王欣麗++陳亮

[摘要] 目的 探討亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T基因多態(tài)性與老年冠心病心衰的關系。 方法 選擇2014年10月～2015年11月在濰坊市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）保健科、心內科住院診斷為冠心病心衰的患者66例作為心衰組，45例住院診斷為冠心病穩(wěn)定型心絞痛患者作為冠心病組，同時選擇我院同期健康體檢者40名作為健康組。所有入選對象利用直接基因測序方法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性，并采用高效液相色譜法測定血漿同型半胱氨酸水平。 結果 心衰組TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于冠心病組和健康組，冠心病組高于健康組（P < 0.05）；與CC型比較，CT型及TT型者患心衰的風險增加（P < 0.05）。 結論 MTHFR C677T C→T突變后，TT基因型及T等位基因可能是冠心病心衰發(fā)病的危險因素。

[關鍵詞] MTHFR C677T基因多態(tài)性；老年；冠心?。恍牧λソ?/p>

[中圖分類號] R541.61 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（b）-0012-05

Study on association between MTHFR C677T gene polymorphism and coronary heart diseases complicated with heart failure in the elderly patients

WANG Xinli1 CHEN Liang2

1.Clinical Medical College， Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261041， China； 2.Health Center， Weifang Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital， Shandong Province， Weifang 261041， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between MTHFR C677T gene polymorphism and heart failure in the elderly patients. Methods Sixty-six patients diagnosed as coronary heart diseases （CHD） complicated with heart failure hospitalized in Department of Health and Department of Cardiology of Weifang People's Hospital （“our hospital” for short） from October 2014 to November 2015 to were selected as heart failure group， 45 cases diagnosed as stable angina pectoris of CHD were selected as CHD group， and 40 healthy persons with physical examination in our hospital at the same time were selected as healthy group. MTHFR C677T polymorphism was detected by PCR-direct sequencing method. Plasma total homocysteine was measured using high-performance liquid chromatography （HPLC） with fluorescence detection. Results The frequencies of genotype TT and allele T of C677T of MTHFR gene in the heart failure group were significantly higher than those of CHD group and healthy group， which of CHD group were higher than those of healthy group （P < 0.05）. Compared with homozygote CC， homozygote TT and heterozygote CT increased the risk of heart failure in the elderly patients （P < 0.05）. Conclusion After mutation of MTHFR C677T C→T， genotype TT and allele T may be the risk factors of CHD complicated with heart failure.

[Key words] MTHFR C677T gene polymorphism； Elderly； Coronary heart diseases； Heart failure

心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段，是心功能不全的一組病理生理綜合征。隨著老齡化社會程度的加重，我國心力衰竭的發(fā)病率和患病率逐年上升，醫(yī)療支出比重大。臨床和流行病學資料[1-2]證實同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、冠狀動脈病變、高血壓病以及外周血管病變等發(fā)病的獨立危險因子，MTHFR C677T基因多態(tài)性與血漿Hcy水平有關。賈如意等[3]研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者中血漿Hcy水平增加，而MTHFR C677T C→T突變后，造成高同型半胱氨酸血癥。推測MTHFR C677T T等位基因的頻率可能是一種新的導致心力衰竭的危險因素。目前關于MTHFR C677T基因多態(tài)性與心力衰竭的研究尚少。本研究探討老年心力衰竭患者MTHFR C677T基因多態(tài)性分布及與冠心病心衰的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年10月～2015年11月濰坊市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）保健科、心內科診斷為冠心病心衰的住院患者66例作為心衰組，45例冠心病無心衰的穩(wěn)定型心絞痛患者作為冠心病組，選擇我院同期40名健康體檢老年人作為健康組。所有冠心病患者既往或住院期間行冠狀動脈造影確診為冠心病，并符合冠心病最新指南標準[4]。心力衰竭診斷標準按照Framingham標準[5]。排除標準：近4周之內患急性心肌梗死的患者；不穩(wěn)定型心絞痛患者；心包疾病、心肌病及心肌炎、風濕性瓣膜病、先天性心臟病，以及高血壓病、肺心病等引起的心力衰竭；嚴重惡性心律失常；嚴重肝、腎功能不全，血液、免疫、甲狀腺疾病，嚴重感染及腫瘤等疾??；所有觀察對象均自愿參加，均知情并簽署同意書。本研究方案經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會專家討論通過。

1.2 資料收集

收集研究對象的基本信息，包括年齡、性別、身高、體重、吸煙史和高血壓病史等。

1.3 標本處理

1.3.1 生化指標檢測 所有觀察者空腹抽取外周靜脈血10 mL，5 mL用于測定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、空腹血糖（FBG）等。余5 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的試管中，采用高效液相色譜分析法檢測Hcy。

1.3.2 DNA提取前準備 抽取5 mL外周靜脈血置于EDTA抗凝劑的試管中，于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。

1.4 MTHFR基因C677T多態(tài)性的測定

1.4.1 DNA提取 取所有觀察者的冷凍EDTA抗凝外周血，于37℃水浴迅速融化，采用全血基因組DNA快速提取試劑盒（天根生物）提取基因組DNA。

1.4.2 PCR基因擴增 根據(jù)MTHFR基因序列，設計擴增引物為：上游引物F：TGCCCAGTCCCTGTGGTCTCT，下游引物R：GCCTTCACAAAGCGGAAGAAT，由北京尤比愛生工合成。從大連寶生物公司購買熱啟動DNA聚合酶。擴增條件：94℃解鏈5 min×1個循環(huán)；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s 35個循環(huán)；72℃延伸5 min 1個循環(huán)。

1.4.3 基因測序 將PCR產物各取30 μL送尤比愛生物工程（北京）股份有限公司進行基因測序。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計處理，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間連續(xù)變量采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用百分比表示，組間比較用χ2檢驗，OR及95%CI表示患病風險，計算各組基因型頻率及等位基因頻率，以Hardy-Weinberg平衡檢驗基因分布，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組臨床基線資料比較

三組性別比、年齡、身高、體重、高血壓病史、TG、和肌酐（Scr）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。三組吸煙史、FBG、TC和Hcy比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 基因測序結果

各組血液樣本DNA提取擴增后，經(jīng)直接測序得出TT、CT和CC基因型圖譜，具體見圖1。

2.3 MTHFR C677T基因多態(tài)性分布與冠心病心衰的關系

健康組、冠心病組和心衰組人群經(jīng)χ2擬合優(yōu)度檢驗均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（健康組：χ2=4.15，P > 0.05；冠心病組：χ2=3.44，P > 0.05；心衰組：χ2=0.072，P > 0.05），說明研究樣本具有群體代表性。心衰組和冠心病組T等位基因的頻率與TT基因型頻率分別為59%、34.8%和55%、37.8%，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.403，P = 0.002<0.05）。三組T等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義（χ2=18.367，P = 0.000<0.05）。見表2。設定CC基因型者患冠心病心衰的風險為對照（設數(shù)值為1.000），心衰組與CC基因型攜帶者比較，攜帶CT（OR = 4.699，95%CI：1.775～12.440，P = 0.01）或TT（OR = 7.318，95%CI：2.300～23.282，P = 0.00）基因型的患者其發(fā)生心衰的危險性更大。

表2 MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布表

2.4 不同基因型間Hcy比較

所有觀察對象按基因型進行分組，TT基因型組46例，Hcy平均水平為（21.34±2.72） μmol/L；CT基因型組61例，Hcy平均水平為（15.51±2.57） μmol/L，CC基因型組41例，Hcy平均水平為（11.26±2.43） μmol/L，組間差異有統(tǒng)計學意義（F = 13.535，P = 0.000<0.05）。

3 討論

2015年的一項流行病學調查顯示，中國心衰患者高達400萬例，成年人心衰的患病率為0.9%[6]。我國心力衰竭的主要原因是冠心病。Boushey等[7]對4000多例患者的研究發(fā)現(xiàn)，Hcy濃度每升高5 μmol/L時，男性發(fā)生冠心病的概率升高1.6倍，女性發(fā)生冠心病的概率升高1.8倍。高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHcy）是慢性心力衰竭的危險因素。陳平安等[8]發(fā)現(xiàn)Hcy隨著心功能的惡化而增高，并能反映心衰的嚴重程度。Veeranna等[9]發(fā)現(xiàn)Hcy可導致冠心病患者發(fā)生心衰的概率倍增。李秀昌等[10]發(fā)現(xiàn)Hcy水平與左室心肌質量、左室質量指數(shù)及舒張末期室間隔厚度呈明顯正相關，并證實HHcy血癥是影響心血管結構和功能的一個重要危險因素。HHcy主要是由遺傳因素、環(huán)境因素和營養(yǎng)因素改變導致。MTHFR C677T位基因突變是導致HHcy最主要的遺傳原因。當基因發(fā)生突變時，MTHFR酶活性改變，導致Hcy向蛋氨酸轉化受阻及DNA低甲基化，Hcy在體內蓄積，形成HHcy血癥。而HHcy與心力衰竭關系密切，推測MTHFR C677T突變可能與心力衰竭有關。本研究結果提示，按MTHFR基因型分組后，TT基因型組和CT基因型組血漿Hcy都明顯高于CC基因型人群組，說明TT純合突變型或T等位基因頻率高時，血漿Hcy水平顯著升高。

MTHFR基因位于染色體1p36.3，由11個外顯子和10個內含子組成，有20多種突變位點，其中以C677T位點最為常見。MTHFR C677T突變位是首個被發(fā)現(xiàn)的突變位點，為不完全顯性遺傳[11]。MTHFR基因多態(tài)性與心血管疾病密切相關[12]，其中與冠心病[13]、H型高血壓[14]的研究頗多。Hamelahti等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TT純合突變型時動脈內中膜斑塊及厚度增加的發(fā)生率是最高的。靳鈺等[16]認為MTHFR C677T基因多態(tài)性與高血壓病患者發(fā)生冠心病有關。Yi等[17]發(fā)現(xiàn)通過補充葉酸降低血漿Hcy，可以有效改善冠狀動脈疾病患者血管舒張功能。也有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T多態(tài)性可能與代謝綜合征的發(fā)生有關[18]。王晟等[19]發(fā)現(xiàn)Mir-499b通過增強MTHFR的表達降低血清Hcy的表達量減少老年慢性心力衰竭的發(fā)病率。以上研究結果表明，MTHFR C677T突變與動脈粥樣硬化、高血壓病和冠心病相關，也有研究不支持此結論[20]。本研究中，心衰組TT基因型頻率及T等位基因頻率分別為59%、34.8%，明顯高于冠心病組和健康組，推測TT基因型或T等位基因的頻率與老年冠心病心衰有關。心衰組中CT基因型與TT基因型誘發(fā)心衰發(fā)病的相對危險度分別為4.699和7.318，認為MTHFR C677T位突變TT基因型或CT基因型是誘發(fā)心衰的危險因素，與CC基因型比較，其發(fā)生心衰風險增加，可見MTHFR 677T基因TT基因型及T等位基因是心力衰竭的危險因素。MTHFR基因C677T突變可能與心衰遺傳易感性有關。

綜上所述，MTHFR基因C677T多態(tài)性是冠心病心衰的危險因素。在冠心病心衰患者中進行Hcy水平檢測和MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測，為早期預防心血管疾病和發(fā)現(xiàn)危險人群提供新思路，為冠心病心衰的治療提供新領域。然而，本研究入選的樣本量有限，未對研究對象的種族、地域及研究方法等方面加以權衡，因而所得的結論需要更多的大樣本臨床研究進行驗證。

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（收稿日期：2016-09-05 本文編輯：張瑜杰）