南文卓 鄭丹煒 朱國(guó)鵬 張小貝

摘 要 為探索甘薯最佳TD-SSR-PCR體系，利用L16（43）正交設(shè)計(jì)研究2×PCR Mix、引物、模板DNA等主要影響因素的適宜濃度，并在此基礎(chǔ)上對(duì)擴(kuò)增程序和聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣量進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化后的TD-SSR-PCR反應(yīng)體系包括：10 μL 2×PCR Mix、100 ng模板DNA、0.4 μmol/L引物，1 μL甘油，總體積20 μL；優(yōu)化后的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s、Tm+5 ℃～Tm-5 ℃（每循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃，Tm選用一對(duì)引物中的較小Tm值）退火30 s（退火時(shí)間因擴(kuò)增片段大小而異）、72 ℃延伸1 min共20個(gè)循環(huán)，94 ℃變性45 s、Tm-5 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共15個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存；聚丙烯酰胺電泳上樣量以1.5～2 μL為宜。在此條件下，利用引物Z37對(duì)10份甘薯材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的條帶清晰、多態(tài)性高，表明此條件適用于甘薯的TD-SSR-PCR反應(yīng)體系。

關(guān)鍵詞 甘薯；TD-SSR-PCR；正交設(shè)計(jì)；2×PCR Mix；最佳上樣量

中圖分類號(hào) Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Optimization of TD-SSR-PCR System on Sweet Potato

NAN Wenzhuo，ZHEGN Danwei，ZHU Guopeng*，ZHANG Xiaobei

College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou， Hainan 570228， China

Abstract To explore the best TD-SSR-PCR system on sweet potato， an L16（43）orthogonal design was used to study the suitable concentration of the main influence factors such as 2×PCR Mix， primers and template DNA. And on this basis， the amplification process and the best sample amount of polyacrylamide gel electrophoresis were optimized. The results showed that the optimized 20 μL TD-SSR-PCR reaction system included： 10 μL 2×PCR Mix， 100 ng template DNA， 0.4 μmol/L primers， 1 μL glycerol， total volume is 20 μL； The optimized PCR amplification system started at initial denaturation for 4 min at 94 ℃， followed by 20 cycles of denaturation for 45 s at 94 ℃， anneal for 30 s（Annealing time varied depending on the DNA fragment size）at Tm+5～Tm-5 ℃（annealing temperature decreased 0.5 ℃ per cycle， chose the smaller Tm of a pair of primers as the using one）， extension for 1 min at 72℃， then 15 cycles of denaturation for 45 s at 94 ℃， anneal for 30 s at Tm-5 ℃， extension for 1 min at 72 ℃， the amplification was completed after extension for 7 min at 72 ℃， finally stored at 4 ℃. The best sample amount of polyacrylamide gel electrophoresis was 1.5-2 μL. Under this condition， clear banding pattern with high polymorphic was obtained by using primer Z37 to amplify 10 sweet potato materials. It indicated that this condition was suitable for TD-SSR-PCR of sweet potato.

Key words sweet potato； TD-SSR-PCR； orthogonal design； 2×PCR Mix； the best sample amount

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.016

甘薯[Ipomoea batatas（L）Lam.]作為主要糧食作物，不論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家都具有重要意義[1]。甘薯為同源六倍體作物，染色體數(shù)量多，遺傳背景復(fù)雜[2]，且繁殖方式為無(wú)性繁殖，嚴(yán)重制約甘薯育種和生產(chǎn)的發(fā)展。

SSR（Simple sequence repeat）即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，通常又稱為微衛(wèi)星，是一類主要由1～6個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列。每個(gè)SSR位點(diǎn)兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)可設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物來(lái)擴(kuò)增不同重復(fù)次數(shù)的SSR序列。SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，多態(tài)性高，并可區(qū)分種質(zhì)資源的純合和雜合狀況。另外SSR在實(shí)驗(yàn)中對(duì)DNA模板的用量和質(zhì)量要求相對(duì)較低，結(jié)果重復(fù)性好[3]，相比于AFLP、RAPD、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)具有更高的可靠性[4]。

對(duì)甘薯材料進(jìn)行PCR反應(yīng)體系優(yōu)化方面的研究已有報(bào)道。宋吉軒[5]和張世安[6]建立了甘薯ISSR-PCR反應(yīng)體系，雷劍[7]、蒲志剛[8]分別優(yōu)化了甘薯RAPD-PCR和AFLP-PCR反應(yīng)體系，而關(guān)于甘薯SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化則未見報(bào)道。多數(shù)已報(bào)道的其他物種[9-11]的SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化都是根據(jù)單個(gè)影響因素進(jìn)行不同梯度間的組合從而選擇最適合的反應(yīng)體系，關(guān)于現(xiàn)今廣為應(yīng)用的商品化PCR Mix體系優(yōu)化研究則相對(duì)較少[12-13]。不同研究對(duì)象從SSR擴(kuò)增到最后的電泳，每個(gè)步驟都會(huì)影響到最終效果。本研究擬利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)甘薯SSR-PCR反應(yīng)體系（2×PCR Mix、引物和模板3個(gè)因素4個(gè)水平）進(jìn)行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上對(duì)SSR-PCR反應(yīng)程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣量繼續(xù)優(yōu)化，以期建立一套適用于甘薯TD-SSR-PCR的反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

10份甘薯材料取自海南大學(xué)海甸校區(qū)試驗(yàn)基地。

2×PCR Mix為東盛生物產(chǎn)品，其組分包括100 mmol/L KCL、20 mmol/L Tris-HCL、3 mmol/L MgCL2、400 umol Dntps、0.1 U/μL TaqDNA聚合酶、溴酚藍(lán)、其他增強(qiáng)劑與穩(wěn)定劑。

試驗(yàn)引物ZY5序列Fwd：TCGTCACTTTCTCTC

TCCTG；Rev：GCTCTCCTCCATCTCTTCTG，重復(fù)序列為（AG）10。

結(jié)論驗(yàn)證引物Z37序列Fwd：GGCGACTGTAA

TGTGGTGAA；Rev：CGGGAGGTATCTTGGATTGA，重復(fù)序列為（CTGCTC）3。引物均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

Marker為東盛生物公司的DS 2 000。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測(cè) 采用CTAB法提取基因組DNA，用NanoDrop檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，并用瓊脂糖跑膠。將樣品稀釋到100 ng/μL后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化 對(duì)編號(hào)16的甘薯材料設(shè)計(jì)3因素、4個(gè)水平的L16（43）正交表（表1、2），選擇最佳SSR擴(kuò)增體系。SSR擴(kuò)增在Heal Force T960 PCR儀上進(jìn)行。

1.2.3 甘薯SSR-PCR方法的選擇 對(duì)優(yōu)化后的體系分別進(jìn)行梯度PCR（G-PCR）和降落PCR（TD-PCR）。G-PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s（55 ℃為預(yù)試驗(yàn)中確定的最佳退火溫度），72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；然后，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。TD-PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s、Tm+5 ℃～Tm-5 ℃退火30 s（每循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃，Tm選用一對(duì)引物中的較小Tm值）、72 ℃延伸1 min共20個(gè)循環(huán)，94 ℃變性45 s、Tm-5 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共12個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)，每孔點(diǎn)樣4 μL。所用電泳儀為北京六一電泳儀廠的DYCZ-30C型電泳儀，1.0 mm 40齒梳子，100 V恒壓電泳2 h，銀染顯色，照相保存。

1.2.4 TD-SSR-PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化 以一對(duì)上下游引物的較低Tm±5 ℃值為范圍對(duì)10份甘薯材料進(jìn)行TD-PCR。對(duì)退火時(shí)間和二輪循環(huán)次數(shù)（一輪循環(huán)退火溫度漸降，二輪循環(huán)退火溫度不變）2個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選擇最優(yōu)TD-SSR-PCR組合。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣量的優(yōu)化 利用優(yōu)化后的TD-SSR-PCR最佳反應(yīng)體系對(duì)上樣量進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)置5個(gè)梯度，分別為1、1.5、2、2.5、3 μL，選擇最佳上樣量。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計(jì)SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

正交設(shè)計(jì)SSR-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增見圖1。從圖1可看出，16個(gè)組合都可以擴(kuò)增出條帶，其中第1、2、5、6、9、13組合擴(kuò)增條帶較為清晰但敏感性差，且每組相同PCR Mix梯度的條帶隨著DNA含量的增加逐漸變強(qiáng)，說(shuō)明模板DNA為PCR擴(kuò)增體系主要影響因素。其余組合敏感性較好，尤其第12組合擴(kuò)增條帶最為清晰，為本研究最優(yōu)組合，即20 μL PCR體系包含：10 μL PCR Mix、100 ng模板DNA、0.4 μmol/L引物，5%甘油，其余加ddH2O補(bǔ)齊。

2.2 G-PCR與TD-PCR結(jié)果比較

G-PCR與TD-PCR的擴(kuò)增結(jié)果見圖2。由圖2可看出，TD-PCR較G-PCR特異性更高，但部分條帶顏色較淺?？紤]到試驗(yàn)結(jié)果可靠性，TD-PCR更適合SSR的擴(kuò)增，條帶深淺則進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 不同TD-SSR-PCR程序擴(kuò)增結(jié)果分析

不同TD-SSR-PCR程序?qū)SR擴(kuò)增的影響見圖3。由圖3可看出，在一定循環(huán)數(shù)和退火時(shí)間范圍內(nèi)，循環(huán)數(shù)與PCR擴(kuò)增條帶強(qiáng)度正相關(guān)，循環(huán)數(shù)越多，條帶越強(qiáng)；特異性擴(kuò)增則與退火時(shí)間成負(fù)相關(guān)，退火時(shí)間越短，特異性越強(qiáng)。圖3中的組合1，由于其退火時(shí)間較組合2、3長(zhǎng)，非特異性擴(kuò)增較多，組合2和3雖然特異性較強(qiáng)，但產(chǎn)物量較少，條帶較淺。相較而言，組合4～6擴(kuò)增產(chǎn)物量較多，特異性與非特異性擴(kuò)增也可以區(qū)分，其中組合5、6由于退火時(shí)間的縮短，有效抑制了非特異性條帶的擴(kuò)增，使條帶更加清晰易讀，為較適宜TD-SSR-PCR組合。

2.4 聚丙烯酰胺凝膠不同上樣量的電泳結(jié)果分析

不同上樣量對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的影響見圖4。由圖4可知，上樣量的多少幾乎不影響特異性和非特異性條帶的區(qū)分，但是在上樣量為1.5～2 μL時(shí)，泳道背景淺且原本堆積成片的較小片段也可以被分離成條，使條帶更加清晰易讀。因此，聚丙烯酰胺電泳建議上樣量為1.5～2 μL。

2.5 TD-SSR-PCR優(yōu)化體系的驗(yàn)證

引物Z37的TD-SSR擴(kuò)增結(jié)果見圖5。由圖5可看出，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果利用引物Z37進(jìn)行TD-SSR-PCR擴(kuò)增時(shí)，退火30 s和20 s都可擴(kuò)增出條帶，但退火30 s時(shí)較大片段更加清晰。與引物ZY5更適合的20 s之所以造成差異可能是擴(kuò)增片段大小不一，擴(kuò)增片段大則所需退火時(shí)間長(zhǎng)，反之則短。

3 討論

在優(yōu)化PCR反應(yīng)條件時(shí)需考慮到各因素對(duì)反應(yīng)的影響。梁玉琴等[12]在優(yōu)化柿樹反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)影響PCR反應(yīng)最顯著的因素是Mix，而本研究中模板DNA含量為最主要影響因素，可能與柿樹為喬木而甘薯為草本植物有關(guān)。李玉恒等[14]對(duì)大鼠RNA的擴(kuò)增結(jié)果表明，TD-PCR省略了G-PCR摸索最適退火溫度的過(guò)程，且其靈敏度和特異性均高于G-PCR；張瑞強(qiáng)等[15]發(fā)現(xiàn)相同的反應(yīng)體系，TD-PCR更有益于提高PCR特異性，這些觀點(diǎn)在本研究中也得到驗(yàn)證。

本研究證明TD-PCR是甘薯PCR擴(kuò)增較好的選擇，但其起始退火溫度的升高在提高PCR擴(kuò)增特異性的同時(shí)，也提高了引物結(jié)合難度，降低了擴(kuò)增效率。一般普通PCR的擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)即可，但本研究同樣循環(huán)數(shù)的TD-PCR產(chǎn)物卻較少，電泳條帶較淺。故使用TD-PCR時(shí)應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)需要適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)，得到足夠產(chǎn)物量。

本研究預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCR的優(yōu)化有時(shí)很難區(qū)分設(shè)計(jì)的各組合的優(yōu)劣，對(duì)此建議：①優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，可先利用稍低的退火溫度，溫度太高可能某些特異性的條帶也消失，條帶結(jié)果無(wú)二，難以區(qū)分；溫度稍低雖然有非特異性條帶產(chǎn)生，但容易區(qū)分組合優(yōu)劣。②優(yōu)化PCR退火時(shí)間，要根據(jù)體系中的酶延伸速度和擴(kuò)增片段大小適當(dāng)選擇，然后根據(jù)結(jié)果決定是否繼續(xù)優(yōu)化。③優(yōu)化聚丙烯酰胺凝膠電泳最佳上樣量，參考本研究設(shè)計(jì)梯度，擇優(yōu)選用。本研究中，3 μL上樣量也可讀帶，但泳道背景深，若增加樣本數(shù)量，則整個(gè)電泳圖會(huì)顯得雜亂。反之，1.5～2 μL時(shí)泳道背景清亮，一目了然，且長(zhǎng)度接近的較小片段也可很好地區(qū)分。究其原因，進(jìn)行SSR-PCR的擴(kuò)增最重要的是引物，特異性高的引物不用繁瑣的優(yōu)化也可得到漂亮且可靠的條帶，特異性低的引物則需要一步步的優(yōu)化以達(dá)到理想的效果。

4 結(jié)論

利用不同分子標(biāo)記對(duì)不同物種進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用的反應(yīng)體系各有差異，對(duì)所研究物種建立穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系是深入分子研究的基礎(chǔ)。本研究建立了適用于甘薯材料的20 μL TD-SSR-PCR反應(yīng)體系：10 μL 2×PCR Mix、100 ng模板DNA、0.4 μmol/L引物，1 μL甘油，其余加ddH2O補(bǔ)齊；優(yōu)化后的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s、Tm+5 ℃～Tm-5 ℃（每循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃，Tm選用一對(duì)引物中的較小Tm值）退火30 s（使用DNA聚合酶聚合速度約1 kbp/min，退火時(shí)間因DNA片段大小而異）、72 ℃延伸1 min共20個(gè)循環(huán)，94 ℃變性45 s、Tm-5 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共15個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存；聚丙烯酰胺電泳上樣量以1.5～2 μL為宜。

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