曹璐璐 孫進華 王家保

摘 要 為建立穩(wěn)定的荔枝果實對霜疫霉侵染抗性評價體系，研究不同濃度孢子囊懸浮液浸染、不同癥狀調查時間對不同荔枝品種病情指數的影響，并用建立的方法研究部分荔枝品種對霜疫霉侵染抗性的初步評價。結果表明：以4×104個/mL孢子囊濃度懸浮液為接種濃度，‘妃子笑和‘大丁香離體果實病征發(fā)生速度適中，侵染第72小時的病情指數比較穩(wěn)定，能夠更好地區(qū)分品種間的抗病性差異。2012～2016年，用該指標體系先后評價了15個荔枝品種對霜疫霉侵染的抗性，結果發(fā)現(xiàn)不同年份這些品種的抗性分級基本相同，‘黑葉和‘桂味是表現(xiàn)最為穩(wěn)定的抗病和感病品種，證實了建立的抗性評價體系的穩(wěn)定性。

關鍵詞 荔枝；荔枝霜疫霉菌；抗性；評價體系

中圖分類號 S436.671 文獻標識碼 A

Establishment and Preliminary Application of the Resistance

Evaluation System of Litchi Fruit to Downy Blight

CAO Lulu1，2， SUN Jinhua2， WANG Jiabao2 *

1 College of Environmental and Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract In order to establish a stable resistance evaluation system of litchi fruit to downy blight， the influence on disease index（DI）of concentration of inoculation sporangia and time of record for symptom were studied among different litchi germplasms. The results showed that the disease symptom of‘Feizixiaoand‘Dadingxianginoculated with 4×104/mL sporangia occurred at moderate speed， and the disease index of 72 h was relatively stable， which was a proper time of symptom survey for resistance to downy blight of litchi. During 2012-2016， the system was applied to evaluate the resistance to downy blight among 15 litchi cultivars. The resistance grades of these cultivars were almost the same in different years， and‘Heiyeand‘Guiweiwas the most stable resistant and susceptible cultivars， respectively. These confirmed that the resistance evaluation system of litchi fruit to downy blight was stable.

Key words litchi； Phytophthora litchii； resistance； evaluation system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.022

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原產于中國南部和越南北部，是中國熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的特色水果[1]。荔枝霜疫霉?。↙itchi downy blight）是荔枝的主要病害之一，由荔枝霜疫霉菌（Phytophthora litchii）引起，主要危害果實，從而造成果實腐爛，也危害葉片和花，引起落葉和落花，導致減產30%～80%，且影響果實質量[2-9]。培育抗病品種是解決霜疫霉危害的根本途徑。建立準確的抗病性鑒定方法可為獲得抗性材料和后續(xù)抗性育種提供基礎。已有學者建立了柑橘、芒果、蘋果、梨、辣椒、大豆等作物的抗病鑒定方法[10-17]，也對荔枝霜疫霉病抗性鑒定方法進行了一些探索[18-20]，但還未形成統(tǒng)一的評價體系。鑒于此，本研究以多個荔枝品種離體成熟果實為試材，研究接種霜疫霉孢子囊濃度、病征記錄時間對其抗病分級指標的影響，以期建立穩(wěn)定的抗病性鑒定體系，為荔枝抗性評價及抗病育種提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 荔枝材料 2012～2016年，先后采摘17個荔枝品種（表1）約八成熟果實，采后2 h內運回實驗室，挑選成熟度相對一致、大小基本均一、無病蟲害和機械損傷的果實，用自來水沖洗干凈，再用無菌去離子水沖洗2遍，自然晾干（約10 min左右）后立即用于接種處理。

1.1.2 霜疫霉菌株 霜疫霉菌株由本實驗室從海南永發(fā)三月紅荔枝果實上分離并保存。于侵染前3周接種至V8固體培養(yǎng)基，28 ℃條件下進行培養(yǎng)。實驗前用無菌水浸泡培養(yǎng)皿中的菌絲體，并用小毛刷輕輕刷動以收集霜疫霉菌孢子囊，再用無菌紗布過濾殘存的菌絲體。濾液用光學顯微鏡檢測計算孢子囊濃度，按照實驗目的配制4×105、4×106、4×107個/mL孢子囊懸浮液，接種時分別稀釋100倍。

1.2 方法

1.2.1 果實接種方法 將自然晾干的果實置于稀釋好的孢子囊懸浮液中，浸泡5 min后取出，放在底部鋪有雙層吸水紙的保鮮盒中，噴無菌水至吸水紙潤濕，以保持空氣濕度。果實單層擺放，相互之間無擠靠。用塑料蓋蓋緊，于28 ℃放置。每次處理60個果，以每20個果作為1次重復。

1.2.2 發(fā)病過程調查 剛接種時以第0小時為準，以后每24 h觀察記錄1次果實的病情級別（以果實病斑面積占果實總面積的比例表示，表2），直至大部分果實發(fā)病為止。

1.2.3 病情指數和抗病性分級 按下式計算病情指數

式中：DI為病情指數，s為各病情級別，n為相應病情級別果數，N為調查總果數，S為最高病情級別代表值室內病情分級及其對應的癥狀描述。

依據荔枝霜疫霉病的病情指數將荔枝材料的抗病性分為6 級，抗病性評價標準[21]詳見表3。

1.2.4 實驗過程 2012年，先用‘妃子笑與‘大丁香果實，按照上述方法進行抗性評價，優(yōu)化確定了處理方法、調查時間、分級閾值等。2012～2016年，分批次評價了其余15個品種的抗性。

1.3 數據分析

本試驗所有數據統(tǒng)計分析均采用計算機軟件Excel和DPS數據處理系統(tǒng)[22]進行Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 接種孢子囊濃度的確定

由表4可知，3種孢子囊濃度霜疫霉懸浮液接種‘大丁香和‘妃子笑后，培養(yǎng)24 h時2個品種果實無明顯癥狀，48 h之后出現(xiàn)癥狀。4×103個/mL孢子囊懸浮液接種‘大丁香在96 h時病情指數才和對照有顯著差異（p<0.05），接種‘妃子笑72 h后才表現(xiàn)出顯著差異（p<0.05），2個材料的時間不一致，此孢子囊濃度不適合作為抗病性的評價。48 h后一直和對照組表現(xiàn)顯著差異（p<0.05）的是4×104個/mL和4×105個/mL兩個濃度接種的組合；由于用4×105個/mL孢子囊懸浮液接種，病情發(fā)展過于迅速，不利于大量荔枝材料抗病性的評價；而以4×104個/mL孢子囊懸浮液接種，病情發(fā)展比較穩(wěn)定，且和對照組的病情指數呈顯著差異（p<0.05），因此，選用4×104個/mL作為接種的孢子囊懸浮液濃度。

2.2 調查時間的確定

以4×104個/mL孢子囊懸浮液接種的2個荔枝材料在24 h未出現(xiàn)明顯癥狀，不適合進行抗性評價；在48 h出現(xiàn)了明顯的癥狀，但病斑直徑比較小，病征表現(xiàn)變異系數很大，‘大丁香和‘妃子笑的分別是30.47和32.12，不適合進行抗性評價；在72 h出現(xiàn)明顯癥狀，2個品種各自的癥狀表現(xiàn)比較穩(wěn)定，變異系數較小，‘大丁香和‘妃子笑的分別是18.02 和3.62，且2個材料表現(xiàn)出很大的差異，適合進行抗病性的評價；在96 h 病斑直徑較大，病情指數均達到90以上，不適合進行抗病性的評價（表4）。綜上所述，選4×104個/mL為接種的孢子囊濃度，72 h為接種調查病情指數的時間，以此為荔枝果實對霜疫霉侵染抗性評價體系的最適接種濃度和最佳調查時間。

2.3 部分荔枝品種果實對霜疫霉病抗性的比較

2012～2016年，應用建立的上述評價方法，先后評價了15個荔枝品種對霜疫霉病的抗性，其中，2012～2014年分別評價了15個、7個和13個，2015～2016年對‘黑葉和‘桂味進行了評價（表5和圖1）。各品種中，病情指數最低的為21.30（‘四季荔，2012年），最高的為96.30（‘廣西勾背，2014年），呈現(xiàn)連續(xù)分布趨勢。多數品種不同年份之間病情指數較為穩(wěn)定，如‘四季荔、‘黑葉、‘尚書懷、‘桂味、‘紅荔、‘水晶球、‘廣西勾背和‘雪懷子。有些品種在不同年份病情級別波動較大，但對抗病/感病的分類總體保持不變，如‘尖葉荔2012年病情指數為73.33，分類為感病，但2014年病情指數升高為93.33，分類為高感，盡管指數變化較大，但同屬感病類型。總體上，15個品種表現(xiàn)為抗病的有‘四季荔、‘黑葉和‘尚書懷，感病的有‘掛綠、‘綠荷包、‘桂味、‘懷枝、‘紅荔、‘白粉、‘水晶球、‘尖葉荔、‘紅繡球、‘廣西勾背、‘麻雀春和‘雪懷子。

2012年的數據結果表明，中抗與高感、感病荔枝品種的病情指數差異顯著，其他抗性等級之間病情指數差異不顯著，或者只有部分差異顯著。2013年數據結果表明，中抗與高感、感和中感品種的病情指數差異顯著，中感與高感品種的病情指數差異顯著，其他抗性等級之間部分差異顯著。2014年，感與高感品種病情指數部分差異顯著，其他抗性等級之間均差異顯著。由于病情指數和抗性等級呈連續(xù)分布，所以不同的等級之間也有差異不顯著，但在不相鄰抗性等級之間荔枝資源的抗性基本都是差異顯著。因此，荔枝的抗性如果在相鄰抗性等級之間變化，則認為該品種抗性穩(wěn)定；在不相連抗性等級之間變化的，則認為該品種抗性不穩(wěn)定。

由圖1可知，2012～2016年間評價了不同地區(qū)分布的主栽荔枝品種‘黑葉和‘桂味對霜疫霉侵染的抗性，‘黑葉和‘桂味的抗性表現(xiàn)都很穩(wěn)定：‘黑葉為抗病品種，具體表現(xiàn)為中抗；‘桂味為感病品種，具體表現(xiàn)為中感。

3 討論

對于建立抗病性鑒定體系，確定孢子囊濃度和接種后調查時間至關重要，但關于荔枝抗病性鑒定體系還未見系統(tǒng)的研究。本研究從‘大丁香和‘妃子笑接種荔枝霜疫霉的結果來分析，荔枝對霜疫霉病抗性評價體系的最適宜接種濃度4×104個/mL，最佳觀察時間為72 h。朱若鑫[19]和余中蓮[23]觀察荔枝的抗病性接種用的孢子囊濃度是1×104個/mL，這與本實驗的結果差異不明顯。陶挺燕[20]利用4×105個/mL的孢子囊懸浮液，噴霧接種至刺傷荔枝葉片上，這與本實驗所用孢子囊的濃度差異很大，可能是針對不同的接種方法和接種材料的原因。

本研究利用該體系對2012～2016年的荔枝材料進行了抗性評價，通過對2012～2014年各年的荔枝資源抗性評價之間的差異性分析，中抗與高感、感之間均屬差異顯著，由于病情指數和抗性等級呈連續(xù)分布，所以會出現(xiàn)相鄰等級之間的品種差異不顯著的情況。但不相連等級間的差異大部分是顯著的。因此，荔枝品種在相鄰等級之間抗性變化可認為抗性穩(wěn)定。3 a間，荔枝資源的抗性基本穩(wěn)定，也證實了該體系的可靠性。

通過對2012～2014年相同品種的抗病性進行比較，結果發(fā)現(xiàn)多個品種的抗病性表現(xiàn)比較穩(wěn)定，但病情指數都有浮動，部分抗性等級有變化。由于病情指數和抗性程度呈連續(xù)分布，如果某一材料的病情指數接近抗性級別的上限或下限，有可能在年度間的重復鑒定中因病害發(fā)生程度的小波動而使抗性評價結果出現(xiàn)不一致[24]，但這種變化的幅度可能基本局限在一定的范圍內，如高感和感病級別的材料都在感病范圍內變化，說明感病種質的抗性具有相對的穩(wěn)定性[20]。 所以建立這一套體系是非常科學可靠的。其中‘綠荷包和‘掛綠的抗病性鑒定的不穩(wěn)定因素是2012年的果實成熟度不一致，單果間的發(fā)病情況不一致。由于荔枝對荔枝霜疫霉菌的抗性易受環(huán)境條件的影響：如打藥的頻率、施肥量的變化、降雨量的多少和采摘的時機等，這些因素的變化都會影響荔枝材料的抗性評價級別，因此，對初步鑒定為抗病的材料應進行重復鑒定，才能得出正確的結果[20]。

通過對荔枝主栽品種‘黑葉和‘桂味5 a間的抗病性鑒定結果來看，不同地區(qū)來源的2個品種利用該體系進行抗性評價結果表現(xiàn)一致：‘黑葉為抗病品種，‘桂味為感病品種。并且各個品種每年的病情指數均差異不顯著，證實了該體系的可靠性和穩(wěn)定性。這可為研究荔枝的抗病性機制提供基礎。

參考文獻

[1] Vien N V， Benyon F H L， Trung H M， et al. First record of Peronophythora litchii on litchi fruit in Vietnam[J]. Australasian Plant Pathology， 2001， 30（2）： 287-288，

[2] 劉秀娟， 胡美嬌. 荔枝果實采后病害和防腐保鮮技術[J]. 熱帶農業(yè)科學， 2000， 20（1）： 67-73.

[3] Wang H C， Zhou M G. Baseline and differential sensitivity of Peronophythora litchii （lychee downy blight） to three carboxylic acid amide fungicides[J]. Plant Pathology， 2009， 58（3）： 571-572.

[4] 戚佩坤. 廣東果樹真菌病害志[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社， 2000： 41-42.

[5] 戚佩坤， 潘雪萍， 劉 任. 荔枝霜疫病的研究病原菌的鑒定及其侵染過程[J]. 植物病理學報， 1984， 14（2）： 113-119.

[6] 賴傳雅. 農業(yè)植物病理學： 華南本[M]. 北京： 科學出版社， 2003： 211-213.

[7] Liu J， Liu A， Chen W. Studies on the biological characteristics of lychee downy blight[J]. Acta Hortic， 2005， 665（52）： 415-420.

[8] Kao C W， Leu L S. Sporangium germination of Peronophythora litchii， the causal of litchi downy blight[J]. Mycologia， 1980， 72（4）： 737-748.

[9] 陳厚彬， 莊麗娟， 黃旭明， 等. 荔枝龍眼產業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與前景[J]. 中國熱帶農業(yè)， 2013， 10（2）： 12-18.

[10] 劉登全， 崔朝宇， 蔣軍喜， 等. 不同柑橘品種對黃龍病的抗性鑒定[J]. 江西農業(yè)大學學報， 2014， 36（1）： 97-101.

[11] Abe K， Kotoda N， Kato H， et al. Resistance sources to Valsa canker （Valsa ceratosperma） in a germplasm collection of diverse Malus species[J]. Plant Breeding， 2007， 126（3）： 449-453.

[12] Liu H T， Zhang Y J， Li C M， et al. Evaluation of the resistance of malus germplasm to bot canker caused by botryosphaeria dothidea[J]. Journal of Phytopathology， 2011， 159（7-8）： 511-515.

[13] 劉欣穎， 呂 松， 王 憶， 等. 蘋果種質資源對蘋果樹腐爛病抗性評價[J]. 果樹學報， 2011， 28（5）： 843-848.

[14] 張美鑫， 霍立峰， 胡紅菊， 等. 梨種質資源對腐爛病抗性的室內評價[J]. 園藝學報， 2014， 41（7）： 1 297-1 306.

[15] 楊明英， 曹繼芬， 李向東， 等. 辣椒苗期不同生長階段對疫霉根腐病的抗性研究[J]. 西南農業(yè)學報， 2011， 28（1）： 155-158.

[16] 劉 羽， 劉增亮， 高愛平， 等. 芒果種質對炭疽病的抗病性評價[J]. 熱帶作物學報， 2009， 30（7）： 1 000-1 004.

[17] 李永剛， 文景芝， 郝中娜， 等. 大豆疫霉根腐病抗病性鑒定方法及抗源篩選的研究[J]. 東北農業(yè)大學學報， 2008， 39（5）： 1-5.

[18] 范鴻雁， 王祥和， 王家保， 等. 六個荔枝品種對荔枝蝽抗性的初步鑒定[J]. 中國南方果樹， 2011， 40（1）： 42-44.

[19] 朱若鑫. 福建主栽荔枝品種的果實對霜疫霉的抗病性及機理初探[D]. 福州： 福建農林大學， 2011.

[20] 陶挺燕. 海南荔枝種質資源對荔枝霜疫霉病抗性鑒定及霜疫霉病防治藥效篩選[D]. ?？冢?海南大學， 2010.

[21] 陳業(yè)淵， 賀軍虎. 熱帶、南亞熱帶果樹種質資源數據質量控制規(guī)范[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社， 2006： 102-103.

[22] 唐啟義. DPS數據處理系統(tǒng)[M]. 北京： 科學出版社， 2010.

[23] 余中蓮. 氨基寡糖素誘導荔枝抗荔枝霜疫霉病的抗性[D]. 福州： 福建農林大學， 2011.

[24] 黃天述， 葉華智， 王曉鳴， 等. 玉米種質資源對紋枯病的抗性鑒定與評價[J]. 植物遺傳資源學報， 2005， 6（3）： 291-295.