蔣奕+葉新青++廖曉明++姬逸男+唐瑋++葉洪濤

[摘要] 目的 探討乳腺癌拓撲異構(gòu)酶ⅡA（TOP2A）基因表達與含蒽環(huán)類藥物新輔助化療療效的關(guān)系。 方法 收集廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科2010年2月～2014年3月收治的91例乳腺癌患者新輔助化療粗針穿刺的病理標本，采用熒光原位雜交（FISH）法檢測癌組織中TOP2A與HER2基因表達，采用免疫組織化學法（IHC）檢測ER、HER2和TOPOⅡα蛋白的表達，并觀察應用含蒽環(huán)類藥物新輔助化療后病理情況。 結(jié)果 TOP2A基因表達與HER2基因及TOPOⅡα蛋白表達相關(guān)（P < 0.05），而與ER、HER2蛋白表達無關(guān)（P > 0.05）。經(jīng)新輔助化療后TOP2A基因擴增的患者獲得的pCR率（50.0%）優(yōu)于未擴增者（5.5%）（P < 0.05）。 結(jié)論 乳腺癌TOP2A基因表達與HER2基因及TOPOⅡα蛋白相關(guān)，而與ER、HER2蛋白表達量無關(guān)。TOP2A基因擴增程度可能為評估含蒽環(huán)類藥物新輔助化療療效的預測因子。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；新輔助化療；拓撲異構(gòu)酶ⅡA；HER2

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（b）-0016-04

Relationship between expression of TOP2A in breast cancer and anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy

JIANG Yi1 YE Xinqing2 LIAO Xiaoming1 JI Yi′nan1 TANG Wei1 YE Hongtao3▲

1.Department of Breast Surgery， Tumor Hospital Affiliated to Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China； 2.Department of Pathology， Tumor Hospital Affiliated to Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China； 3.Department of Histopathology， Royal National Orthopaedic Hospital， HA7 4LP， UK

[Abstract] Objective To evaluate the relationship between the expression of TOP2A and efficacy of anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Methods 91 patients with breast cancer who were treated in Department of Breast Surgery， Tumor Hospital Affiliated to Guangxi Medical University from February 2010 to March 2014 were surveied； a core needle biopsy was used to collect samples before and after neoadjuvant chemotherapy， fluorescence in situ hybridization （FISH） was performed to assess expression of TOP2A and HER2 gene， an immunohistochemistry （IHC） was then employed to check the changes of protein expression levels of ER， HER2 and TOPOⅡα. The pathological was observed after neoadjuvant chemotherapy with anthracyclines. Results TOP2A gene expression had relevant with HER2 gene and TOPO Ⅱ alpha protein expression （P < 0.05）， and had nothing to do with ER， HER2 protein expression （P > 0.05）. Patients with TOP2A gene amplification had a high rate of pCR （50.0%） than in patients with failure TOP2A gene amplification （5.5%）. Conclusion TOP2A gene expression in breast cancer has relevant with HER2 gene and TOPO Ⅱ alpha protein expression， and has nothing to do with ER and HER2 protein status. TOP2A gene amplification can be the predictive factor for anthracycline-based chemotherapy.

[Key words] Breast cancer； Neoadjuvant chemotherapy； TOP2A； HER2

蒽環(huán)類藥物被認為是目前最有效的乳腺癌化療藥物之一，也是新輔助化療（neoadjuvant chemothera？鄄py，NAC）的常用藥物，但并非所有患者均能從中獲益[1-3]，因而尋找可預測蒽環(huán)類NAC療效的標志物符合個體化治療的迫切需要。DNA拓撲異構(gòu)酶ⅡA基因（TOP2A）位于第17號染色體，其編碼的拓撲異構(gòu)酶蛋白（TOPOⅡα）被認為是蒽環(huán)類藥物作用靶點之一[4]，其表達水平與乳腺癌的預后密切相關(guān)[5]。ER及HER2是目前臨床上評估乳腺癌預后及指導治療的常用指標[6]，研究證實對NAC的療效有預測作用[7-9]，但存在一定的局限性，增加生物診斷參數(shù)對評估患者預后和指導治療是必要的。本研究分析91例乳腺癌組織中TOP2A、HER2基因及ER、HER2、TOPOⅡα蛋白的表達，及應用蒽環(huán)類藥物NAC方案后的療效，旨在探討TOP2A與其他預后因子的關(guān)系，及其與含蒽環(huán)類NAC方案療效的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科2010年2月～2014年3月收治的91例乳腺癌患者標本，年齡28～69歲，平均（45.7±2.1）歲，根據(jù)TNM分期，Ⅱ期患者51例，Ⅲ期40例，除1例炎性乳癌患者外，所有患者具有可測量病灶，直徑范圍為1.5～13.3 cm，平均（3.6±1.5）cm。

1.2 治療及檢測方法

所有患者均采用含蒽環(huán)類藥物的FEC方案NAC 4個周期。具體為：環(huán)磷酰胺（500 mg/m2，百特，批號6C103A）、表柔比星（100 mg/m2，輝瑞，批號L43197）、氟尿嘧啶（500 mg/m2，旭東海普，批號FA160308），21 d為1個周期，共4個周期。收集患者NAC前粗針穿刺活檢標本及NAC后手術(shù)切除標本的石蠟包埋切片。以上試驗均經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，治療過程及標本去向均告知患者并簽署知情同意書。所有標本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟，其余步驟參見文獻[10]，免疫組化染色采用Elivision方法染色，ER（克隆號SP1）和HER2（克隆號SP3）抗體購自邁新公司，TOPOⅡα抗體（克隆號3F6）購自中杉金橋公司。熒光原位雜交（FISH）法檢測所用HER2探針、TOP2A探針、HER2和TOP2A購自極地基因有限公司。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀

判讀方法：每張切片在低倍鏡（40×）下觀察并確定有代表性的染色陽性視野，選擇5個視野，在高倍鏡（400×）下觀察，計算100個腫瘤細胞中的陽性細胞數(shù)，計算百分比率。陽性判定標準：HER2蛋白位于細胞膜，結(jié)果采用乳腺癌HER2檢測指南（2014版）[11]判讀。ER、TOPOⅡα蛋白為定位于細胞核的棕黃色顆粒，<10%的癌細胞核著色為陰性（-），≥10%為陽性。

1.4 FISH結(jié)果判定

計數(shù)30個癌細胞核中的HER2（綠色）、TOP2A（紅色）及17號染色體（藍色）的熒光信號數(shù)，統(tǒng)計比例（30個癌細胞核中綠色或紅色信號數(shù)/30個癌細胞核中藍色信號數(shù)）。當熒光信號連接成簇時，可不用計算直接視為基因擴增。HER2基因結(jié)果判讀：HER2/CEP17<2且平均HER2<4信號因子/細胞為無擴增；HER2/CEP17≥2或者平均HER2≥6信號因子/細胞為擴增；若HER2/CEP17<2且4信號因子/細胞≤平均HER2<6信號因子/細胞，則增加計數(shù)細胞至100個或重新計數(shù)。TOP2A基因結(jié)果判讀：TOP2A /CEP17<0.8為無擴增，比值>2.0為擴增，介于0.8～2.0時，增加計數(shù)細胞至100個或重做FISH實驗，重復計數(shù)后仍介于0.8～2.0則判為無擴增。以上判讀均由兩位病理診斷醫(yī)生在不知病例資料和診斷結(jié)果條件下進行。

1.5 療效評估

NAC后病理完全緩解（pathologic complete remission，pCR）定義為術(shù)后乳腺原發(fā)灶無浸潤性癌且區(qū)域淋巴結(jié)陰性。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，基因和蛋白表達及其與NAC療效的計數(shù)資料均采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A與HER2基因表達相關(guān)性

91例標本中，TOP2A擴增比例為19.8%（18/91），HER2擴增比例為28.6%（26/91）；HER2擴增患者中TOP2A擴增比例為57.7%（15/26），HER2無擴增患者中TOP2A擴增比例為4.6%（3/65），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），見表1。圖1為TOP2A與HER2的FISH檢測圖像（封三）。

2.2 TOP2A基因擴增與預后相關(guān)蛋白表達的相關(guān)性

91例組織中ER蛋白陽性者62例，其TOP2A擴增率為16.1%（10/62）；ER蛋白陰性者29例，其TOP2A擴增率為27.6%（8/29），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.263）。HER2蛋白陽性者30例，其TOP2A擴增率為30.0%（9/30）；HER2蛋白陰性者61例，其TOP2A擴增率為14.8%（9/61），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.108）。TOPOⅡα蛋白陽性者34例，其TOP2A擴增率為35.3%（12/34）；TOPOⅡα蛋白陰性者57例，其TOP2A擴增率為10.5%（6/57），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。見表2。

2.3 TOP2A基因擴增與NAC療效相關(guān)性

91例患者接受NAC后，13例（14.3%）患者達到pCR。TOP2A基因擴增患者達pCR為50.0%（9/18），而無擴增者達pCR為5.5%（4/73），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008）。

3 討論

NAC的療效評估可以獲知患者對化療藥物的敏感性，為后續(xù)治療提供重要參考，然而在臨床中部分患者的療效并不理想，治療期間甚至會出現(xiàn)疾病進展。在NAC前獲知患者對化療藥物的敏感性以指導用藥至關(guān)重要，現(xiàn)尚無確切有效的預測因子，因此探尋NAC的預測因子具有重要意義。

TOP2A基因編碼的TOPOⅡα蛋白是蒽環(huán)類藥物的重要靶點之一。Arriola等[12]通過多因素分析發(fā)現(xiàn)，TOP2A可作為一個獨立的乳腺癌患者預后預測因子，此外還發(fā)現(xiàn)TOP2A擴增與HER2擴增具有明顯相關(guān)性，共擴增的患者具有更高的總生存率（OS）與無病生存率（DFS）。本研究亦發(fā)現(xiàn)，TOP2A擴增乳腺癌組織中HER2擴增的幾率高，與Fasching等[13-14]的研究結(jié)果一致；而HER2及ER蛋白的表達則與TOP2A擴增水平未見明顯相關(guān)性，與Mitrovi■的報道相符[15]。本研究還顯示，TOP2A擴增患者的TOPOⅡα表達量更高。而Romero等[16]研究表明，TOP2A基因擴增與否與TOPOⅡα的表達無明顯相關(guān)性（P > 0.05），與本研究結(jié)果相反，可能是TOPOⅡα在轉(zhuǎn)錄后和翻譯過程中受多因素調(diào)控，且依賴細胞增殖信號，可能表現(xiàn)為TOP2A不擴增，蛋白質(zhì)過表達等。以上研究提示，TOP2A的擴增水平與患者預后因子HER2基因的擴增密切相關(guān)，可能是潛在的預后評估因子。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A的表達水平與乳腺癌化療療效相關(guān)。O`Malley等[17]研究表明，接受蒽環(huán)類藥物化療的患者中僅有TOP2A擴增的患者可得到OS與DFS的提高。Tanner等[18]研究發(fā)現(xiàn)，接受劑量密集的FEC方案的患者中，HER2及TOP2A共擴增組獲得較好的DFS。此外，TOP2A還被發(fā)現(xiàn)在預測乳腺癌患者NAC療效中具有重要價值。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A擴增的患者接受NAC后較之未擴增患者能達到更高的pCR率（56.3%比13.8%，P=0.001）。而Moretti等[20]則發(fā)現(xiàn)，TOP2A編碼的TOPOⅡα亦可作為預測NAC療效的獨立影響因子；Klintman等[21]提出，TOP2A對NAC療效的影響與ER，PgR及HER2的表達并無相關(guān)性。本研究則發(fā)現(xiàn)，接受NAC的91例患者中，13例患者達到pCR（14.3%），其中TOP2A基因擴增患者pCR率顯著高于無擴增患者，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。結(jié)合以上研究說明TOP2A在預測乳腺癌NAC療效中的重要價值，可能成為指導乳腺癌患者綜合治療的重要因子。

綜上所述，乳腺癌TOP2A基因擴增與HER2擴增水平相關(guān)，可能是潛在的預后評估因子；且還可能為含蒽環(huán)類藥物NAC療效的預測因子，為指導乳腺癌的個體化精準治療、提高化療效果提供重要的理論依據(jù)，為判斷乳腺癌的預后提供重要的參考價值。

[參考文獻]

[1] Systemic treatment of early breast cancer by hormonal， cytotoxic， or immune therapy. 133 randomised trials involving 31，000 recurrences and 24，000 deaths among 75，000 women. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group[J]. Lancet，1992，339（8785）：71-85.

[2] Ross MB，Buzdar AU，Smith TL，et al. Improved survival of patients with metastatic breast cancer receiving combination chemotherapy [J]. Cancer，1985，55（2）：341-346.

[3] Tomiak E，Piccart M，Mignolet F，et al. Characterisation of complete responders to combination chemotherapy for advanced breast cancer：aretrospeceive EORTC breast cancer group study [J]. Eur J Cancer，1996，32A（11）：1876-1887.

[4] 楊燕華，王樹森.乳腺癌中TOP2A與蒽環(huán)類藥物關(guān)系的研究進展[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2014，21（8）：1029-1033.

[5] Biesaga B，Niemiec J，Ziobro M. BCL-2，topoisomerase IIα，microvessel density and prognosis of early advanced breast cancer patients after adjuvant anthracycline-based chemotherapy [J]. J Cancer Res ClinOncol，2014，140（12）：2009-2019.

[6] Brunelli M，Manfrin E，Bria E，et al. HER2/neu gene determination in women screened for breast carcinoma：how screening program s reduce the skyrocketing cost of targeted therapy [J]. Anticancer Res，2013，33（9）：3705-3710.

[7] 陳麗榮.乳腺癌新輔助化療的臨床意義和病理學評價[J].中華病理學雜志，2010，39（4）：218-221.

[8] 雷蕾，王曉稼，楊紅健，等.乳腺癌分子分型在新輔助化療療效和預后中的預測作用[J].中國腫瘤，2012，21（11）：868-873.

[9] Pedrini JL，F(xiàn)ranealacei SR，Casales SM，et al. The effect of neoadjuvant chemotherapy on hormone receptor status，HER2/neu and prolactin in breast cancer [J]. Tumori，2011， 97（6）：704-710.

[10] 王桂秋，周英瓊，宮麗平，等.用熒光原位雜交在石蠟切片上檢測t（11；18）和涉及bcl-10基因染色體易位的方法[J].中華病理學雜志，2007，36（7）：494-495.

[11] 《乳腺癌HER2檢測指南（2014版）》編寫組.乳腺癌HER2檢測指南（2014版）[J].中華病理學雜志，2014， 43（4）：262-267.

[12] Arriola E，Marchio C，Tan DS，et al. Genomic analysis of the HER2/TOP2A amplicon in breast cancer and breast cancer cell lines [J]. Lab Invest，2008，88（5）：491-503.

[13] Fasching PA，Weihbrecht S，Haeberle L，et al. HER2 and TOP2A amplification in a hospital-based cohort of breast cancer patients：associations with patient and tumor char？鄄acteristics [J]. Breast Cancer Res Treat，2014，145（1）：193-203.

[14] Knoop AS，Knudsen H，Balslev E，et al. Retrospective analysis of topoisomeraseⅡa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide，methotrexate，and fluorouracil or cyclophosphamide，epirubicin，and fluorouracil：Danish Breast Cancer Cooperative Group [J]. J Clin Oncol，2005，23（30）：7483-7490.

[15] Mitrovi■ O，■oki■ V，■iki■ D，et al， Correlation between ER，PR，HER-2，Bcl-2， p53，proliferative and apoptotic indexes with HER-2 gene amplification and TOP2A gene amplification and deletion in four molecular subtypes of breast cancer [J]. Target Oncol，2014，9（4）：367-379.

[16] Romero A，Martín M，Cheang MC，et al. Assessment of Topoisomerase Ⅱ α status in breast cancer by quantitative PCR，gene expression microarrays，immunohistochemistry，and fluorescence in situ hybridization [J]. Am J Pathol，2011，178（4）：1453-1460.

[17] O′Malley FP，Chia S，Tu D，et al. Topoisomerase Ⅱ alpha and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy [J]. J Natl Cancer Inst，2009，101（9）：644-650.

[18] Tanner M，J？覿rvinen P，Isola J. Amplification of HER-2/neu and topoisomerase Ⅱalpha in primary and metastatic breast cancer [J]. Cancer Res，2001，61（14）：5345-5348.

[19] Wang J，Xu B，Yuan P，et al. TOP2A amplification in breast cancer is a predictive marker of anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy efficacy [J]. Breast Cancer Res Treat，2012，135（2）：531-537.

[20] Moretti E，Desmedt C，Biagioni C，et al. TOP2A protein by quantitative immunofluorescence as a predictor of response to epirubicin in the neoadjuvant treatment of breast cancer [J]. Future Oncol，2013，9（10）：1477-1487.

[21] Klintman M，Buus R，Cheang MC，et al. Changes in Expression of Genes Representing Key Biologic Processes after Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer，and Prognostic Implications in Residual Disease [J]. Clin Cancer Res，2016，22（10）：2405-2416.

（收稿日期：2016-09-04 本文編輯：王紅雙）