趙志欣， 李臘梅， 蔣恩社

(河南大學(xué)公共衛(wèi)生研究所， 開封 475004)

神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏對小鼠學(xué)習記憶能力的影響*

趙志欣， 李臘梅， 蔣恩社△

(河南大學(xué)公共衛(wèi)生研究所， 開封 475004)

目的：探討神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏對小鼠學(xué)習記憶能力的影響，方法：實驗采用雄性的野生型小鼠(WT)和神經(jīng)鞘磷脂酶合成酶2缺乏小鼠(KO)，每組10只，采用Morris水迷宮實驗進行7 d的定位航行試驗檢測，之后進行空間探索試驗，以檢測小鼠的學(xué)習記憶能力。結(jié)果：定位航行試驗檢測結(jié)果顯示，兩組小鼠找到平臺的潛伏期、游泳距離均無顯著性差異(P>0.05)；空間探索試驗檢測結(jié)果顯示，兩組小鼠的目標象限滯留時間占總時間的百分比和小鼠穿越平臺區(qū)的次數(shù)也無顯著性差異(P>0.05)；但野生型小鼠的搜索策略優(yōu)于神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏小鼠(P<0.05)。結(jié)論：神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏影響小鼠的搜索策略，但不影響小鼠的空間學(xué)習記憶能力。

神經(jīng)酰胺；神經(jīng)鞘磷脂合成酶2；學(xué)習記憶；搜索策略

ceramide; sphingomyelin synthase 2; learning and memory; search strategy

【DOI】 10.12047/j.cjap.5470.2017.039

鞘脂類化合物在人體內(nèi)廣泛存在并且是各種生物膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，特別是其中的神經(jīng)酰胺(ceramide)和神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin, SM)在維持細胞膜功能的完整性方面具有重要的作用。神經(jīng)酰胺作為細胞膜的組成成分，參與了細胞凋亡(包括自噬)和應(yīng)激等生理功能[1]。神經(jīng)酰胺主要的代謝途徑是在細胞內(nèi)經(jīng)神經(jīng)鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthases, SMSs)的作用轉(zhuǎn)化成SM。在哺乳動物中，SMS有兩種同工酶即神經(jīng)鞘磷脂合成酶1(sphingomyelin synthase 1, SMS1)和神經(jīng)鞘磷脂合成酶2(sphingomyelin synthase 2, SMS2)。SMS1主要存在于細胞高爾基體，而SMS2則主要存在于細胞膜上[2]。細胞膜上除了富含SMS2外，還富含神經(jīng)鞘磷脂酶(sphingomyelinases，SMases)它可以將SM水解為神經(jīng)酰胺。細胞膜上的神經(jīng)酰胺和SM都可以通過外

泌作用進入血漿中，因此SMS2和神經(jīng)鞘磷脂酶在維持細胞和血漿中神經(jīng)酰胺和SM水平的平衡中起著重要作用[3]。有研究表明，SMS2的缺失或失活可使神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化合成SM的途徑受阻，進而血漿中SM的水平降低，神經(jīng)酰胺水平升高[4,5]。血漿中神經(jīng)酰胺水平升高還與2型糖尿病肥胖患者胰島素抵抗嚴重程度之間有著很強的相關(guān)性[6]。另有研究表明，鞘脂類化合物還參與應(yīng)激及死亡配體誘導(dǎo)的肝細胞凋亡[7]。另外在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理變化中也觀察到有細胞內(nèi)SMSs和SMases兩種酶活動的失調(diào)[8]。在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者額顳區(qū)灰質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)酰胺水平的升高和SM濃度的下降[9]。AD病人最典型的癥狀就是學(xué)習記憶能力的下降。Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)實驗是一種強迫實驗動物游泳，學(xué)習尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，可用于測試實驗動物學(xué)習記憶能力之一的空間學(xué)習記憶能力。在MWM實驗中，搜索策略是動物尋找平臺所采用的游泳方式，在訓(xùn)練早期動物可能采用非空間策略發(fā)現(xiàn)平臺，而在隨后的訓(xùn)練中動物會逐漸采用空間策略，因為采用這種搜索策略尋找平臺最為有效。這種搜索策略的改變是需要動物海馬和前額皮質(zhì)參與的高級神經(jīng)活動。因此我們猜測SMS2缺乏導(dǎo)致神經(jīng)酰胺在學(xué)習與記憶相關(guān)腦區(qū)內(nèi)的堆積，可能會進一步對動物的學(xué)習記憶能力造成一定的影響。本研究利用SMS2基因敲除模型，采用MWM測試方法,分析神經(jīng)酰胺和SM對小鼠學(xué)習記憶以及高級神經(jīng)活動的影響，為人們認識神經(jīng)酰胺及SM的生理作用提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗所用實驗動物是由美國紐約州立大學(xué)動物實驗中心引進的SMS2基因敲除雜合子小鼠(SMS+/-)經(jīng)過雜交、回交和互交等方法進行繁殖獲得。通過提取小鼠的DNA，經(jīng)過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠的基因型，獲得SMS2+/+和SMS2-/-基因型小鼠。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食水和食物。飼養(yǎng)室溫度控制在20～25℃，采光控制為12 h光照，12 h黑暗。測試前依據(jù)基因型(SMS2+/+, SMS2-/-)分別分組為野生型小鼠(Wild type, WT)和SMS2基因敲除小鼠(Knockout, KO)。每組小鼠各10只，均為黑色成年雄性小鼠。

1.2 Morris水迷宮行為學(xué)測試

本實驗使用成都泰盟科技有限公司制造的MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，圓形反應(yīng)水箱直徑為80 cm，逃逸平臺直徑為5 cm，箱內(nèi)盛水，水溫為室溫攝氏25℃左右，平臺置于水面下1 cm。在水中加入白色顏料以避免動物看清水下平臺。攝像機位于水池中央上方200 cm，用于記錄動物的位置、時間、游泳距離和以及游泳路徑等。

實驗分為定位航行試驗(place navigation)和空間探索試驗(spatial probe)兩個階段。定位航行試驗歷時7 d，首先將小鼠置于水迷宮測試所在房間30 min以適應(yīng)環(huán)境。將水池分為4個象限，平臺置于第三象限，每天將小鼠面向池壁分別從4個象限之一輕輕放入水中。每天每只小鼠訓(xùn)練2次, 時間間隔大于30 min。實驗時設(shè)定小鼠游泳時間為60 s，若小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，人為地引導(dǎo)小鼠找到平臺，潛伏期記為60 s。小鼠登上平臺后，讓其在平臺上停留10 s。記錄每天每組小鼠潛伏期、游泳距離、游泳速度和游泳軌跡。依據(jù)記錄的小鼠游泳軌跡可將小鼠對平臺的搜索分為空間搜索策略和非空間搜索策略。如圖1所示，空間搜索策略是指小鼠采用直接游向目標象限或者最多用一圈路程便游向平臺的模式。非空間搜索策略包括系統(tǒng)搜索策略和重復(fù)環(huán)繞策略。系統(tǒng)搜索策略是指小鼠系統(tǒng)地搜索水池而對目標象限沒有清晰的空間定位，屬于一種“地毯式”搜索；而重復(fù)環(huán)繞策略是指小鼠不停地以環(huán)狀軌跡沿著水池邊游泳的模式來搜索平臺。由于空間搜索策略對目標象限有較清晰的定位，該策略優(yōu)于非空間搜索策略。

空間探索試驗(spatial probe)于第8天進行，將平臺撤除，將動物由原先平臺象限的對側(cè)放入水中，游泳60 s。記錄和小鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)、游泳距離、平均游泳速度及目標象限滯留時間占總時間的百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

每只小鼠每天兩次測量結(jié)果的算術(shù)平均值作為小鼠當天的實驗數(shù)據(jù)，每組10只小鼠每天的實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤(mean±SEM)表示。定位航行試驗重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，空間探索試驗數(shù)據(jù)采用t檢驗。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果

2.1 定位航行試驗

兩組小鼠7 d定位航行試驗訓(xùn)練結(jié)果分析見表1。WT小鼠和KO小鼠尋找平臺的潛伏期和游泳距離隨著時間的延長均明顯縮短，雙因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析顯示，時間因素(day) 主效應(yīng)明顯(P<0.001)，表明兩組小鼠的空間學(xué)習記憶能力隨著時間的延長而逐漸提高。分組因素的檢驗結(jié)果顯示分組因素無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明兩組小鼠的空間學(xué)習記憶能力沒有差異。對兩組小鼠的平均游泳速度進行方差分析表明兩組小鼠之間每天的平均游泳速度并無顯著性差異(P>0.05)，表明兩組小鼠在體力上不存在顯著性差異。

2.2 兩組小鼠對平臺搜索策略的比較

對小鼠游泳軌跡進行平臺搜索策略分類，兩組小鼠每天定位航行試驗訓(xùn)練中搜索策略占總策略的百分比分布圖分別見圖2A和圖2B。對定位航行試驗訓(xùn)練中7 d內(nèi)兩種小鼠三種搜索策略平均百分比進行分析(圖3)，結(jié)果表明WT小鼠采用空間策略百分比明顯高于KO小鼠(P<0.05)，而KO小鼠采用重復(fù)環(huán)繞策略百分比明顯高于WT小鼠(P<0.05)。在搜索策略的選擇上，WT小鼠的搜索策略以更有效的空間搜索策略為主，優(yōu)于KO小鼠。

Tab. 1 The performance of the WT and KO mice during the place navigation trials over 7-day training (mean±SEM)

WT: Wild type; KO: Knockout

Fig. 1 Three typical swim-tracking paths used by the mice during the place navigation training phase A: Spatial search; B: Systematic search; C: Repetitive loop

Fig. 2 Distribution of search strategies used by mice over 7-day trials A: Search strategies used by wild type mice; B: Search strategies used by knockout mice

2.3 空間探索試驗

3 討論

神經(jīng)酰胺和SM是構(gòu)成各種生物膜結(jié)構(gòu)的兩種重要的鞘脂類化合物，他們通過SMS2和神經(jīng)鞘磷脂酶在細胞膜內(nèi)進行神經(jīng)酰胺/SM循環(huán)，進而調(diào)節(jié)兩種鞘脂類化合物在細胞膜和血漿中的平衡狀態(tài)。本研究觀察SMS2酶缺乏對成年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高級活動-學(xué)習記憶能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMS2酶缺乏對小鼠在水迷宮中的空間學(xué)習記憶能力沒有影響，但卻影響小鼠的平臺搜索策略，SMS2缺乏小鼠采用空間搜索策略的比例下降。

神經(jīng)酰胺和SM作為兩種重要的鞘脂參與應(yīng)激和細胞凋亡等多種生理和病理過程[1]。在肝豆狀核變性疾病中，高濃度的Cu2+可以激活酸性神經(jīng)鞘磷脂酶和升高血漿中神經(jīng)酰胺水平，導(dǎo)致肝細胞和紅細胞凋亡的發(fā)生[10]。而肝細胞和紅細胞的功能正常對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的營養(yǎng)和氧氣來源具有重要作用，肝豆狀核變性疾病中的神經(jīng)和精神癥狀表現(xiàn)也可能和血漿中升高的神經(jīng)酰胺水平有關(guān)。對一組健康婦女9年的跟蹤研究表明，志愿者血清中神經(jīng)酰胺水平升高與AD發(fā)生風險之間存在著強烈的相關(guān)性[11]。我們猜想SMS2缺乏可能會對高級神經(jīng)系統(tǒng)的活動學(xué)習記憶產(chǎn)生影響。然而本研究并沒有發(fā)現(xiàn)SMS2缺乏對小鼠的學(xué)習記憶能力有顯著的影響。推測其原因可能有以下幾個方面：首先，對于鼠類來說，空間記憶是依賴于海馬的陳述性記憶，內(nèi)側(cè)顳葉包括海馬、嗅皮層和旁海馬皮層在這一過程中起著重要作用。SMS2缺乏雖然會影響血漿中神經(jīng)酰胺和SM的平衡，但是并沒有顯著改變細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺和SM水平[3]。因而有可能這些腦區(qū)的的功能沒有受到較大的影響。SMS2缺乏小鼠潛伏期隨著時間的延長明顯下降表明小鼠可以對平臺位置形成良好的記憶。由于兩組小鼠在游泳速度上并無差異，因此兩組小鼠學(xué)習記憶能力并沒有受到體力改變等外界因素的影響。其次，有研究表明SMS2酶缺乏對動脈粥樣硬化也有有利的一面，SMS2酶缺乏可以降低小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生[12-14]，也可以增加胰島素的敏感性和減緩高脂飲食誘發(fā)的肥胖[15]，因此SMS2缺乏導(dǎo)致的血漿中神經(jīng)酰胺和SM平衡的改變是否會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生顯著的影響還需要更多的實驗研究。最后需要指出的是，本研究采用Morris水迷宮實驗來評價實驗動物的學(xué)習記憶能力，但是水迷宮實驗也易受到多種因素的影響。有研究表明，老年小鼠空間學(xué)習記憶能力下降，慢性應(yīng)激對老年小鼠的空間學(xué)習記憶能力的影響較青年小鼠更為顯著[16]。本實驗只針對成年雄性小鼠進行研究，那么隨著年齡的增加SMS2缺乏是否會對小鼠的學(xué)習記憶能力有顯著性影響還有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)SMS2缺乏對小鼠的更高級的神經(jīng)活動有一定的影響，在搜索策略方面，野生小鼠主要以空間搜索策略搜尋平臺，而SMS2缺乏小鼠主要采用空間搜索和重復(fù)環(huán)繞策略來搜尋平臺，從搜索策略優(yōu)越上來看，SMS2缺乏小鼠搜索策略不如野生型小鼠。搜索策略的改變反應(yīng)小鼠行為認知能力的變化，表明SMS2缺乏誘發(fā)的血漿中神經(jīng)酰胺和SM平衡的改變對大腦的更高級的神經(jīng)活動產(chǎn)生了影響。已知AD是一種與年齡相關(guān)的學(xué)習、記憶和認知能力受損的疾病，有研究表明在AD發(fā)病的早期額葉皮層內(nèi)與脂筏相結(jié)合的SM水平顯著降低[17]。這些腦區(qū)的輕度受損都有可能影響到動物的行為認知能力。具體SMS2缺乏會影響到哪一個或者哪些腦區(qū)? 都還有待于進一步的研究。

總之，SMS2缺乏雖不能影響小鼠的學(xué)習記憶能力，但卻影響到小鼠對搜索策略的選擇，SMS2缺乏對動物各個系統(tǒng)的影響是復(fù)雜的。在臨床實踐中，理解循環(huán)系統(tǒng)或者細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺和SM水平改變對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用、作用部位及其潛在的影響，對于早期發(fā)現(xiàn)血液中兩種物質(zhì)水平的異常，以及預(yù)防和治療與記憶認知有關(guān)的老年性疾病具有重要意義。

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2016-06-30

2016-12-15

R338.2

A

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