唐文武　吳秀蘭　李桂花

摘要：【目的】利用生物信息學分析蕓薹屬作物MS1基因的結構功能，為作物雜種優(yōu)勢利用提供理論參考?！痉椒ā恳詳M南芥花粉發(fā)育關鍵基因AtMS1為參考序列，通過BLAST比對獲得同源基因序列，運用生物信息學方法對其編碼氨基酸序列進行預測分析?！窘Y果】從甘藍型油菜、白菜、甘藍等蕓薹屬作物基因組中獲得4條同源序列，與AtMS1基因的相似性在88.0%以上，均含有3個外顯子，其CDS序列長度均為2004 bp，編碼667個氨基酸。4個蕓薹屬作物MS1蛋白均含有1個植物同源結構域（Plant homeodomain，PHD），屬于親水性不穩(wěn)定蛋白，定位于細胞核，磷酸化以絲氨酸（Ser）為主，以蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）為輔；二級結構均由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋所占比例最高，在40.00%以上，β-轉角所占比例最低，僅為10.00%左右；其三級結構大致相同，均為球狀的功能結構域。4個蕓薹屬作物MS1蛋白和AtMS1蛋白序列的相似性為95.69%。4個蕓薹屬作物MS1蛋白的PHD結構域序列高度保守，僅有3個位點氨基酸殘基存在差異。19個不同植物的MS1同源蛋白聚為兩大類，其中琴葉擬南芥、亞麻薺、蘿卜的MS1蛋白與4個蕓薹屬作物MS1蛋白及擬南芥AtMS1蛋白聚為一類，均屬于十字花科植物，即MS1蛋白的聚類結果與植物系統(tǒng)分類結果相吻合?！窘Y論】蕓薹屬作物MS1基因屬于PHD-finger基因家族，其序列高度保守，參與調控花粉發(fā)育成熟過程。

關鍵詞：蕓薹屬；MS1基因；生物信息學；花粉發(fā)育；同源序列

中圖分類號：S634.03 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2122-07

0引言

【研究意義】雄性不育是植物有性繁殖過程中雄蕊發(fā)育異常引起無法授粉結實的現(xiàn)象，而花粉敗育是雄性不育的表型特征，因此揭示花粉發(fā)育分子調控機理是了解雄性不育的關鍵。十字花科蕓薹屬作物存在明顯的雜種優(yōu)勢，通過雄性不育系生產(chǎn)F₁代種子是利用雜種優(yōu)勢的主要手段（唐文武等，2005）。目前，蕓薹屬的甘藍（Brassica oleracea L.）、白菜（B.rapa L.）和甘藍型油菜（B.napus L.）存在豐富的雄性不育變異材料，主要為核不育、細胞質不育及核質互作不育類型，在生產(chǎn)上已得到較好地利用，但其雄性不育的分子調控機理尚不明確。十字花科鼠耳芥屬（擬南芥屬）的擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）作為模式植物，其花粉發(fā)育分子調控機理與雄性不育研究較深入，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)從擬南芥克隆獲得的育性調控基因在其他植物中均有同源基因，且表現(xiàn)出高度的進化保守性和相似的結構功能（Ma et al.，2015）。因此，以擬南芥相關研究為基礎，預測分析蕓薹屬植物同源基因的結構功能，對了解油菜、甘藍、白菜等作物的雄性不育分子機理及其雜種優(yōu)勢利用具有重要意義。【前人研究進展】花粉發(fā)育是高度復雜的生物學過程，由造孢細胞分化成花粉母細胞，經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體，然后在絨氈層酶的作用下形成單核的自由小孢子，再經(jīng)過兩次有絲分裂，最終發(fā)育成成熟的花粉粒，任何環(huán)節(jié)發(fā)生異常均可能導致雄性不育（McCormick，1993；Hong et al.，2012；Zhang et al.，2017a）。此外，花粉壁構成異常（Shi et al.，2011；Aloisi et al.，2016）及其最內(nèi)層的絨氈層細胞發(fā)育不完全（Li et al.，2011；Ma et al.，2015）也是花粉敗育的主要原因。至今，已從擬南芥克隆獲得13個雄性不育相關基因，其中擬南芥MS1基因（AtMS1）是調控花粉形成的關鍵基因（Re-imegfird et al.，2017），主要在四分體至小孢子釋放期表達，其編碼含植物同源結構域（Plant homeodo-main，PHD）的核蛋白，與花粉壁構成及其絨氈層發(fā)育密切相關（no et al.，2002；Yang et al.，2007）。水稻PTCl基因為AtMS1同源基因，同樣編碼含PHD結構域的核蛋白，表現(xiàn)出相似的調控絨氈層細胞發(fā)育和花粉壁構成的功能，且PTC1基因能與擬南芥突變體atms1實現(xiàn)部分遺傳互補，說明在單子葉植物和雙子葉植物中均存在一個控制雄蕊程序化發(fā)育的PTC1/MS1開關（Li et al.，2011；Zhang et al.，2017b）。由于擬南芥突變體armsl在表型方面僅表現(xiàn)花粉敗育，植株形態(tài)與花器官生長發(fā)育均正常（Wilson et al.，2001），因此AtMSl基因在生產(chǎn)上具有較高應用價值?！颈狙芯壳腥朦c】蕓薹屬植物作為重要的油料與蔬菜作物種質來源，尤其隨著白菜（Wang et al.，2011）、油菜（Chalhoub et al.，2014）和甘藍（Liu et al.，2014）全基因組序列的公布，其雄性不育的分子生物學研究已成為熱點，但鮮見蕓薹屬作物雄性不育相關基因的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以AtMSl基因序列為參考，搜索并下載其同源序列，利用生物信息學方法對其編碼蛋白質的理化性質、二級結構、三級結構、功能結構域及進化關系進行預測分析，為蕓薹屬作物雄性不育的分子機制和核不育系創(chuàng)制工作提供參考。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

從擬南芥TAIR網(wǎng)站（http：∥www.arabidopsis.org/）下載其花粉發(fā)育關鍵基因AtMS1的基因序列，其序列號為AT5G22260。以AtMS1基因序列為參考，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）和蕓薹屬BRAD基因組數(shù)據(jù)庫（http：∥brassicadb.org/brad/）中進行BLAST比對，設篩選標準為序列相似性≥88.0%。

1.2生物信息學分析

采用ProtParam進行蛋白質理化性質預測，利用SignalP 4.1進行蛋白質信號肽預測，以ProtScale進行蛋白親/疏水性分析，利用WoLF PSORT進行亞細胞定位預測，通過SOPMA在線工具進行蛋白二級結構預測，以SWISS-MODEL進行三級結構預測，利用NetPhos 3.1進行蛋白質的磷酸化位點預測，采用SMART進行蛋白質保守結構域預測，并以DNAman和MEGA 5.2進行不同物種的同源蛋白多重比較和構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2結果與分析

2.1 AtMS1基因同源序列獲取

從蕓薹屬作物基因組中獲得4個與AtMSl基因序列相似性大于88.0%的同源序列，其中2條序列來自甘藍型油菜（B.napus），分別位于A基因組的3號和10號染色體，將其命名為BnMS1A03（序列號106443696）和BnMSlAl0（序列號106370785）；1條序列來自白菜（B.rapa），位于A基因組的10號染色體，命名為BrMS1A10（序列號103845560）；1條序列來自甘藍（B.oleracea），位于C基因組的9號染色體，將其命名為BoMS1C09（序列號106316680）。這4個基因均含有3個外顯子，其CDS序列長度均為2004 bp，編碼667個氨基酸。

2.2 MS1蛋白的理化性質及亞細胞定位預測結果

蛋白質理化性質預測結果如表1所示，4個MS1基因所編碼蛋白的分子量約76.5 kD，不穩(wěn)定指數(shù)均超過41.00，屬于不穩(wěn)定蛋白；理論等電點（pI）以BoMS1C09最低（8.17），以BrMs1A10最高（8.47）；脂肪氨基酸系數(shù)以BoMS1C09和BnMslA03最高（89.81），以BnMS1A10最低（86.01）；疏水性系數(shù)均為負值（-0.319～-0.356），屬于親水性蛋白；均定位于細胞核。

2.3 MS 1蛋白的保守結構域及磷酸化位點分析結果

由圖1可知，4個MSl蛋白均含1個PHD結構域，且PHD結構域均位于661-657 aa，其前端有一個低復雜區(qū)。同樣，AtMSl蛋白僅含1個PHD結構域，位于616～662 aa。由此推測，MSl蛋白屬于PHD-fmger蛋白家族成員，N_PHD結構域在蕓薹屬進化中高度保守。PHD結構域含Cys₄-His-Cys₃（C₄-HC₃）鋅結合基序，其形態(tài)一般為球狀，能結合2個鋅離子而保持穩(wěn)定的空間結構，在基因轉錄和染色質狀態(tài)調控方面發(fā)揮重要作用（張帆等，2009）。

4個MS1蛋白磷酸化位點預測結果顯示，其均含有較多的磷酸化位點，以絲氨酸（Ser）磷酸化位點最多，其中又以BrMS1A10最多（30個位點），BoMS1C09和BriMS1A03最少（26個位點）；其次是蘇氨酸（Thr）磷酸化位點，以BnMS1A10最多（17個位點），BoMS1C09最少（12個位點）；以酪氨酸（Tyr）磷酸化位點最少，其中BoMS1C09最多（8個位點），而BrMS1A10和BnMS1A10最少（6個位點）（圖2）?？梢?，MS1蛋白的磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔。

2.4 MS1蛋白的二、三級結構預測結果

二級結構預測結果如表2所示，4個MS1蛋白的二級結構均由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋為主要結構元件，所占比例均在40.00%以上，可能與此類蛋白含有PHD結構域和亮氨酸（Leu）拉鏈的結構有關，而β-轉角所占比例最低，僅為10.00%左右。對4個MS1蛋白進行同源建模，預測其三級結構。結果顯示，4個MS1蛋白均含有一個PHD結構域，位于616～652 aa，具有典型的C4HC3鋅結合基序；三級結構大致相同，均為球狀的功能結構域（圖3），有利于特異性識別組蛋白H3K4的甲基化密碼，從而發(fā)揮基因轉錄調控功能。

2.5 MS1蛋白的同源性分析結果

利用DNAMAN對擬南芥、白菜、甘藍和油菜中的MS1蛋白進行多序列比對分析，結果如圖4所示，5個MS1蛋白的氨基酸序列相似性為95.69%，表明其同源性極高，其中4個蕓薹屬作物MS1蛋白的氨基酸序列相似性更高，達98.39%。4個蕓薹屬作物MS1蛋白雙序列比對結果顯示，BoMS1C09與BnMS1A03的氨基酸序列相似性最高，達99.55%，BrMs1A10與BnMS1A10的氨基酸序列相似性也高達98.35%。擬南芥AtMS1與4個蕓薹屬作物MS1蛋白的雙序列比對結果顯示，AtMS1與BrMs1A10、BoMS1C09、BnMS1A03、BnMS1A10的氨基酸序列相似性分別為88.15%、88.44%、88.59%和88.59%，表明十字花科植物MS1基因進化中，擬南芥與蕓薹屬作物的親緣關系較遠，而3個蕓薹屬作物（白菜、甘藍和甘藍型油菜）的親緣關系較近。

由圖4還可知，5個MS1蛋白PHD結構域的序列高度保守，僅有3個位點氨基酸殘基存在差異。方框內(nèi)的7個半胱氨酸（Cys）和1個組氨酸（His）構成了C4HC3鋅結合基序，PHD結構域的共有序列為C-X1-C-X₁₂-C-X₂-C-X₄-H-X₂-C-X₁₄-C-X₂-C，與張帆等（2009）的研究結果一致。PHD結構域Cys C₂與C₃之間的12個氨基酸殘基形成Loopl，而C₅與C₆之間的14個氨基酸殘基形成Loop2，每環(huán)各與1個鋅離子結合形成穩(wěn)定的Cross-brace拓撲結構，此類PHD結構域能與特異的核蛋白相互作用，進而調節(jié)基因轉錄表達。同時Cys之間及Cys與His之間的氨基酸較保守，與Bienz（2006）的研究結果一致。表明MS1蛋白在進化過程中其序列高度保守性，不易發(fā)生變異，以確保其花粉育性調控功能的穩(wěn)定性。

2.6 MS1同源基因的系統(tǒng)進化分析結果

通過NCBI等數(shù)據(jù)庫檢索，從豆科的木豆（Caja-nus cajan）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、綠豆（Hgna radiata）、薔薇科的森林草莓（Fragaria vesca）、梅花（Prunus mume）、茄科的煙草（Nicotiana tabacum）、楊柳科的胡楊（Populus euphratica）、梧桐科的可可（Theobroma cacao）、鼠李科的棗（Ziziphus Jujuba）、錦葵科的陸地棉（Gos～pium hirsutum）、胡桃科的核桃（Juglans regia）及十字花科琴葉擬南芥（Arabidop-sis lyrata）、亞麻薺（Camelina sativa）、蘿卜（Rapha-nus sativus）等植物中獲得MS1同源蛋白氨基酸序列，均含PHD結構域，被預測為雄性不育的同源蛋白序列。將其與AtMS1和4個蕓薹屬MS1蛋白（BnMS1A03、BnMSlA10、BrMS1A10和BoMS1C09）進行聚類分析并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設自舉值（Bootstrap）為1000。結果如圖5所示，19個MS1同源蛋白聚為兩大類，其中琴葉擬南芥、亞麻薺和蘿卜的MS1蛋白與4個蕓薹屬MS1蛋白及AtMS1蛋白聚為一類，均屬于十字花科植物；其他科的植物MS1蛋白聚為另一類，其中豆科的木豆、鷹嘴豆和綠豆的MS1蛋白聚為一小簇，薔薇科森林草莓、梅花與鼠李科棗的MS1蛋白聚為一小簇，而錦葵科的陸地棉、梧桐科的可可與楊柳科的胡楊MS1蛋白聚為一小簇。該聚類結果與植物系統(tǒng)分類關系、進化歷程基本吻合，因此該類蛋白可用于植物親緣關系鑒定及遺傳進化分析。

3討論

PHD是真核生物中廣泛存在的一種進化保守的鋅指結構域，目前在400多種真核生物蛋白質中均有發(fā)現(xiàn)（Kaadige and Ayer，2006），由50～80個氨基酸殘基組成，具有典型的C4HC3鋅結合基序，其7個半胱氨酸殘基和1個組氨酸殘基結合2個鋅離子而形成2個環(huán)，促使整個結構域保持穩(wěn)定并發(fā)揮調節(jié)功能（Townsley et al.，2004）。PHD結構域是14種已知的鋅指結構域中的一種，作為組蛋白密碼的解讀器之一，在基因轉錄調控、細胞周期調控等過程發(fā)揮重要作用。但這些研究主要集中在人類、小鼠等動物上，在植物研究較少，包括PHD-finger基因家族蛋白在植物開花調控、逆境脅迫應答等方面的研究。PHD-finger基因家族在植物開花調控方面發(fā)揮重要作用，如在擬南芥春化途徑中，含PHD結構域的春化不敏感蛋白（VIN3）能通過對開花抑制基因FLC的染色質組蛋白進行甲基化、乙?；裙矁r修飾，使得FLC染色質從松弛狀態(tài)轉為凝縮狀態(tài)，通過關閉FLC轉錄活性而促進開花（Kim and Sung，2017）；擬南芥At-MS1基因編碼含PHD結構域的核蛋白與花粉壁構成及其絨氈層發(fā)育有關（Ito et al.，2007；Yang et al.，2007）；水稻PTC1基因編碼含有PHD結構域的核蛋白調控花粉壁構成及絨氈層細胞發(fā)育，形成控制雄蕊程序化發(fā)育的PTC1/MS1開關（Li et al.，2011；Zhang et al.，2017b）。PHD-finger基因家族蛋白在生物逆境應答方面也發(fā)揮重要作用，如水稻OsPHD1在逆境環(huán)境下表達量明顯升高，且轉基因水稻通過調節(jié)OsPHD1基因表達量來調控其抗逆性（劉雨等，2011）；玉米PHD-finger基因家族在玉米發(fā)育過程中廣泛表達，其中有15個基因可能與逆境脅迫應答密切相關（Wang et al.，2015）。也有研究表明，在擬南芥雄蕊減數(shù)分裂前期Ⅰ至中期Ⅰ中，染色質蛋白MMD1/DUET中的MMD1蛋白PHD結構域在染色體壓縮及與甲基化的組蛋白尾結合中發(fā)揮重要功能作用（Wang et al.，2016）。本研究以AtMS1基因為參考，從NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選獲得蕓薹屬植物（甘藍型油菜、白菜和甘藍）的MS1同源基因，其編碼蛋白均含有PHD結構域，屬于PHD-fmger基因家族成員（Wilson et al.，2001），定位于細胞核內(nèi)，與AtMS1蛋白（Ye et al.，2010）和水稻PTC1蛋白（Li et al.，2011）的亞細胞定位結果一致。

PHD-finger基因家族蛋白主要通過甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化等方式修飾組蛋白，從而改變?nèi)旧|的狀態(tài)而參與基因的轉錄調控，如動物ME-KK1蛋白的PHD結構域具有E3泛素連接酶活性，能介導ERK1的泛素化和降解（馬紅輝等，2008）；PHD結構域能特異識別并結合組蛋白H3K4進行甲基化修飾，從而發(fā)揮基因轉錄調控功能，如腫瘤抑制蛋白ING家族的PHD結構域能識別H3K4me2/3，并將復合物結合在D1啟動子上，從而抑制基因轉錄（Shi et al.，2006）。磷酸化作為重要的蛋白修飾方式，由激酶和磷酸酶分別催化磷酸化和去磷酸化反應，在花藥發(fā)育過程中參與不同信號轉導（Yang et al，2015），但鮮見蛋白磷酸化與花粉發(fā)育相關性的研究報道。本研究中4個蕓薹屬作物MS1蛋白含有較多的磷酸化位點，且各蛋白的磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔，但由于蛋白磷酸化具有短暫性、高動態(tài)性及低豐度等特點，因此MS1蛋白的生物學功能與各位點的磷酸化修飾相關性尚需進一步研究。

4結論

蕓薹屬作物MSl基因屬于PHD-finger基因家族，其序列高度保守，參與調控花粉發(fā)育成熟過程。