的偏好性。Terauchi和Kahl（2000）、Qiu等（2008）使用商品化的RAPD為簡并引物，通過調(diào)整反應(yīng)條件，成功分離獲得山藥Pal和Pgi的5'區(qū)域及小麥X基因5'端未知1077 bp的側(cè)翼序列。TAIL-PCR中AD的3'端是3～4個(gè)確定序列的堿基，是決定擴(kuò)增能否進(jìn)行的關(guān)鍵。在已知基因序列中尋找與AD 3'端3～4個(gè)堿基完全相同的基因序列不難，李道恒等（2013）利用該原則，以已知基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)可同時(shí)作為特異引物和簡并引物的引物，并通過單引物擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因水稻的2個(gè)插入位點(diǎn)，同時(shí)將反應(yīng)條件修改為5個(gè)低特異性反應(yīng)及30個(gè)較高特異性反應(yīng)，極大簡化了引物設(shè)計(jì)、節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。 此外，在簡并引物設(shè)計(jì)方面，Hecht等（2010）、Teixeira等（2011）、Guimaro等（2014）依據(jù)克氏錐蟲感染人體后基因組主要插入人類染色體還原轉(zhuǎn)座酶LINE-1的特點(diǎn)，分別針對(duì)插入基因和被插入基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物取代AD，有效減少了簡并堿基的使用，且將第3輪擴(kuò)增簡化為普通PCR。

3. 2 反應(yīng)條件優(yōu)化

雖然經(jīng)典TAIL-PCR可滿足許多樣品的擴(kuò)增要求，但特定條件下，優(yōu)化反應(yīng)條件可獲得更理想的效果。在Liu和Whittier（1995）建立的TAIL-PCR中，低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)的退火溫度為30 ℃，保持3 min后緩慢升至72 ℃，但在實(shí)際應(yīng)用中較多選用25 ℃為退火溫度（王寶維等，2010；Wada et al.，2014），也有研究將其調(diào)整為28 ℃（孫科軍等，2012），或選擇快速升溫至72 ℃（孔慶然等，2009；Huang et al.，2010）。潘華奇等（2009）在克隆鴨腸炎病毒時(shí)，為充分變性而將變性溫度升高至98 ℃。He等（2010）在擴(kuò)增豬APC10基因時(shí)，去除第1輪擴(kuò)增中的10個(gè)低特異性循環(huán)?？梢?，各種反應(yīng)條件的優(yōu)化均與物種基因組的復(fù)雜性、引物的簡并和特異性等有關(guān)。

TAIL-PCR的AD中GC含量低于50%，且Tm較低，對(duì)擴(kuò)增高GC含量的樣品非常不利。為此，Zhou等（2010）建立了GC TAIL-PCR，即根據(jù)放線菌屬GC含量在51%～70%及其木聚糖酶CDS中密碼子第3位通常是G/C的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)12條GC含量在50%～85%的GCAD及6條特異性引物；其擴(kuò)增程序則根據(jù)GCAD Tm較高的特點(diǎn)，分別將高、低和較低特異性反應(yīng)中退火溫度升高至70、30和50 ℃，并使用GC Buffer，擴(kuò)增出常規(guī)AD無法擴(kuò)增的木聚糖酶1089 bp的基因片段和4個(gè)高GC含量的基因片段。這為擴(kuò)增高GC含量的基因片段提供了技術(shù)支撐。

為提高反應(yīng)特異性，Lin等（2014）通過分析已知基因和基因組的序列特征，選用EcoR I和Hind III酶切基因組為模板，優(yōu)化后的TAIL-PCR能從轉(zhuǎn)基因山羊中擴(kuò)增獲得4個(gè)IGF-1的插入位點(diǎn)，與經(jīng)典TAIL-PCR相比，其成功率明顯提高。在從大量、復(fù)雜的環(huán)境樣品中擴(kuò)增含量極低的基因時(shí)，Huang等（2010）將第1輪擴(kuò)增拆分為兩步：先用特異性引物進(jìn)行80個(gè)循環(huán)的單引物擴(kuò)增，增加目的基因的拷貝數(shù)，然后加入簡并引物完成后續(xù)擴(kuò)增，通過此法成功從波爾山羊和荷斯坦奶牛的瘤胃液及紙漿廠的廢水中擴(kuò)增獲得GH10、GH11和PTP-like植酸酶基因。

3. 3 與其他方法聯(lián)合使用

TAIL-PCR可通過已知基因擴(kuò)增其未知的側(cè)翼序列，因此已知基因序列獲得是TAIL-PCR的基礎(chǔ)。Wang等（2011a）在擴(kuò)增冬蟲夏草的微衛(wèi)星標(biāo)記時(shí)，先應(yīng)用ISSR-PCR擴(kuò)增獲得基因序列，再據(jù)此設(shè)計(jì)引物，通過TAIL-PCR獲得完整基因序列，從48份樣品中擴(kuò)增出30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，可用于冬蟲夏草群體遺傳學(xué)和保護(hù)生物學(xué)研究。Bushley等（2013）先通過簡并PCR擴(kuò)增冬蟲夏草DNA裂解酶基因、MAT1-1-1的α-box和MAT1-1-3的HMG-box，然后通過TAIL-PCR和Long-rang PCR擴(kuò)增獲得各基因間的未知區(qū)域序列，并將基因片段連接起來，最終獲得冬蟲夏草MAT1-1的基因座。Wada等（2014）通過Exon Array在急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系T-ALL中查找到3個(gè)融合基因，然后結(jié)合EST數(shù)據(jù)庫在24個(gè)乳腺癌細(xì)胞系和20個(gè)胰腺癌細(xì)胞系中搜索到7個(gè)可能的融合基因，最終通過TAIL-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了其中3個(gè)融合基因。

在擴(kuò)增雙拷貝基因及其側(cè)翼序列時(shí)，Zhang等（2012）先用Southern blotting選擇EcoR I酶切基因組，然后以反向PCR將雙拷貝的側(cè)翼序列區(qū)分開，根據(jù)反向PCR結(jié)果，采用TAIL-PCR擴(kuò)增未知的側(cè)翼序列，成功獲得棉花可育胞質(zhì)和不可育胞質(zhì)線粒體雙拷貝atpA基因的所有EcoR I（2.2～5.1 kb）和Hind III（8.5～

11.7 kb）限制片段。在進(jìn)行較長片段的染色體步移時(shí)，Chen等（2016）、Zha等（2016）采用3'-RACE獲得目的基因的部分序列，結(jié)合EST或GenBank數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)SP，分別通過多次TAIL-PCR、hiTAIL-PCR向5端方向進(jìn)行染色體步移，直至獲得武昌魚PHD1、PHD3的5'端啟動(dòng)子和露珠杜鵑花蜜中幾丁質(zhì)酶Rhchi2和Rhchi3的cDNA全長序列。

綜上所述，生物信息學(xué)和分子生物技術(shù)的發(fā)展使得PCR擴(kuò)增未知基因變得越來越高效、簡便。根據(jù)基因保守區(qū)采用簡并PCR、基因數(shù)據(jù)庫查找及其他方法可快速獲得基因片段，用作TAIL-PCR的基礎(chǔ)。

4 TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景

4. 1 TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中主要用于已知基因側(cè)翼克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型外源基因插入位點(diǎn)確定。潘華奇等（2009）采用包括TAIL-PCR在內(nèi)的多種PCR克隆鴨腸炎病毒gB基因；劉峰源等（2009）根據(jù)GenBank中鴨腸炎病毒UL45基因設(shè)計(jì)特異性引物，以TAIL-PCR擴(kuò)增獲得gC基因全長和UL43基因部分序列，并進(jìn)一步證實(shí)鴨腸炎病毒的系統(tǒng)發(fā)育分類。在病原基因分離方面，馬春驥等（2011）利用同源克隆和TAIL-PCR擴(kuò)增獲得綿羊肺炎支原體Y98株熱休克蛋白Hsp70長2481 bp的基因序列，其中包含1815 bp的開放閱讀框，為綿羊肺炎支原體的抗原、Hsp70功能研究打下了基礎(chǔ)。在微生物基因克隆方面，王寶維等（2010）采用TAIL-PCR擴(kuò)增獲得鵝源草酸青霉F64 CBHI基因序列全長，且從草酸青霉中克隆出一種新的膨脹素樣蛋白POSWOI全長基因（Kang et al.，2013），為纖維素類生物質(zhì)的高效生物轉(zhuǎn)化開辟了新途徑。

動(dòng)物體內(nèi)的某些基因通常與疾病發(fā)生和機(jī)體生長發(fā)育有密切關(guān)系，尤其是基因的啟動(dòng)子區(qū)域。如甘露聚糖結(jié)合凝集素基因是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)參與構(gòu)成抗感染第一道防線。余鵬等（2011）利用TAIL-PCR擴(kuò)增獲得綿羊甘露聚糖結(jié)合凝集素基因啟動(dòng)子區(qū)，為研究該基因的表達(dá)調(diào)控和啟動(dòng)子區(qū)甲基化提供了支持；孫科軍等（2012）通過TAIL-PCR和PCR克隆獲得的斑鱖肌肉生長抑制素基因及其啟動(dòng)子序列，為研究斑鱖肌肉生長和發(fā)育調(diào)控打下了基礎(chǔ)；Zhou等（2014）克隆獲得S100A6啟動(dòng)子區(qū)的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，并證實(shí)豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染細(xì)胞后可通過多種途徑激活NF-κB通路。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，外源基因定位和拷貝數(shù)的確定與基因表達(dá)、基因穩(wěn)定性、生產(chǎn)性能和安全評(píng)價(jià)等存在直接關(guān)系，也是建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型后的首要檢測(cè)步驟之一?？讘c然等（2009）、Lin等（2014）采用qPCR和TAIL-PCR代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Southern blotting分別鑒定外源基因在IGF-1轉(zhuǎn)基因羊和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬中的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)，成功建立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定體系。Wang等（2012）利用TAIL-PCR檢測(cè)肝臟特異性表達(dá)分泌型IgD轉(zhuǎn)基因小鼠中目的基因插入位點(diǎn)，但發(fā)現(xiàn)外源基因的插入并未破壞位于小鼠5號(hào)染色體上的甲羥戊酸激酶（MVK）基因，即高IgD綜合征發(fā)病機(jī)理尚有待進(jìn)一步探究。除轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因定位外，也有通過TAIL-PCR確定外源基因在宿主基因組中插入位點(diǎn)的研究。Bi等（2013）和王毅（2013）分別制備鏈霉菌屬噬菌體PhiC31整合酶表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染豬腎PK15細(xì)胞和山羊胎兒成纖維細(xì)胞，然后通過TAIL-PCR篩選定向整合到宿主基因的Pseudo attP位點(diǎn)；Huang等（2014）為鑒定構(gòu)建的通用型細(xì)胞永生化載體元件功能，將細(xì)胞永生化載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，并通過TAIL-PCR確定該載體是以轉(zhuǎn)座整合的方式插入宿主基因組中。

4. 2 TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的發(fā)展前景

近年來，畜牧獸醫(yī)業(yè)快速發(fā)展，動(dòng)物品種改良、動(dòng)物微生物學(xué)和病原學(xué)、食品安全檢測(cè)及利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)珍貴蛋白、進(jìn)行基因治療和建立疾病模型等均涉及染色體步移。相對(duì)于其他以PCR為基礎(chǔ)的染色體步移技術(shù)，TAIL-PCR對(duì)DNA的質(zhì)量和用量要求相對(duì)較低，同時(shí)克服了連接、酶切等的限制，且隨著方法的不斷改進(jìn)，其操作更簡便、步移長度更長、成功率更高，因此TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用將進(jìn)一步擴(kuò)大。但由于基因組DNA的龐大和復(fù)雜性，使得從基因組中克隆目的基因仍存在諸多限制因素，如特異性引物錯(cuò)配和隨機(jī)引物結(jié)合位點(diǎn)不確定，易造成非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；模板GC含量異常或存在高度重復(fù)序列時(shí)，即使使用多種簡并引物也難以獲得陽性產(chǎn)物；此外，復(fù)雜的反應(yīng)條件給TAIL-PCR優(yōu)化也帶來一定困難。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況對(duì)TAIL-PCR進(jìn)行靈活調(diào)整。當(dāng)模板較復(fù)雜時(shí)，可借鑒連接介導(dǎo)PCR原理，給引物加上接頭，提高反應(yīng)的特異性；當(dāng)模板較簡單或序列較清晰時(shí)，可根據(jù)模板特點(diǎn)（如高GC含量）或已知模板序列設(shè)計(jì)引物、調(diào)整反應(yīng)條件，增加操作的簡便性；還可參考Suppression-PCR原理，選擇引物和反應(yīng)條件，獲得較長的擴(kuò)增片段。此外，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展及分子生物學(xué)技術(shù)的改進(jìn)和新技術(shù)的出現(xiàn)，TAIL-PCR可與多種技術(shù)聯(lián)合使用，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，更快速、高效地完成檢測(cè)目標(biāo)，進(jìn)而促使TAIL-PCR在畜牧獸醫(yī)中獲得更廣泛深入的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）