徐兵，張玉琴，冀宏

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

黑皮雞樅菌固體培養(yǎng)基的優(yōu)化

徐兵，張玉琴，冀宏*

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

以黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率為指標(biāo)，首先通過單因素試驗(yàn)確定最佳的碳源、最佳碳源的最優(yōu)量、最佳氮源、最佳氮源的最優(yōu)量，然后經(jīng)過響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化，得出最佳固體培養(yǎng)基配方：瓊脂20 g/L，果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，VB12mg/L，自然pH的條件下，通過驗(yàn)證培養(yǎng)后，黑皮雞樅菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到0.9cm/d。

黑皮雞樅菌；固體培養(yǎng)基；單因素；響應(yīng)面法

黑皮雞樅菌（Termitomyces albuminosus）是屬擔(dān)子亞門菌，層菌綱，傘菌目，口蘑科[1-4]。其肉質(zhì)鮮嫩，口感獨(dú)特，作為食品藥品皆可，備受人們青睞。黑皮雞樅菌是相關(guān)科研人員經(jīng)過數(shù)年的潛心研究，在2006年選育出能實(shí)現(xiàn)人工栽培的珍稀食用菌，其中胡尚勤[5]、曾先福[6]等對(duì)雞樅菌的生長(zhǎng)條件有一定的研究。雖然對(duì)于黑皮雞樅菌人工栽培技術(shù)有小規(guī)模的成果[7]，但對(duì)于黑皮雞樅菌固體培養(yǎng)基優(yōu)化還鮮見報(bào)道，所以本試驗(yàn)對(duì)黑皮雞樅固體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為生產(chǎn)提供了一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料和設(shè)備

黑皮雞樅：常熟理工學(xué)院食用菌發(fā)酵工程技術(shù)研究中心種植。

303A-3S型電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱：浦東榮豐科學(xué)儀器廠；GZX-GF101-AO-S型電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京百思威科技有限公司；LDZX-75KBS（內(nèi)循環(huán)）型立式壓力蒸汽滅菌器、M124A型電子天平：南京菲奇工貿(mào)有限公司；SW-CJ-2F型潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化公司；ZQWY-200G型震蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，瓊脂20 g，pH自然。

基本培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉2 g，水1 000 mL，0.003 g，瓊脂20 g，pH自然。

1.2.2 固體培養(yǎng)

先對(duì)黑皮雞樅進(jìn)行組織分離，做成母種，再將母種接種到基本培養(yǎng)基，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用卡尺測(cè)量菌落直徑，單位為mm。分別從每個(gè)配方中選擇長(zhǎng)勢(shì)較好的培養(yǎng)皿，每個(gè)菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑各1次，取其平均值。純生長(zhǎng)量=菌落平均直徑-原培養(yǎng)基直徑，所以，黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率=純生長(zhǎng)量/天數(shù)[8-11]。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 碳源的影響

以菌絲的日生長(zhǎng)速率為指標(biāo)，研究配方中不同碳源對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響。碳源設(shè)為：葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉[12]。碳源的含量為20 g/L，酵母粉的含量為3 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.2 碳源含量的影響

以菌絲的日生長(zhǎng)速率為指標(biāo)，研究配方中碳源的不同含量對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響。碳源的含量設(shè)為：10、15、20、25、30 g/L。酵母粉的含量為3 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.3 氮源的影響

以菌絲的日生長(zhǎng)速率為指標(biāo)，研究配方中不同氮源對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響。氮源設(shè)為：蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、玉米粉、豆粕粉[13]。碳源的含量為20 g/L，氮源的含量為3 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.3.4 氮源含量的影響

以菌絲的日生長(zhǎng)速率為指標(biāo)，研究配方中氮源的不同含量對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響。氮源的含量設(shè)為：1、2、3、4、5 g/L。碳源的含量為20 g/L，VB1的含量為3 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL水。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

碳源、氮源是影響黑皮雞樅固體培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，微量元素對(duì)于菌絲體生長(zhǎng)也是有一定幫助的，雖然微量，但是可以促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)。所以，本試驗(yàn)將添加VB1的含量作為響應(yīng)面研究的一個(gè)因素探討黑皮雞樅菌的最適固體培養(yǎng)基，采用Box-Behnken模型進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用Design Expert 8.05 b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。編碼與因子的實(shí)際濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表1。

表1 編碼與因子的實(shí)際濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系Table 1The corresponding relation between encode and factor practical concentration

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源的影響

不同碳源的黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率見圖1。

圖1 不同碳源的黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率Fig.1Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different glucose

由圖1可知，當(dāng)固體培養(yǎng)基碳源是果糖的時(shí)候，黑皮雞樅菌絲日生長(zhǎng)速率最大，是0.91 cm/d，其次是葡萄糖和蔗糖。因此，選擇果糖作為最佳碳源。

2.1.2 碳源含量的影響

果糖不同含量的黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率見圖2。

圖2 果糖不同含量的黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率Fig.2Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different amount of fructose

由圖2可知，黑皮雞樅菌絲日生長(zhǎng)速率隨果糖的增加而升高，但當(dāng)果糖含量達(dá)30 g/L后，黑皮雞樅菌絲日生長(zhǎng)速率急速下降，因此，優(yōu)選出3個(gè)果糖最佳含量：25、20、15 g/L。

2.1.3 氮源的影響

不同氮源的黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率見圖3。

由圖3可知，氮源的選擇對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)速率也有一定的影響。氮源為胰蛋白胨的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)最快，是0.739 cm/d，最慢的是玉米粉為氮源的培養(yǎng)基，生長(zhǎng)速率是0.421 cm/d，所以優(yōu)選出最佳氮源為胰蛋白胨。

圖3 不同氮源的黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率Fig.3Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different nitrogen

2.1.4 氮源含量的影響

氮源的不同量黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率見圖4。

圖4 氮源的不同量黑皮雞樅菌菌絲日生長(zhǎng)速率Fig.4Mycelium growth rate of Termitomyces albuminosus from different amount of nitrogen

由圖4可知，當(dāng)胰蛋白胨含量為4 g/L的時(shí)候，黑皮雞樅菌日生長(zhǎng)速率最大，其次是2 g/L和3g/L，所以優(yōu)選出3個(gè)氮源含量為：2、3、4 g/L。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照Design Expert 8.05 b軟件中的Box-Behnken Design方法，經(jīng)擬合后得到的回歸方程為：菌絲日生長(zhǎng)速率=0.90+0.11A+0.013B+0.016C+3.750×10-3AB+ 0.016AC+2.000×10-3BC－0.10A2-0.093B2－0.14C2。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2Design and results of Box-Behnken design

續(xù)表2Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2Design and results of Box-Behnken design

在本試驗(yàn)中，模型顯著性檢驗(yàn)P<0.0001，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R2=0.987 4，說明該模型可以被運(yùn)用，能夠在試驗(yàn)預(yù)測(cè)的實(shí)際范圍內(nèi)。響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3The variance analysis result of response test

由表3可知其自變量一次項(xiàng)A，二次項(xiàng)A2、B2、C2顯著（P<0.05），而自變量一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)AB、AC、BC不顯著。進(jìn)一步分析就是碳源-果糖的含量對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)速率表現(xiàn)顯著，而氮源-胰蛋白胨的含量和生長(zhǎng)因子VB1的含量對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)速率作用不顯著。

果糖含量、胰蛋白胨含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-3D圖見圖5，果糖含量、胰蛋白胨含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-等高線圖見圖6，果糖含量、VB1的含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-3D圖見圖7，果糖含量、VB1的含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-等高線圖見圖8，胰蛋白胨含量、VB1含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-3D圖見圖9，胰蛋白胨含量、VB1含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-等高線圖見圖10。

圖5 果糖含量、胰蛋白胨含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-3D圖Fig.5Response surface of the content of fructose and tryptone to the growth rate of mycelium-3D

圖6 果糖含量、胰蛋白胨含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-等高線圖Fig.6Response surface of the content of fructose and tryptone to the growth rate of mycelium-contour

圖7 果糖含量、VB1的含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-3D圖Fig.7Response surface of the content of fructose and VB1to the growth rate of mycelium-3D

圖8 果糖含量、VB1的含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-等高線圖Fig.8Response surface of the content of fructose and VB1to the growth rate of mycelium-contour

圖9 胰蛋白胨含量、VB1含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-3D圖Fig.9Response surface of the content of tryptone and VB1to the growth rate of mycelium-3D

圖10 胰蛋白胨含量、VB1含量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響的響應(yīng)面-等高線圖Fig.10Response surface of the content of tryptone and VB1to the growth rate of mycelium-contour

最終響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到最佳固體培養(yǎng)基配方為：果糖22.71 g/L，胰蛋白胨3.08 g/L，VB12.09 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL的水，自然pH的條件下，菌絲日生長(zhǎng)速率可達(dá)到0.93 cm/d。根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)情況將最優(yōu)配方改良為：果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，ffffdf2 mg/L，瓊脂20 g，1 000 mL的水，自然pH的條件下，最后用此條件在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，經(jīng)測(cè)量得黑皮雞樅菌絲生在速率達(dá)到0.9 cm/d，與理論值相差不大，說明理論值具有一定可信度和可行性。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析，碳源-果糖含量的選擇對(duì)黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)有很大的影響，而氮源-胰蛋白胨的含量和VB1的含量對(duì)其沒有多大影響，可能是碳源在培養(yǎng)基中占很大的成分，氮源和生長(zhǎng)因子所占比例較小，所以影響不大。所以，當(dāng)固體培養(yǎng)基成分是瓊脂20 g，果糖23 g/L，胰蛋白胨3 g/L，2 mg/L，1 000 mL的水，自然pH的條件下，是最適合黑皮雞樅菌菌絲生長(zhǎng)的。

[1]薛林浩,王曉東,蔡虹,等.黑皮雞樅菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化[J].內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報(bào),2013,28(10)：24-27

[2]鄒盛勤,陳武.食用菌的營(yíng)養(yǎng)成分·藥理作用及開發(fā)利用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(3)：502-503

[3]卯曉嵐.中國(guó)大型真菌[M].鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000

[4]付子艷,李榮春.雞樅菌屬關(guān)系的初步研究[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,38(3)：271-274

[5]胡尚勤,劉天貴,李賢柏.雞樅菌的培養(yǎng)條件研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2008,27(1)：67-70

[6]曾先富,陳陽婷,熊維全,等.雞樅菌菌絲體培養(yǎng)試驗(yàn)[J].食用菌, 2012,34(6)：9-10,18

[7]趙守光,劉小康,陳明達(dá),等.雞樅菌引種馴化栽培試驗(yàn)[J].中國(guó)食用菌,1998,17(3)：11-13

[8]張玉金,郭華春.雞樅的馴化栽培現(xiàn)狀微生物學(xué)報(bào)[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(10)：1288-1292

[9]陸建明,張錫鳳.食用菌液體菌種制備的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食用菌,2003,22(6)：15-17

[10]羅海凌,林興生,林輝,等.不同pH值的菌草培養(yǎng)基對(duì)4種真菌菌絲生長(zhǎng)的影響[J].廣西科學(xué)院學(xué)報(bào),2007,23(3)：166-167

[11]魏曉梅,胡尚勤,韋偉,等.雞樅菌菌絲體在不同條件下蛋白質(zhì)合成量的分析[J].食品科技,2007,32(8)：74-77

[12]施渺筱,李祝,楊坤耀,等.野生雞樅菌子實(shí)體不同部位營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].食品研究與開發(fā),2012,33(2)：182-183

[13]羅曉妙.液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)雞樅菌菌絲體的條件優(yōu)化[J].食品科技,2010, 35(3)：29-33

The Optimization of Solid Medium of the Termitomyces albuminosus

XU Bing，ZHANG Yu-qin，JI Hong*
（College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

The Termitomyces albuminosus mycelia growth rate was used as evaluation index，and the single factor test was used to optimize the carbon source，the concentration of carbon source，the nitrogen source and the amount of nitrogen source.Then the optimal solid medium was obtained by response surface methodology.The optimized solid culture medium component were agar 20 g/L，fructose 23 g/L，tryptone 3 g/L，VB12 mg/L，the natural pH value.The Termitomyces albuminosus mycelia growth rate reached up to 0.9 cm/d under the original fermentation conditions.

Termitomyces albuminosus；solidmedium；single factor；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.040

2016-07-20

常熟理工學(xué)院青年基金項(xiàng)目（QZ1504）；蘇州市項(xiàng)目（SNG201615）

徐兵（1982—），男（漢），實(shí)驗(yàn)師，學(xué)士，研究方向：食用菌學(xué)。

*通信作者：冀宏（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食、藥用菌。