伍金雷，許 衛(wèi)，陳永權，謝文杰，陳晞明，陳盛強，張銀霞

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院心內科，廣州510150；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣州510150；3.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣州510150）

促紅細胞生成素對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及對cleaved Caspase-3蛋白表達的影響△

伍金雷1，許 衛(wèi)1，陳永權1，謝文杰1，陳晞明1，陳盛強2，張銀霞3

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院心內科，廣州510150；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣州510150；3.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣州510150）

目的觀察促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌細胞的抗凋亡作用及對活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）蛋白表達的影響。方法將36只雄性成年SD大鼠隨機分為3組，分別為假手術（Sham）組（n=12）、EPO組（n=12）和對照（Control）組（n=12）；其中EPO組和Control組大鼠使用腹主動脈縮窄術建立慢性心力衰竭模型，術后第8周EPO組經(jīng)腹腔注射3 000 U/kg EPO，3次/周，連續(xù)4周；Sham組、Control組經(jīng)腹腔注射等量等次0.9%氯化鈉溶液。術后第4周、8周、12周行超聲心動圖檢測大鼠心功能。術后第12周末全部大鼠禁食24 h后處死，取心肌組織切片采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察心肌組織細胞形態(tài)，采用Tunel法觀察心肌細胞凋亡及計算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）；采用Western blot法檢測心肌cleaved Caspase-3蛋白表達情況。結果超聲心動圖結果顯示，造模大鼠術后第4周時出現(xiàn)心室肥厚，術后第8周時出現(xiàn)左心室射血功能減退；EPO組干預4周后較Control組左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）明顯升高（P<0.05），收縮末期室間隔厚度（IVSs）、收縮末期左心室后壁厚度（LVPWs）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左心室后壁厚度（LVPWd）明顯降低（P<0.05）。EPO組AI相比Control組顯著降低（23.87%±1.45%vs.35.58%±2.81%，P<0.01）；與Sham組比較，Control組cleaved Caspase-3 OD值明顯增加（0.3 145±0.0 308 vs.0.9 007±0.0 339，P<0.01）；與EPO組相比，Control組減少（0.4 893±0.0 683 vs.0.9 007±0.0 339，P<0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。結論EPO可明顯改善慢性心力衰竭大鼠的心功能，減少心肌細胞凋亡，對心肌具有保護作用，其機制可能與下調凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3蛋白表達相關。

促紅細胞生成素；心力衰竭；心肌凋亡；cleaved caspase-3蛋白

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）作為多種心血管疾病的最終發(fā)展結果，不僅嚴重影響著患者的健康水平及生活質量，而且給患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔［1］。近來有研究證明，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）對急性心肌梗死、急性心力衰竭大鼠心肌均具有保護作用［2-3］。但是目前而言，EPO對治療CHF的相關研究尚少見報道。本研究擬通過建立大鼠CHF模型并以EPO干預，觀察超聲心動圖、心肌細胞組織形態(tài)、心肌細胞凋亡率以及凋亡相關基因cleaved Caspase-3蛋白的表達，探討EPO是否具有抗CHF心肌凋亡作用及其可能的機制，為CHF的臨床治療提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動 物 8～12周齡無特定病原體（SPF）級成年雄性SD大鼠共40只，體質量（241.40±16.70）g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。所有大鼠均在相同的條件下飼養(yǎng)，自由飲水和取食。飼料購自南方醫(yī)科大學實驗中心。

1.1.2 藥品及試劑 EPO（10 000 U/mL）購自沈陽三生制藥公司，TUNEL試劑盒購自Roche公司，cleaved Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technolo?gy（USA），β-actin抗體購自ProteinTech Group，Inc（USA）。

1.2 方 法

1.2.1 分組及模型建立 40只成年雄性SD大鼠隨機挑選出12只為假手術（Sham）組（n=12），其余大鼠通過行腹主動脈縮窄術提高大鼠心臟后負荷，建立CHF模型。簡述如下：術前禁食24 h，稱體質量，10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射（3 mL/kg）麻醉，打開腹腔、暴露左腎靜脈，左腎靜脈和下腔靜脈交點上方約10～15 mm處鈍性分離筋膜，暴露腹主動脈，用4-0絲線穿過分離的腹主動脈，在腹主動脈上放置預處理磨鈍后的7號輸液針頭（直徑0.7 mm），與腹主動脈平行，結扎后拔針，拔針時以稍有緊箍感為宜，使腹主動脈縮窄達60%～70%，收納臟器，關閉腹腔。待大鼠蘇醒后即經(jīng)腹腔注射阿米卡星（0.2 mL/d）抗感染，連續(xù)3 d。術后正常飼養(yǎng)并觀察8周，制成CHF模型。Sham組：在分離的腹主動脈相同部位穿線但不結扎，余建模流程同建模組。

1.2.2 模型分組和干預 術后第8周，將造模成功的存活CHF大鼠用隨機數(shù)字表法分成EPO組（n= 12）和將10 000 U/mL EPO用0.9%氯化鈉溶液稀釋成1 000 U/mL，EPO組大鼠經(jīng)腹腔注射EPO（3 000 U/kg），3次/周，連續(xù)4周［4］。Control組（n=12）經(jīng)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，3次/周，連續(xù)4周。Sham組處理同Control組。術后第12周各組大鼠無死亡。

1.2.3 超聲心動圖檢查 在術后第4周、8周、12周行超聲心動圖檢查大鼠心功能情況。禁食24 h后，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉、備皮，應用超聲心動儀（ie33型號，PHILIPS公司）及7.5 MHz高頻線控探頭（PHILIPS公司）進行超聲檢測。檢測左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、舒張末期室間隔厚度（end-diastolicinterventricular septum thickness，IVSd）、舒張末期左心室后壁厚度（end-diastolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWd）、收縮末期室間隔厚度（endsystolic interventricular septum thickness，IVSs）、收縮末期左心室后壁厚度（end-systolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWs）。

1.2.4 心內采血和心肌組織標本處理 術后第12周全部大鼠完成超聲心動圖檢查后，10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射（3 mL/kg）麻醉，暴露胸腔，1 mL注射器從心尖進針采血1 mL，注入抗凝管待送檢血常規(guī)，然后剪取心尖部約5 mm×5 mm×5 mm心肌組織，放入預冷至4℃的磷酸鹽緩沖液（PBS）中沖洗至溶液無血色，置于液氮中速凍后存于-80℃超低溫冰箱，待分子生物學實驗用；剩余部分心臟組織經(jīng)預冷的0.9%氯化鈉溶液溶液灌注3 min，再經(jīng)4%多聚甲醛溶液灌注固定20～30 min后剪取心臟，置于4%多聚甲醛緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成3～4 μm厚石蠟切片，待用。

1.2.5 病理檢查 經(jīng)上述步驟制成的石蠟切片中，各組中隨機選擇3張切片，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后置于200倍光鏡下觀察，鏡下觀察各組心肌組織細胞形態(tài)結構及炎癥細胞浸潤情況。

1.2.6 TUNEL原位末端標記法檢測細胞凋亡 從石蠟切片中，各組隨機選擇3張切片，按照TUNEL試劑盒操作方法處理，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞并采取圖像，再進行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，每張切片在高倍鏡（×400）下隨機讀取6個不重疊視野，細胞核染成棕色者計為陽性細胞。計數(shù)后，計算細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）=單視野凋亡陽性細胞數(shù)/單視野總細胞計數(shù)×100%，取其平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.2.7 Western blot法測定cleaved Caspase-3蛋白表達 心肌組織經(jīng)研磨、裂解后用酶標儀測蛋白濃度，根據(jù)所測得的蛋白濃度上樣總蛋白質量為120 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用電印跡轉移法將蛋自質轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，麗春紅S染色，根據(jù)所需目標條帶剪膜，用質量濃度為5%的脫脂奶粉的TBS-T溶液室溫封閉2 h后，分別加入兔抗Caspase單克隆抗體和β-actin抗體，4℃孵育過夜，室溫下TBS-T溶液洗膜后加入兔（鼠）二抗孵育2 h，用TBS-T溶液洗膜后與ECL試劑反應5 min，膠片曝光，掃描膠片，用Quantity One軟件計算條帶光密度（OD）值，以cleaved Caspase-3與β-actin條帶的OD積分比值來評定的cleaved Caspase蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 建模、EPO干預前后超聲心動圖指標的變化

術后第4周，Sham組與建模組大鼠LVEF差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；建模組LVPWd、IVSd、LVPWs、IVSs顯著升高（P<0.05），表明建模組大鼠心臟發(fā)生心肌肥厚。術后第8周，建模組大鼠LVEF顯著下降（P<0.01），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd仍高于Sham組（P<0.05），表明建模組大鼠經(jīng)結扎縮窄腹主動脈后發(fā)生心力衰竭，CHF模型建立成功。術后第12周，相比Sham組（圖1-A），Control組大鼠LVEF進一步下降（P<0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd進一步增高（P<0.05），見圖1-B，側面反映Control組大鼠心力衰竭進一步加重。與Control組比較，EPO組大鼠LVEF明顯增加（P<0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd明顯降低（P<0.05），表明EPO干預CHF大鼠能夠逆轉其心室肥厚、改善心功能，詳見圖1-C、表1。

圖1 各組大鼠超聲心動圖檢查圖像（A：sham組；B：Control組；C：EPO組）

表1 各組術后第4、8、12周超聲心動圖檢查指標比較 （±s）

表1 各組術后第4、8、12周超聲心動圖檢查指標比較 （±s）

注：*P<0.05，**P<0.01；與Sham組比較，aP<0.01；與Control組比較，bP<0.05

組別Sham組建模組t值Sham組建模組t值Sham組Control組EPO組F值周數(shù)n 4 4 8 8 1 2 12 24 12 24 12 12 12 12 12 LVPWs（cm）0.276±0.005 0.355±0.015 5.467＊＊0.297±0.020 0.381±0.021 5.237＊＊0.310±0.039 0.439±0.009a0.354±0.008b10.177＊＊IVSs（cm）0.278±0.007 0.327±0.060 2.420＊0.311±0.008 0.364±0.022 3.265＊＊0.334±0.017 0.392±0.010a0.375±0.019b5.755＊LVPWd（cm）0.171±0.008 0.264±0.012 3.136＊0.192±0.009 0.294±0.025 3.148＊＊0.206±0.013 0.307±0.011a0.243±0.014b13.584＊＊IVSd（cm）0.167±0.004 0.228±0.013 2.283＊0.187±0.008 0.242±0.020 2.515＊0.199±0.011 0.271±0.008a0.215±0.015b7.322＊＊LVEF 0.884 8±0.1832 0.826 0±0.1305 1.409 0.865 7±0.1453 0.655 7±0.1672 8.426＊＊0.8235±0.1378 0.6063±0.2721a0.716 6±0.3482ab32.308＊＊

2.2 各組蘇木素-伊紅染色結果比較

Sham組大鼠心肌細胞染色清晰、排列整齊而緊密，結構完整，細胞核致密、清晰可見，呈橢圓形或長桿形，顯藍色，見圖2-A。Control組心肌細胞較肥大、細胞間間隙增寬、排列紊亂，可見間質增生、纖維化，細胞核著色不均，心肌肌節(jié)增多、肌纖維間疏松水腫，見圖2-B。相比Control組，EPO組心肌細胞排列紊亂、間質增生水腫及炎性細胞浸潤、聚集的表現(xiàn)有所減輕，見圖2-C。

圖2 光鏡下心肌組織切片（HE，×200；A：Sham組；B：Control組；C：EPO組）

2.3 各組心肌細胞凋亡的變化

Sham組細胞核染為藍色，清晰可見，邊界清楚。見圖3-A。Control組可見大量棕色深染的固縮、聚集呈棒狀的細胞核（箭頭所示），為發(fā)生凋亡的細胞核，見圖3-B。EPO組深染棕色細胞核較Control組明顯減少，見圖3-C。與Sham組比較，Control組AI顯著增加；與Control組比較，EPO組 AI有所降低，但仍高于Sham組（P<0.01），見表2。

2.4 Western blot法檢測心肌cleaved Caspase-3蛋白表達

與Sham組比較，Control組cleaved Caspase-3/ β-actin相對表達量（OD）值明顯升高；與Control組比較，EPO組cleaved Caspase-3相對表達量值顯著降低，但高于Sham組（P<0.05），見圖4、表2。

圖3 光鏡下心肌細胞凋亡組織切片（TUNEL，×400；A：Sham組；B：Control組；C：EPO組）

圖4 Western blot檢測各組大鼠建模12周心肌cleaved Caspase-3蛋白的表達情況

表2 各組cleaved Caspase-3蛋白相對表達量及心肌細胞AI比較 ［n=12，±s］

表2 各組cleaved Caspase-3蛋白相對表達量及心肌細胞AI比較 ［n=12，±s］

組別Sham組Control組EPO組F值cleaved Caspase-3/-actin 0.3 145±0.0 308 0.9 007±0.0 339 0.4 893±0.0 683 153.438**AI（%）8.03±0.89 35.58±2.81a23.87±1.45ab53.128**

3 討論

心力衰竭是各種病因導致的以心臟收縮和（或）舒張功能受損為特點的器質性心臟病的終末階段，是心臟病患者死亡的重要原因之一。近年來，隨著人們對心力衰竭發(fā)病機制的認識不斷深入，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡作為一種不同于壞死的細胞損傷機制，參與了CHF的病理生理過程［4］，是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一［5］。心肌細胞凋亡可使心肌細胞數(shù)量減少，當心肌細胞數(shù)量減少至一定程度，則影響了心臟的正常舒縮功能，最終引致心肌肥大、心室壁變薄、心腔擴大等心室重構表現(xiàn)。心肌細胞凋亡與炎性細胞因子、交感神經(jīng)活性增加、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活等多因素的作用最終導致CHF。新近研究發(fā)現(xiàn)，EPO除了具有造血作用外，還具有抗凋亡、抗氧化、抗炎、減輕水腫、促進新生血管生成等細胞保護作用（神經(jīng)、血管平滑肌、子宮等非造血組織）［6］。而且有研究表明，EPO受體在心血管系統(tǒng)有廣泛的表達。然而，EPO能否通過抗細胞凋亡作用改善CHF心功能、逆轉心室肥厚的研究，國內、外少見報道。本研究對大鼠采用腹主動脈縮窄術建立CHF模型。腹主動脈縮窄術是建立壓力超負荷心力衰竭模型常用的方法，在腹主動脈縮窄術術后6周大鼠出現(xiàn)失代償性心力衰竭［7］，本研究在腹主動脈縮窄術后第8周（EPO干預前）行超聲心動圖表明造模大鼠心臟肥厚、LVEF降低，這與以往的研究相同［7］，表明CHF模型建立成功。術后第12周（EPO干預后），EPO組較Control組心功能參數(shù)上，LVPWs、 IVSs、LVPWd、IVSd及LVEF明顯改善，表明EPO能改善心力衰竭大鼠心功能，逆轉心室肥厚。本研究結果顯示，與Sham組相比，Control組心功能顯著降低，細胞AI顯著升高，cleaved Caspase-3表達顯著增加；EPO干預后，EPO組心功能較Control組改善，細胞AI較Control組減輕，cleaved Caspase-3表達顯著減少。該研究結果不僅證實心肌細胞凋亡是CHF的發(fā)生、發(fā)展及惡化的重要環(huán)節(jié)，同時還表明EPO干預可有效改善CHF大鼠的心功能，該作用可能與抑制凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3的表達，減少心肌細胞凋亡有關。

有研究表明，心力衰竭時予EPO干預可介導多條信號轉導途徑發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡和改善心臟功能的作用。其中主要有PI-3K-Akt途徑［8］，而本研究的主要研究對象凋亡蛋白剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 cleaved Caspase-3是經(jīng)PI-3KAkt途徑調控的細胞凋亡終末執(zhí)行因子，可以激活核內核酸酶裂解DNA片段從而觸發(fā)凋亡，在細胞凋亡發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［9-11］。因此，抑制cleaved Caspase-3表達可有效減少心肌細胞凋亡，從而對CHF的治療發(fā)揮積極的影響。而本實驗所檢測指標cleaved Caspase-3表達減少說明EPO干預CHF可抑制心肌細胞凋亡，從而減輕心肌細胞的損傷，改善心力衰竭。其機制可能與EPO激活caspase家族上游調控因子發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的保護作用相關［12］。

綜上所述，在CHF模型大鼠中，EPO具有抗心肌凋亡，逆轉心室重構、改善心功能的作用，這與相關研究結論一致［13-14］。EPO通過減少凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3的表達發(fā)揮抗凋亡作用，由于細胞凋亡及抗細胞凋亡的信號途徑眾多且復雜，本研究未能闡明EPO下調cleaved Caspase-3蛋白表達的具體信號途徑及EPO作用相關的受體位點，有待今后進一步的研究揭示。

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Erythropoietin effect on expression of cleaved Caspase-3 protein in rat with chronic heart failure

WU Jin-lei1，XU Wei1，CHEN Yong-quan1，XIE Wen-jie,CHEN Xi-ming1，CHEN Sheng-qiang2，ZHANG Yin-xia3
（1.Department of Cardiology，The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China；2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China；3.The King Med Shool of Laboratory Medicine，Guangzhou 510150，China）

ObjectivesAnti-apoptotic effects of chronic heart failure（CHF）was observed in rat cardiomyocytes erythropoietin（EPO）and its effect on protein cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases（cleaved Cas?pase-3）expression.MethodsFirstly，36 male adult SD rats were randomly divided into three groups as sham-operat?ed（Sham）group（n=12），EPO group（n=12）and control（Control）group（n=12）.CHF model was built by abdomi?nal aortic coarctation in EPO group and Control group.EPO group received 3 000 U/kg EPO by intraperitoneal injection 3 times/week for 4 weeks in 8 weeks postoperatively.Sham group and Control group received equal normal saline in dos?age and frequency.Respectively，after 4 weeks，8 weeks，12 weeks cardiac function were checked by echocardiography. After 12 weeks，all rats were sacrificed after 24 h fasting.Myocardial tissue section was used to observe cell morphology by hematoxylin and eosin（HF）staining.Myocardial apoptosis was observed by Tunel assay and apoptosis index（AI）was calculated.And myocardial cleaved Caspase-3 protein expression was examined by Western blot assay.ResultsEchocardiography showed CHF rats had ventricular hypertrophy in 4 weeks postoperatively，and had de?creased left ventricular ejection fraction（LVEF）in 8 weeks postoperatively.Compared with Control group，LVEF was significantly higher（P<0.05），end-systolic interventricular septum thickness（IVSs），end-systolic left ventricular pos?terior wall thickness（LVPWs），end-diastolic interventricular septum thickness（IVSd），end-diastolic left ventricular posterior wall thickness（LVPWd）was significantly lower（P<0.05）in EPO group in 4 weeks postoperatively.AI in EPO group was significantly lower than that in Control group（23.87%±1.45%vs.35.58%±2.81%，P<0.01）.Compared with Sham group，cleaved Caspase-3 OD values significantly increased in Control group（0.3 145±0.0 308 vs.0.9 007± 0.0 339，P<0.01）.Compared with Control group，cleaved Caspase-3 OD values in EPO group significantly decreased（0.4 893±0.0 683 vs.0.9 007±0.0 339，P<0.01）.ConclusionsEPO can improve heart function in rats with CHF，in?hibition of cardiomyocyte apoptosis，and can reduce express of cleaved Caspase-3.

erythropoietin；heart failure；cardiac apoptosis；cleaved Caspase-3 protein

R541.6

A

：1007-9688（2017）02-0209-06

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.02.22

2016-05-26）

廣東省科技廳項目（項目編號：2013B022000103）。

伍金雷（1991-），男，在讀碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向為冠心病防治。

陳晞明，E-mail：13903004891@163.com