滕彥淇 胡秋龍 蘇小軍 李會東 金元昌

摘要[目的]優(yōu)化單酶復(fù)配酶解纖維素的條件。[方法]以經(jīng)1 200 kGy 60Co γ-射線輻照處理過的玉米秸稈為原料，采用響應(yīng)面分析法，對外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶等酶進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]4個(gè)因素對酶解產(chǎn)還原糖的影響主次順序依次為木聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切葡聚糖酶。得到最優(yōu)酶添加量為外切葡聚糖酶1.07 U/g、內(nèi)切葡聚糖酶31.53 U/g、β-葡萄糖苷酶20.81 U/g和木聚糖酶81.96 U/g。在上述條件下，試驗(yàn)驗(yàn)證還原糖產(chǎn)量372.624 mg/g與預(yù)測值能夠很好地吻合。[結(jié)論]該中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化單酶復(fù)配酶解輻照玉米秸稈的方法可靠，可為單酶復(fù)配提供參考。

關(guān)鍵詞γ-射線輻照；響應(yīng)面法；酶解；葡萄糖

中圖分類號S216文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）10-0001-04

Optimization of Enzyme Complex Formulation of Irradiation Corn Straw by Response Surface Method

TENG Yanqi1，HU Qiulong2，3，SU Xiaojun2，3，JIN Yuanchang1，5* et al（1.College of Life Science，Hunan University of Science and Technology，Xiangtan，Hunan 411201；2.Hunan Engineering Laboratory for Alcohol Fuels from Biomass，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；3.Hunan Collaborative Innovation for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；5.Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metalpolluted Soils，College of Hunan Province，Xiangtan，Hunan 411201）

Abstract[Objective] To study the optimal ratio of enzyme complex formulation.[Method] 1 200 kGy 60Co γray irradiation corn straw as raw material，the response surface methodology was applied for analyzing the cellobiohydrolase，the endoglucanase，the βglucanase and the xylanase.[Result] The reducing sugar content was extremely significantly by xylanase dosage but not significantly impacted by cellobiohydrolase，βglucanase and endoglucanase.The optimum conditions for supplemental levels were found to be hydrolysis at cellobiohydrolase ratio of 1.07 U/g，endoglucanase ratio of 31.53 U/g，βglucanase ratio of 20.81 U/g and xylanase ratio of 81.96 U/g.The reducing sugar content under these conditions was 372.624 mg/g than before optimization and basically according with the model prediction value.[Conclusion] The optimization of enzyme complex formulation of irradiation corn straw by central composite design and response surface method is reliable，and it can provide reference for the complex of single enzyme.

Key wordsγray irradiation；Response surface method；Hydrolysis；Glucose

乙醇是生物質(zhì)液體能源的主要形式，清潔可再生，是化石燃料的理想替代品[1-2]。在木質(zhì)纖維素通過生物化學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化為乙醇及丁醇等燃料和高附加值的化學(xué)品的過程，一般包括預(yù)處理、水解、發(fā)酵、產(chǎn)物分離等操作部分，其中纖維素水解為可發(fā)酵糖起著關(guān)鍵性的作用[3-4]。纖維素的水解主要有化學(xué)法和酶法，從環(huán)保的角度出發(fā)，纖維素酶解作用是一條木質(zhì)纖維素被徹底降解而不會對環(huán)境造成污染的有效途徑，并且酶解反應(yīng)有著糖損耗低、副產(chǎn)物少、條件溫和等特點(diǎn)，因此備受關(guān)注[5]。

纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了任何一種單一的酶都難以高效地水解它，能水解天然纖維素的纖維素酶是一個(gè)復(fù)雜的多酶體系。纖維素酶是生物降解纖維素生成葡萄糖一組酶的總稱[6]，由內(nèi)切葡聚糖酶（也稱Cx酶）、外切葡聚糖酶（也稱C1酶）、β-葡萄糖苷酶（也稱CB酶）3個(gè)主要成分組成的誘導(dǎo)型復(fù)合酶系。當(dāng)3個(gè)主要成分的活性比例適當(dāng)時(shí)，就能完成對纖維素的降解[7-8]。木聚糖酶是一類木聚糖降解酶系，屬于水解酶，主要用來降解含量僅次于纖維素的半纖維素[9]。

不同的單酶之間都存在著協(xié)同作用，研究它們之間的協(xié)同作用，有效地添加提高酶解率的酶，減少抑制酶解的酶，可提高酶解效率[10-12]。γ-射線輻照預(yù)處理是一種物理處理法，不需要高溫高壓等極端條件，副產(chǎn)物少，污染少，能夠有效提高酶解效率[13]。有研究報(bào)道，γ-射線輻照預(yù)處理稻草、稻殼、麥稈、玉米稈、木屑等原料可有效提高酶的可及度，從而提高酶解產(chǎn)糖率[14]。

響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，通過局部試驗(yàn)回歸擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系而得到準(zhǔn)確有效的結(jié)論，能在整個(gè)考察區(qū)域上確定各因素的最佳組合及最優(yōu)響應(yīng)值[15]。響應(yīng)面分析法主要包括全因素設(shè)計(jì)、部分因素設(shè)計(jì)、中心組合設(shè)計(jì)和拉丁超立方設(shè)計(jì)等，最常用的是中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)（BBD）[16]。CCD是多因素5水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平適用廣泛，BBD一般適用于3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

筆者在纖維素輻照的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)系統(tǒng)地研究了外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶復(fù)配對酶解輻照玉米秸稈的影響，探討了最優(yōu)添加量，以期為降低纖維素酶成本，優(yōu)化酶系結(jié)構(gòu)和纖維素的有效酶解提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。玉米秸稈由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地提供。

1.1.2試劑。冰醋酸、醋酸鈉、 3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、四水合酒石酸鉀鈉、苯酚均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，所有試劑均為分析純。內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶均由Sigma試劑有限公司提供，酶活分別為2.00、2.50、6.85、0.13 U/mg。

1.1.3儀器。Fz102微型植物粉碎機(jī)，天津市泰嬌特儀器有限公司；ZHWY-2012C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海天域分析儀器制造有限公司；R0704135可見分光光度計(jì)，上海尤尼克試驗(yàn)有限公司。LD5-2A低速離心機(jī)，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2試驗(yàn)方法收集田間干玉米秸稈曬干后，剪成3 cm左右小段，在室溫下用60Co γ-射線進(jìn)行輻照預(yù)處理，輻照劑量率為2 kGy/h，處理計(jì)量為1 200 kGy/h。經(jīng)輻照后粉碎過20目篩，放入密封袋內(nèi)保存。經(jīng)輻照處理后，玉米秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素分別由40.80%、30.85%、15.70%變?yōu)?0.93%、17.26%、15.32%。輻照對玉米秸稈的纖維素和半纖維具有降解作用，對木質(zhì)素降解影響不大。稱取1 g輻照預(yù)處理玉米秸稈置于50 mL錐形瓶中，加入適量酶和0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 4.8），使其固液比為1∶20，充分搖勻，將上述三角瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中，在轉(zhuǎn)速130 r/min、溫度 50 ℃、pH 4.8、反應(yīng)時(shí)間 72 h的條件下進(jìn)行一系列試驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴終止反應(yīng)，離心取上清液，上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用DNS法測定還原糖濃度，用離子色譜法測定葡萄糖濃度。

1.2.1不同酶酶解的單因素試驗(yàn)。

研究不同單酶酶解輻照玉米秸稈對還原糖濃度的影響。分別用不同濃度的外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶在相同條件下對輻照玉米秸稈進(jìn)行酶解，用DNS法測定還原糖含量。

1.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)[17]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶的酶添加量為因素，選用中心組合模型CCD，以葡萄糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素5水平共30個(gè)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平。

1.2.3還原糖測定。采用3，5-二硝基水楊酸法[18]。

2結(jié)果與分析

2.1不同酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1外切葡聚糖酶單獨(dú)酶解輻照玉米秸稈。

由可知，外切葡聚糖酶添加量在1.17 U/g之前，隨著外切葡聚糖酶添加量的增加，還原糖含量隨之增加，之后趨于緩慢，且外切葡聚糖酶添加量對酶解的還原糖含量影響不大。

對試驗(yàn)結(jié)果二次擬合，得出還原糖含量與各因素關(guān)系方程：y=367.19-1.22A-2.29B-3.03C-3.45D-6.28AB-0.082AC-1.55AD-5.19BC-3.55BD+3.29CD-8.32A2-6.25B2-8.35C2-7.10D2?；貧w方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性用F檢驗(yàn)判斷，P值越小，則響應(yīng)面變量的顯著程度越高，P<0.01時(shí)影響極顯著，P<0.05時(shí)影響顯著。

P>F，P值越小說明相應(yīng)因素顯著性越好，酶解還原糖含量的預(yù)測值與實(shí)際值擬合情況見圖5，顯示預(yù)測值和實(shí)際值擬合良好。該模型回歸P<0.001，說明模型回歸顯著性可靠。失擬項(xiàng)P（0.462 2）>0.05為不顯著項(xiàng)，失擬項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且該模型決定系數(shù)（R2）為0.959 5，校正系數(shù)（R2Adj）為0.921 7，說明該模型擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)誤差較小。方差分析顯示，4個(gè)因素的F值的大小順序?yàn)镈、C、B、A，得到影響響應(yīng)值的酶大小次序?yàn)槟揪厶敲?、外切葡聚糖酶、?葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶。

45卷10期滕彥淇等響應(yīng)面法優(yōu)化單酶復(fù)配酶解輻照玉米秸稈的研究

2.2.2因素間的交互影響。

采用DX8軟件分析響應(yīng)面數(shù)據(jù)，直觀地給出了在2個(gè)因素的水平固定在中心點(diǎn)的情況下其余2個(gè)因素交互效應(yīng)的響應(yīng)面的3D分析圖。內(nèi)切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶添加量對酶解還原糖含量的交互影響如圖6所示。當(dāng)固定外切葡聚糖酶和木聚糖酶添加量時(shí)，在β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切酶添加量較低時(shí)，還原糖含量隨2種酶添加量的增加而增加，可能是玉米秸稈中的半纖維素被木聚糖酶降解，其對纖維素的包覆作用減弱，纖維素酶和纖維素液固異相反應(yīng)的空間位阻降低，更多的纖維素被暴露出來，加快了內(nèi)切酶和β-葡萄糖苷酶與底物的吸附、擴(kuò)散速度和酶解速度，進(jìn)而提高了酶解率。當(dāng)添加量達(dá)到一定值時(shí)，隨酶添加量的增加，酶解還原糖含量緩慢降低，可能是2種酶吸附在纖維素表面，形成競爭位點(diǎn)，阻礙了酶的水解程度。當(dāng)內(nèi)切葡聚糖酶添加量在30.00～32.00 U/g、β-葡萄糖苷酶添加量在18.00～21.00 U/g時(shí)，酶解還原糖含量逐漸增加并達(dá)到極大值。

外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶對還原糖含量的交互影響如圖7所示。當(dāng)固定內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的添加量，逐漸增大外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的添加量時(shí)，酶解還原糖含量會隨之增大，但當(dāng)這2個(gè)因素的添加量增加到一定程度時(shí)，酶解還原糖含量開始緩慢下降。外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶存在協(xié)同作用。當(dāng)外切葡聚糖酶添加量在1.00～1.17 U/g、β-葡萄糖苷酶添加量在18.00～21.00 U/g時(shí)，酶解還原糖含量逐漸增大并達(dá)到最大值。

2.3最優(yōu)條件預(yù)測及模型驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程，利用Design-Expert軟件預(yù)測的最優(yōu)條件，酶解還原糖最高值為368.092 mg/g，此時(shí)4個(gè)因素的取值如下：外切葡聚糖酶添加量為1.07 U/g，內(nèi)切葡聚糖酶添加量為31.53 U/g，β-葡萄糖苷酶添加量為20.81 U/g，木聚糖酶添加量為81.96 U/g。

為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳酶添加量的條件下對輻照后的玉米秸稈粉末進(jìn)行3次水平試驗(yàn)，實(shí)際酶解還原糖含量為372.624 mg/g，與模型預(yù)測值相近。

3結(jié)論與討論

利用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化，各因素對酶解產(chǎn)還原糖的影響從大到小依次為木聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶。得到最佳酶解添加量如下：外切葡聚糖酶添加量為1.07 U/g，內(nèi)切葡聚糖酶添加量為31.53 U/g，β-葡萄糖苷酶添加量為20.81 U/g，木聚糖酶添加量為81.96 U/g。試驗(yàn)驗(yàn)證的實(shí)際值與模型預(yù)測值基本吻合，說明該模型真實(shí)可靠。研究結(jié)果表明，該中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化單酶復(fù)配酶解輻照玉米秸稈的方法可為單酶復(fù)配提供參考。

纖維素酶是由多種組分組成的復(fù)合酶系，各組分間如何發(fā)揮作用，目前普遍認(rèn)可的酶解機(jī)理是協(xié)同作用模型。在協(xié)同降解過程中首先由Cx酶在纖維素的內(nèi)部起作用，在纖維素的非結(jié)晶部位進(jìn)行切割產(chǎn)生新的末端，然后由C1酶以纖維素二糖為單位從末端進(jìn)行水解，再由CB酶將纖維素二糖水解為葡萄糖[20-21]。纖維素酶各組分間的比例及彼此相互協(xié)同作用對整個(gè)酶解過程影響較大，纖維素多組分協(xié)同作用比單一組分的水解效果要顯著。

纖維素乙醇生產(chǎn)過程中酶法糖化工段的關(guān)鍵是降低纖維素酶的生產(chǎn)成本、投加量和提高酶解效率。多酶復(fù)配技術(shù)的目的是優(yōu)化不同酶添加量及酶系相互協(xié)調(diào)作用來調(diào)控酶系的比例，使酶解更加充分進(jìn)而減少酶用量并降低成本。該研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，系統(tǒng)地研究了外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶進(jìn)行復(fù)配對酶解的影響，得出最優(yōu)添加量，指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。不同酶復(fù)配是增加生物質(zhì)酶解效率的重要方法，經(jīng)過復(fù)配酶間的相互協(xié)調(diào)作用明顯增強(qiáng)。

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