伊雪，楊學慧，楊述亮，石鶯，鄔鵬宇，王耕銀，陳乃耀，高木火，高毅哲，李占清

[1.廈門醫(yī)學院 病理與病理生理學教研室，福建 廈門 361008；2.華北理工大學附屬醫(yī)院 胸心外科，河北 唐山 063000；3.福建省廈門市第二醫(yī)院（廈門醫(yī)學院附屬醫(yī)院）胸心外科，福建 廈門 361021]

Akt/GSK-3β通路介導調(diào)控萊菔硫烷減輕心臟移植缺血再灌注損傷的研究*

伊雪1，楊學慧2，楊述亮2，石鶯1，鄔鵬宇2，王耕銀2，陳乃耀2，高木火3，高毅哲3，李占清3

[1.廈門醫(yī)學院 病理與病理生理學教研室，福建 廈門 361008；2.華北理工大學附屬醫(yī)院 胸心外科，河北 唐山 063000；3.福建省廈門市第二醫(yī)院（廈門醫(yī)學院附屬醫(yī)院）胸心外科，福建 廈門 361021]

目的探討蛋白激酶B（Akt）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信號通路對萊菔硫烷（SFN）預處理減輕大鼠心肌冷缺血再灌注損傷（IRI）的作用機制。方法64例健康雄性SD大鼠隨機分為4組：IRI組、SFN組、阻滯劑LY294002+IRI（LY+IRI）組、阻滯劑LY294002+SFN預處理（LY+SFN）組，將冷藏于心肌保護液（組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液）9 h的供體心臟移植到受體大鼠的腹腔，復制同種大鼠異體異位心臟移植模型，術(shù)后24 h取供體心臟心肌組織，采用免疫組織化學法（IHC）和Western blot檢測Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、GSK-3β、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）蛋白的表達。結(jié)果IHC法和Western bolt檢測各種蛋白結(jié)果顯示，與IRI組比較，SFN組p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達升高（P<0.05）。應用阻滯劑LY294002后，SFN+LY組與LY+IRI組的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論SFN能通過Akt/GSK-3β信號通路減輕心臟移植心肌冷缺血再灌注損傷。

蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β通路；萊菔硫烷；心臟移植；冷缺血再灌注損傷

心臟移植缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是不可避免的。如何減輕心臟移植的缺血再灌注損傷，提高患者遠期存活率是目前研究的焦點之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，萊菔硫烷（Sulforaphane，SFN）通過抗凋亡、抗氧化作用能減輕心臟移植供體心臟冷缺血再灌注損傷[1-2]，但機制不甚清楚。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/糖原合成激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）通路作為細胞內(nèi)重要信號通路在心肌暖缺血再灌注損傷中的保護作用已得到證實[3-5]。然而，Akt/GSK-3β通路在SFN減輕心肌缺血再灌注損傷的作用機制還不得而知。故本實驗擬通過復制大鼠異體異位心臟移植模型，探討SFN是否通過Akt/GSK-3β通路減輕供體心臟冷缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

近交系健康雄性SD大鼠64例（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXX京2011-007），體重220～250 g，SPF清潔級。SFN購于美國LKT實驗室，LY294002（PI3K阻滯劑）購自美國Cayman公司，組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液（histidine-tryptophan-ketoglutarate，HTK）購自德國克勒化學試劑公司，PV-600免疫組織化學二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司，兔Akt、磷酸化Akt（以下簡稱p-Akt）多克隆抗體購自美國Abcam公司。GSK-3β、磷酸化GSK-3β（以下簡稱p-GSK-3β）多克隆抗體均購自香港Affinity公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶劑購于美國Sigma公司。

1.2 模型復制

按照李占清等[1]描述的方法進行動物模型復制。步驟如下：①麻醉。10%水合氯醛3～4 ml/kg腹腔注射，麻醉SD大鼠。②供體心臟制備。用4℃生理鹽水35 ml和HTK液15 ml先后對供體心臟進行沖洗并取出置于20ml 4℃ HTK液中保存9h。③受體移植。將供體心臟的升主動脈、肺動脈分別與受體大鼠的腹主動脈、下腔靜脈端側(cè)吻合，開放循環(huán)，心臟復跳，檢查無出血后關腹。④標本采集。移植后24 h處死動物，取其供體心臟的心肌組織，一部分石蠟包埋待組織學和免疫組織化學檢測，一部分置于-80℃深低溫冰箱中冷凍待Western blot檢測。

1.3 實驗分組

64例健康雄性SD大鼠隨機分為4組（每組供、受體各8例），①IRI組：受體在移植前24 h經(jīng)尾靜脈注射1%DMSO 0.3 ml；②SFN組（萊菔硫烷預處理組）：受體在移植前24 h經(jīng)尾靜脈注射SFN（溶于DMSO溶劑）2.5 mg/kg；③LY+IRI組（阻滯劑LY2940 02+IRI組）：受體于注射1%DMSO前30 min及移植前30 min分別經(jīng)鼠尾靜脈注射LY294002（溶于1%DMSO）0.3 mg/kg，余同IRI組；④LY+SFN組（阻滯劑LY294002+菔硫烷預處理組）：受體于注射SFN前30 min及移植前30 min分別經(jīng)鼠尾靜脈注射LY294002 0.3 mg/kg，余同SFN組。

1.4 檢測指標

1.4.1 免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）半定量分析Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達 按照試劑盒說明書，采用PV-6001免疫組織化學二步法檢測Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β的蛋白表達。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，放入沸騰的檸檬酸鹽緩沖液中抗原熱修復5 min，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶后磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，3 min/次，分別滴加兔多克隆抗體Akt（1∶50）、p-Akt（1∶50）、GSK-3β（1∶200）、p-GSK-3β（1∶200），置于4℃冰箱冷凍過夜，次日滴加PV-6001試劑，37℃溫箱孵育40 min，PBS沖洗3次，3 min/次，行二氨基聯(lián)苯氨顯色5～6min后蒸餾水充分洗滌，再行蘇木素復染1min后流水沖洗30 min，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；用已知陽性組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，光鏡下觀察，心肌細胞細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。于400倍鏡下，每張切片取5個視野，按照伊雪等[6]的免疫組織化學評分法，結(jié)合陽性細胞百分比及陽性細胞染色程度進行評分，取均值表示該蛋白表達。

1.4.2 Western bolt檢測Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達 蛋白提?。喝〕隼鋬龉w心臟組織，切取100 mg放入冰上已編號的離心管（eppendorf tubes，EP）管中，加入混勻的細胞裂解液1 ml，用勻漿器打碎，置于4℃、11 000 r/min離心10 min，并用微量槍析出上清液備用。應用聚氰基丙烯酸正丁酯法蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度（A液∶B液=50∶1，混勻）并用上樣緩沖液配平，配制12%分離膠注入制膠玻璃板待凝固，再次注入5%濃縮膠并插梳子，凝固后拔出梳子并滴加上樣蛋白（50μg/孔），放入電泳槽進行電泳，用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）清洗3次，5 min/次，用5%脫脂奶粉封閉2 h，再次TBST液清洗3次，10 min/次，孵一抗并4℃冰箱過夜，次日TBST液清洗3次，15 min/次，孵二抗2 h，TBST液清洗3次，15 min/次，并顯影，待β-actin（1∶10 000）檢測平衡后，依次檢測Akt、P-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達（均1∶1 500），應用Image JV 1.47H軟件進行條帶灰度值測定。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，應用單因素方差分析（One-way，ANOVA），若方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 移植后24 h供體心臟心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達

各組Akt、GSK-3β蛋白表達比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.086和0.493，P=0.951和0.691）；各組p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=48.482和12.805，P=0.000）。SFN組與IRI組的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。應用阻滯劑LY294002后，LY+IRI組與SFN+LY組的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1和圖1、2。

2.2 Western bolt檢測移植后24 h供體心臟心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達

各組Akt、GSK-3β蛋白表達比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意（F=0.076和0.120，P=0.971和0.946）；各組p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.881和18.064，P=0.020和0.001）。SFN組與IRI組的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。應用阻滯劑LY294002后，LY+IRI組與SFN+LY組的p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2和圖3。

表1 移植后24 h供體心臟心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達比較（IHC）（n=8，±s）

表1 移植后24 h供體心臟心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達比較（IHC）（n=8，±s）

注：1）與SFN組比較，P<0.05；2）與IRI組比較，P<0.05；3）與LY+ SFN組比較，P<0.05

組別p-GSK-3β IRI組 4.25±0.16 5.30±0.371） 4.77±0.33 4.37±0.311）SFN組 4.32±0.23 7.27±0.402）3） 4.94±0.24 5.29±0.352）3）LY+IRI組 4.27±0.26 5.00±0.381） 4.95±0.21 4.47±0.221）LY+SFN組 4.27±0.16 5.25±0.361） 4.85±0.36 4.43±0.241）F值 0.086 48.482 0.493 12.805 P值 0.951 0.000 0.691 0.000 Akt p-Akt GSK-3β

圖1 心臟移植后24 h各組供體心臟心肌組織p-Akt蛋白的表達 （IHC×400）

圖2 心臟移植后24 h各組供體心臟心肌組織p-GSK-3β蛋白的表達 （IHC×400）

表2 移植后24 h供體心臟心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達比較（Western bolt）（n=8，±s）

表2 移植后24 h供體心臟心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達比較（Western bolt）（n=8，±s）

注：1）與SFN組比較，P<0.05；2）與IRI組比較，P<0.05；3）與LY+ SFN組比較，P<0.05

組別p-GSK-3β IRI組 1.21±0.05 1.00±0.061） 1.12±0.15 0.96±0.231）SFN組 1.25±0.09 1.53±0.032）3） 1.15±0.16 1.75±0.062）3）LY+IRI組 1.21±0.04 0.98±0.081） 1.16±0.10 0.97±0.171）LY+SFN組 1.23±0.09 0.98±0.111） 1.09±0.15 0.98±0.181）F值 0.076 5.881 0.120 18.064 P值 0.971 0.020 0.946 0.001 Akt p-Akt GSK-3β

圖3 心臟移植后24h供體心臟心肌組織Akt、p-Akt、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達（Western bolt）

3 討論

GSK-3β作為細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路主要的下游靶分子，屬絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，GSK-3有 2種高度同源異構(gòu)體（GSK-3α、GSK-3β）。GSK-3α主要調(diào)節(jié)肝糖原代謝；GSK-3β主要調(diào)節(jié)骨骼肌、心臟糖原合酶的代謝。目前研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β具有調(diào)節(jié)細胞功能、物質(zhì)代謝及維持細胞骨架完整性的作用[7-9]。對于GSK-3β的調(diào)節(jié)主要是通過GSK-3β的磷酸化、非磷酸化狀態(tài)及與GSK-3β結(jié)合蛋白的相互作用而實現(xiàn)。GSK-3β的激活主要是通過N-末端的絲氨酸殘基Ser9的磷酸化實現(xiàn)，但激活后GSK-3β的生物活性卻明顯降低甚至喪失，即磷酸化GSK-3β處于失活狀態(tài)。GSK-3β的激活受體內(nèi)多種激酶的調(diào)節(jié)，其中最主要的是來自于上游Akt的調(diào)節(jié)[10-11]。因此，許多對細胞存活起調(diào)節(jié)作用的因子能夠通過PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的介導作用于GSK-3β，使其磷酸化，從而抑制其生物學活性，最終達到促細胞生存的目的。大量研究發(fā)現(xiàn)，預處理、后處理及藥物處理等均可通過激活PI3K/Akt信號通路進而使GSK-3β磷酸化失活，從而對IRI的心肌起保護作用[10-14]。因此激活PI3K/Akt/GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路將是保護IRI組織及細胞的新思路。根據(jù)本實驗結(jié)果，SFN可能是通過激活Akt，失活下游靶因子GSK-3β，從而對心肌的冷IRI起保護作用。因此筆者認為在心臟移植中，SFN可能是通過激活Akt/GSK-3β信號通路對心肌冷IRI起保護作用。但SFN抗凋亡、抗氧化作用的機制尚需進一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Sulforaphane preconditioning attenuates myocardial cold ischemia reperfusion injury of heart transplantation of rats through Akt/GSK-3β signaling pathway*

Xue Yi1,Xue-hui Yang2,Shu-liang Yang2,Ying Shi1,Peng-yu Wu2,Geng-yin Wang2, Nai-yao Chen2,Mu-huo Gao3,Yi-zhe Gao3,Zhan-qing Li3
[1.Department of Pathology and Pathophysiology,Xiamen Medical College,Xiamen,Fujian 361008,China;2.Department of Cardiothoracic Surgery,the Affiliated Hospital,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;3.Department of Cardiothoracic Surgery,the Second Hospital of Xiamen(the Affiliated Hospital of Xiamen Medical College),Xiamen,Fujian 361021,China]

ObjectiveTo explore the role of Akt/Gsk-3β signaling pathway in sulforaphane(SFN)protecting rats from cold myocardial ischemia-reperfusion injury during heart transplantation.Methods Sixty-four health male Sprague-Dawley (SD)rats were randomly divided into 4 groups,i.e.ischemia reperfusion injury group (IRI group),sulforaphane group (SFN group),LY294002+ischemia reperfusion injury (LY+IRI group),and LY294002+sulforaphane group (LY+SFN group).Isogeneic heterotopic heart transplantation model was estab－lished according to Li's method.Donor hearts storaged in histidine-tryptophan-ketoglutarate solution for 9 h were transplanted into the abdominal cavities of recipient rats to establish rat models of heterotopic heart transplantation.Akt,p-Akt,GSK-3β and p-GSK-3β protein expressions in the grafts were detected by immunohistochemistry and Western bolt 24 h after reperfusion.ResultsCompared with the IRI group,p-Akt and p-GSK-3β levels increased in the SFN group(P<0.05).After using blocker LY294002,there was no significant difference in the expression of p-Akt or p-GSK-3β between the LY+SFN group and the LY+IRI group (P>0.05).ConclusionsSFN reduces cold ischemia reperfusion injury in heart transplantation of rats through activating Akt/GSK-3β signaling pathway.

Akt/Gsk-3β signaling pathway;sulforaphane;heart transplantation;cold ischemia reperfusion injury

R654.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.002

1005-8982（2017）09-0008-05

2015-10-12

福建省自然科學基金（No：2016D014）；福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題（No：2015-CXB-47）；福建省廈門市科技惠民項目（No：3502Z2016 4057）

李占清，E-mail：zhanqingli@163.com