于泊洋， 張 磊， 楊 錚， 劉陶迪

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心身醫(yī)學(xué)研究室， 呼和浩特 010110)

雄激素受體在大鼠睪丸中轉(zhuǎn)錄模式的分析*

于泊洋， 張 磊， 楊 錚， 劉陶迪△

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心身醫(yī)學(xué)研究室， 呼和浩特 010110)

目的：研究Ar(雄激素受體)基因在大鼠睪丸組織中的轉(zhuǎn)錄模式。方法：取剛出生的雄性Wistar大鼠，于出生2～65日的不同時(shí)間點(diǎn)，脊椎脫臼處死3只不同窩別的幼鼠，提取睪丸組織總mRNA；將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后采用Real-time PCR方法檢測(cè)大鼠睪丸組織中Ar mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果：Ar mRNA表達(dá)在出生后第2天開(kāi)始緩慢上升到第16天達(dá)到最高值，第16天到第30天迅速下降，第31天出現(xiàn)一個(gè)小高峰后到第65天持續(xù)緩慢下降。結(jié)論：Ar基因在大鼠早期發(fā)育睪丸組織中表達(dá)量逐漸升高，可能與精原干細(xì)胞的增殖及初級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)生相關(guān)。

雄激素受體; 精子發(fā)生; 精原干細(xì)胞; 初級(jí)精母細(xì)胞; 大鼠

androgen receptor; spermatogenesis; spermatogonial stem cells; primary spermatocyte

【DOI】 10.12047/j.cjap.5467.2017.041

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，10%的已婚夫婦患有不育癥，其中男性因素約占50%，其中因無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥所引起的男性不育占11.2%[1]男性不育癥已經(jīng)是人類(lèi)生殖研究的重要課題。目前男性生殖醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究還無(wú)法滿(mǎn)足臨床診治的需求，因此必須大力加強(qiáng)生殖醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究, 以解決男性不育患者的臨床診治問(wèn)題。導(dǎo)致男性不育的原因非常多，其中精子發(fā)生過(guò)程中基因缺陷可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，男性不育癥的研究也深入到分子水平，研究精子發(fā)生分子機(jī)理是解決男性不育的重要分支[2]。

睪丸是精子發(fā)生的場(chǎng)所，精子發(fā)生是由數(shù)量眾多的基因協(xié)同控制的復(fù)雜的細(xì)胞分化過(guò)程，這一過(guò)程的每一階段都受到眾多基因的共同作用。而根據(jù)Wrobel G等[3]研究結(jié)果顯示，大鼠睪丸的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程為：出生后0～8 d主要以精原干細(xì)胞的自我更新和分化為主；出生后14 d左右減數(shù)分裂開(kāi)始，此時(shí)初級(jí)精母細(xì)胞出現(xiàn)；出生20 d之后進(jìn)入圓形精子發(fā)生階段，第二次減數(shù)分裂剛剛完成，此時(shí)圓形精子首

次出現(xiàn)；出生35 d后完成圓形精子向長(zhǎng)形精子的變形，成熟的精子出現(xiàn)；出生56 d后大鼠性成熟，達(dá)到成年?duì)顟B(tài)[3,4]。

Ar是近些年來(lái)生殖生物學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一, 體內(nèi)外形態(tài)與細(xì)胞水平研究結(jié)果表明, 該受體與精子發(fā)生密切相關(guān)[5-9]。AR屬于核受體超家族中的類(lèi)固醇受體。AR一般由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(N transcription activation domain, NTD)、DNA結(jié)合區(qū)(DNA binding domain,DBD)、鉸鏈區(qū)(hinge region,HJ)和配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain, LBD)。雄激素受體是雄激素作用的中介物質(zhì)。雄激素受體為分子量120 000道爾頓的蛋白質(zhì)，在人體的X染色體的基因指導(dǎo)下合成，與雄激素結(jié)合的單聚體(4.4S)在細(xì)胞中與受體蛋白及一個(gè)產(chǎn)生9S無(wú)活性的小分子單聚體結(jié)合[6,10]。

本研究選用2～65日齡的雄性大鼠睪丸組織，提取其總mRNA并反轉(zhuǎn)成cDNA，采用Real-time PCR進(jìn)行mRNA水平檢測(cè)Ar基因在大鼠睪丸組織中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究Ar在精子發(fā)生過(guò)程中的功能提供依據(jù), 并為進(jìn)一步對(duì)Ar相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及尋求解決方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑均購(gòu)自大連寶生物公司，引物均由上海生物工程公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)買(mǎi)育齡Wistar大鼠，將一只雄鼠與兩只雌鼠合籠(內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi))，自然交配。內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)樓分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，每周換墊料一次，保證飼料和飲水的清潔和充足。記錄鼠出生的具體時(shí)間。出生當(dāng)天計(jì)第一天。飼養(yǎng)，足夠日齡后處死，立即取下睪丸組織樣品，立刻放入-80℃低溫冰箱中冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)樣本采集

以出生當(dāng)天計(jì)第一天，將出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65日齡的雄性大鼠脊椎脫臼法處死，取睪丸組織立刻放入-80℃低溫冰箱中冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只不同窩別的大鼠。

提取組織總RNA，取約50 mg睪丸組織，加入裂解液1 ml，先加300 μl將組織剪碎，再加700 μl用一次無(wú)菌性注射器沖打混勻，充分裂解后，采用總RNA提取試劑盒(TIANGEN，DP419)按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取完成后分裝出2 μl用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度(Conc)和純度(A260∶A280比值)，以A260/A280接近2.0為合格。將提取的各樣品總RNA置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。一周?nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

根據(jù)各樣品總RNA的濃度和純度值，將樣品稀釋成終體積為30 μ1，濃度為0.2 μg的稀釋液，取相同體積的各組樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μl：A液10 μl：樣品總RNA 4 μl，Oligo(dT)(10 μmol/L)1 μl，Rnase-Free dH20補(bǔ)齊至10 μl；B液10 μl：5×M-MLV buffer 4 μl，dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μl，RNase Inhibiter(40 U/μl)1 μl，M-LV Reverse Transcriptase(5 U/μl)0.5 μl，RNase．Free ddH2O 2.5 μl。反應(yīng)條件為：A液65℃水浴5 min，將A液與B液混合，渦旋離心后，42℃水浴60 min，72℃水浴10 min。將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Ar基因引物設(shè)計(jì)

引物序列表見(jiàn)表1。

Tab. 1 List of oligonucleotide primers

1.6 Real-time PCR方法檢測(cè)Ar的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶以1.0 μg RNA模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，分別取大鼠出生第2、4、6、8、l0、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天21個(gè)cDNA模板樣品進(jìn)行Ar基因的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)，使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明及引物的條件設(shè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀上重復(fù)兩管。用GAPDH做內(nèi)參對(duì)照，用H2O做陰性對(duì)照。采用Ct方法分析Ar mRNA的表達(dá)量，結(jié)果用基因mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)表示，計(jì)算方法用2-△△Ct法，數(shù)據(jù)和圖表使用Microsoft Excel 分析[11]。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測(cè)Ar基因在三組不同窩別大鼠早期發(fā)育睪丸組織中mRNA水平的表達(dá)情況

根據(jù)引物的溶解曲線可知，其特異性好(圖1 A，C)。擴(kuò)增曲線在PCR平臺(tái)期幾乎重合(圖1 B，D)。

通過(guò)Real-time PCR反應(yīng)檢測(cè)到Ar基因在三組不同窩別的大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天睪丸組織中的表達(dá)模式(圖2)，三組不同窩別的大鼠睪丸組織mRNA水平表達(dá)趨勢(shì)基本一致；第2～65天的大鼠睪丸組織mRNA表達(dá)差異明顯。Ar mRNA表達(dá)在出生后第2天開(kāi)始緩慢上升到第16天達(dá)到最高值，在第16天到第30天迅速下降，第31天出現(xiàn)一個(gè)小高峰之后到第65天持續(xù)緩慢下降。其中出生第16天為大鼠睪丸組織Ar 基因mRNA表達(dá)峰值。

Fig. 1 Dissolution profile and amplification curve of Ar and GAPDH A: Dissolution profile of Ar; B: Amplification curve of Ar; C: Dissolution profile of GAPDH; D: Amplification curve of GAPDH

Fig. 2 The mRNA expression of cxcl6 gene in 3 different nest on post-natal days 2,4,6,8,10,12,14,15,16,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65

3 討論

在精子發(fā)生的整個(gè)過(guò)程中精原干細(xì)胞需通過(guò)3個(gè)階段成為成熟精子：第一階段，精原干細(xì)胞位于生精上皮的基底部，根據(jù)其命運(yùn)分為暗型精原細(xì)胞(dark type A，Ad)和亮型精原細(xì)胞A(pale type A, Ap)兩種不同的類(lèi)型。在正常情況下，Ad型精原細(xì)胞僅發(fā)生有絲分裂進(jìn)行增殖而作為精原干細(xì)胞的儲(chǔ)備；而Ap型精原細(xì)胞一般分裂為兩個(gè)B型精原細(xì)胞，進(jìn)一步分裂增殖為次級(jí)精母細(xì)胞。第二階段，精母細(xì)胞經(jīng)歷兩次減數(shù)分裂，第一次減數(shù)分裂后產(chǎn)生初級(jí)精母細(xì)胞。次級(jí)精母細(xì)胞在第二次減數(shù)分裂后變?yōu)閱伪扼w的圓形精子細(xì)胞。第三階段：圓形精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化變化，細(xì)胞核發(fā)生聚縮和塑性，同時(shí)頂體和鞭毛形成，胞漿明顯擴(kuò)張，最終轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)形的成熟精子[12-14]?？傊?，精子發(fā)生主要分為3個(gè)階段：精原干細(xì)胞的自我更新與分化階段，減數(shù)分裂階段和精子生成階段[15-17]。

研究表明, Ar與男性精子生成障礙有密切關(guān)系[5-9], 精子發(fā)生的啟動(dòng)和維持需要依賴(lài)下丘腦一垂體一睪丸軸的功能。體內(nèi)環(huán)境下,睪酮通過(guò)Ar的介導(dǎo)直接作用于支持細(xì)胞發(fā)揮作用,當(dāng)Ar與配體結(jié)合后,空間構(gòu)象發(fā)生變化而發(fā)生活化,活化后的Ar以二聚體的形式與靶細(xì)胞核中的雄激素效應(yīng)元件結(jié)合,并使其轉(zhuǎn)錄因子相互作用,從而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),產(chǎn)生效應(yīng)[18]。但Ar在精子發(fā)生的哪些階段發(fā)揮作用及如何發(fā)揮作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，出生后2～10 d為大鼠青春前期精原干細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期，出生15 d前后為大鼠精母細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期，出生30 d前后為大鼠圓形精子發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Ar基因在大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的表達(dá)模式的檢測(cè)，可以看到，Ar基因在大鼠出生早期，轉(zhuǎn)錄水平是呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的，在我們的研究中，Ar mRNA表達(dá)在出生后第2天開(kāi)始緩慢上升到第16天達(dá)到最高值，在第16天到第30天迅速下降，第31天出現(xiàn)一個(gè)小高峰之后到第65天持續(xù)緩慢下降。其中出生第16天為大鼠睪丸組織Ar 基因mRNA表達(dá)峰值。

劉陶迪等[19]主要以出生第2天至第30天大鼠的睪丸組織為研究對(duì)象，研究精子發(fā)生早期相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)。對(duì)大鼠早期發(fā)育睪丸組織精子發(fā)生的基因進(jìn)行差異性表達(dá)分析，結(jié)果在大鼠出生后第6天至第10天期間，精原干細(xì)胞標(biāo)志性基因CDH1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)顯著變化，表明該時(shí)期是大鼠精原干細(xì)胞的增殖分化的關(guān)鍵時(shí)期。Ar mRNA水平從出生第2～8天緩慢上升，這一時(shí)期為精原干細(xì)胞增殖期，可據(jù)此推測(cè)Ar在精原干細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。Ar mRNA水平的這種緩慢上升趨勢(shì)從第8天繼續(xù)持續(xù)到第16天，根據(jù)Wrobel G等的研究結(jié)果，這一時(shí)期為初級(jí)精母細(xì)胞的形成期，我們可以推測(cè)Ar可能參與初級(jí)精母細(xì)胞的生成過(guò)程。在第16天達(dá)到峰值后Ar mRNA水平開(kāi)始下降，表明從第一次減數(shù)分裂以后，Ar在圓形精子的形成等過(guò)程中不再發(fā)揮明顯的作用。

我們將Ar基因做mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的檢測(cè)，3組不同窩別的Ar基因mRNA表達(dá)水平基本一致，隨著大鼠早期精子發(fā)生的進(jìn)行，2～65 d呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平，表達(dá)量的高低及對(duì)應(yīng)的出生時(shí)間點(diǎn)表明Ar基因可能參與精原干細(xì)胞的增殖及初級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)生。通過(guò)以上結(jié)果我們得到如下結(jié)論：(1)Ar基因表達(dá)與精子發(fā)生具有一定的相關(guān)性。(2)Ar基因在大鼠早期發(fā)育睪丸組織中表達(dá)量逐漸升高，與精原干細(xì)胞的增殖及初級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)生相關(guān)。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究Ar在精子發(fā)生過(guò)程中的功能提供依據(jù), 并為進(jìn)一步對(duì)Ar相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及尋求解決方法提供依據(jù)。

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2016-06-27

2016-12-14

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