段輝

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科，遼寧 大連 116001）

TNF-α、IL-1β和LPS誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的研究

段輝

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科，遼寧 大連 116001）

目的體外觀察眼表燒傷后早期的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β），以及晚期的炎癥因子脂多糖（LPS）對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）增殖和凋亡的影響，并為下一步探討眼表燒傷后不同時期炎癥致內(nèi)皮損傷的機制提供理論基礎(chǔ)。方法本實驗隨機分為4組：正常組、TNF-α組、IL-1β組和LPS組。采用活細胞計數(shù)法試劑盒（CCK-8）法測定細胞的增殖活性，臺盼藍排除染色法檢測細胞的增殖數(shù)量，吖啶橙/溴化乙錠（AO-EB）染色法檢測細胞的凋亡，以及采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。結(jié)果①CCK-8法檢測結(jié)果顯示，正常組細胞的增殖活性增高，其余3組細胞的增殖活性下降，且LPS組細胞的增殖活性下降的趨勢大于IL-1β組和TNF-α組，IL-1β組細胞增殖活性下降的趨勢大于TNF-α組；②臺盼藍排除染色法的定量檢測結(jié)果趨勢類似于CCK-8法檢測結(jié)果；③AO-EB染色結(jié)果顯示，正常組細胞被吖啶橙（AO）染成綠色或黃綠色，細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，未見細胞核著橘紅色熒光的凋亡細胞或死亡細胞，而其余3組均可見細胞核著橘紅色熒光的凋亡細胞或死亡細胞。流式細胞儀檢測4組細胞的凋亡率，同樣TNF-α組、IL-1β組和LPS組細胞的凋亡率均高于正常組細胞，且LPS組細胞的凋亡率大于IL-1β組；IL-1β組細胞的凋亡率大于TNF-α組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論早、晚期的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β及LPS均可降低HUVEC的增殖活性，增加其凋亡率，但誘導(dǎo)的程度不同，這可能與不同炎癥介質(zhì)激活的主要分子信號通路不同有關(guān)。

眼燒傷；腫瘤壞死因子-α；白介素1β；脂多糖；內(nèi)皮細胞

眼部燒傷是常見的眼科急癥之一，致病因素有熱燒傷、化學(xué)燒傷和輻射燒傷。無論何種病因，眼前段燒傷后24 h內(nèi)均表現(xiàn)為角結(jié)膜、虹膜及睫狀體等眼前段組織缺血、水腫、廣泛的血栓形成，以及血管內(nèi)皮細胞的壞死。由于嚴重的創(chuàng)傷應(yīng)激，免疫防御系統(tǒng)招募大量炎癥細胞，釋放的大量炎癥介質(zhì)可進一步激活炎癥細胞，導(dǎo)致最初的炎癥信號放大，在體內(nèi)形成瀑布效應(yīng)，從而介導(dǎo)早期的炎癥反應(yīng)綜合征[1]。其次在燒傷后的中、晚期，由于感染大量細菌引發(fā)膿毒癥，導(dǎo)致前房積膿，迅猛進展的角膜潰瘍、穿孔，眼內(nèi)容物脫出，甚至發(fā)生顱內(nèi)及全身感染，介導(dǎo)全身性炎癥反應(yīng)綜合征[2]。燒傷后釋放的各類炎癥因子均可誘導(dǎo)眼部內(nèi)皮細胞發(fā)生損傷、凋亡，導(dǎo)致角膜緣毛細血管網(wǎng)擴張，通透性增強，血漿成分滲出，進一步使眼燒傷局部眼表組織發(fā)生缺血壞死，角膜水腫及混濁[3]。其中內(nèi)皮細胞是介導(dǎo)眼部燒傷病程進展的關(guān)鍵。

燒傷早期的炎癥以無菌性炎癥為主要特點，該時期的炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α（tumor necro sis factor-α，TNF-α）、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素3（Interleukin-3，IL-3）、白介素 6（Interleukin-6，IL-6）及白介素8（Interleukin-8，IL-8）等，其中以TNF-α和IL-1β較為關(guān)鍵，是全身性炎癥反應(yīng)綜合征發(fā)生的始動因素[4]。而燒傷中、晚期并發(fā)的膿毒癥，主要是由革蘭陰性菌引起的，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性細菌細胞壁的一種化學(xué)成分，因此燒傷膿毒癥是以LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為主要特點[5]。因此，本文使用燒傷后早期的代表性炎癥因子TNF-α、IL-1β及燒傷晚期的代表性炎癥因子LPS，體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelia cells，HUVEC），比較各組細胞增殖和凋亡的改變，從而為下一步探討眼燒傷后不同時期炎癥致內(nèi)皮損傷的機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗標本、主要儀器及試劑

1.1.1 實驗標本 HUVEC和內(nèi)皮細胞無血清培養(yǎng)基（endothelial cell medium-serum free，ECM-sf）購置于美國Scien Cell公司。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青鏈雙抗、臺盼藍染色液（美國Gibco公司），二甲亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO），碘化丙啶（propidium iodide，PI）（美國Sigma公司），活細胞計數(shù)法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（日本同仁化學(xué)公司），吖啶橙/溴化乙錠（acridine orange/ethidium bromide，AO-EB）（南京森貝伽生物科技有限公司），TNF-α、IL-1β（美國PeproTech公司），LPS（美國Sigma公司）。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），450型自動酶標儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 HUVEC實驗分組

選取第3～5代HUVEC進行實驗，本實驗分為4組，分別為正常組、TNF-α組（100 ng/ml TNF-α）、IL-1β組（100 ng/ml IL-1β）及LPS組（100 ng/ml LPS）。4組分別處理24、48和72 h后進行一系列指標檢測。

1.3 觀測指標

1.3.1 CCK-8法檢測HUVEC的增殖活性 取第3代HUVEC，按2×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分別更換為各處理液0.2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48和72h取出1個培養(yǎng)板，每孔加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)2 h后于酶標儀上測定450 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。

1.3.2 臺盼藍排除染色法檢測HUVEC的增殖數(shù)量 取第4代HUVEC，按1×105個/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，24 h后分別更換為各處理液1.5 ml，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48和72 h取出1個培養(yǎng)板，收集細胞后行臺盼藍排除染色法計數(shù)各組細胞的數(shù)目。

1.3.3 AO-EB染色檢測HUVEC的凋亡 取第4代HUVEC，按1×105個/孔接種于預(yù)先放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h后分別更換為各處理液1ml；繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h時取出蓋玻片，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）反復(fù)洗滌3次，采用AO-EB染料（100 μg/ml，1︰1）4 μl進行染色，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 流式細胞儀檢測HUVEC的凋亡率 取第5代HUVEC，按8×103個/cm2種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后分別更換為各處理液5 ml培養(yǎng)；第24和48 h時使用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，用75%冰乙醇固定，PBS漂洗重懸細胞，300目尼龍篩網(wǎng)過濾，加入RNA酶處理RNA干擾，加入PI標記細胞，上流式細胞儀檢測4組的細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC的增殖活性

TNF-α組、IL-1β組和LPS組與正常組在培養(yǎng)24、48和72 h的增殖活性比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點細胞增殖的活性有差異（F=180.313，P=0.000）；②TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組的細胞增殖的活性有差異（F= 280.189，P=0.000），TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組比較，細胞增殖活性均下降；③4組的增殖變化趨勢有差異（F=89.866，P=0.000）。見表1和圖1。2.2 HUVEC的增殖數(shù)量

TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組在培養(yǎng)24、48和72h的增殖數(shù)量比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點細胞增殖數(shù)量有差異（F=1.288E4，P=0.000）；②TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組的細胞增殖數(shù)量有差異（F=596.965，P= 0.000），TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組比較，細胞增殖數(shù)量均下降；③4組的增殖數(shù)量變化趨勢有差異（F=6.474，P=0.000）。見表2和圖2。

2.3 HUVEC的細胞凋亡

培養(yǎng)24和48h時，正常組細胞均被吖啶橙（AO）染成綠色或黃綠色，細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，未見細胞核著橘紅色熒光的凋亡細胞或死亡細胞，而其余3組均可見細胞核著橘紅色熒光的凋亡細胞或死亡細胞，且LPS組細胞凋亡的數(shù)目大于IL-1β組和TNF-α組。見圖3。

表1 4組HUVEC的增殖活性比較 （±s）

表1 4組HUVEC的增殖活性比較 （±s）

組別72 h對照組 0.72±0.02 0.79±0.04 0.91±0.03 TNF-α組 0.68±0.01 0.61±0.01 0.44±0.03 IL-1β組 0.65±0.02 0.53±0.01 0.36±0.03 LPS組 0.61±0.03 0.42±0.01 0.22±0.04 24 h 48 h

圖1 4組HUVEC的增殖曲線

表2 4組HUVEC的增殖數(shù)量比較 （個，±s）

表2 4組HUVEC的增殖數(shù)量比較 （個，±s）

組別72 h對照組 7 195±102 8 123±104 9 077±189 TNF-α組 6 800±124 6 200±137 4 480±109 IL-1β組 6 500±111 5 300±104 3 600±105 LPS組 6 100±127 4 200±99 2 400±102 24 h 48 h

圖2 4組HUVEC的增殖數(shù)量

2.4 HUVEC的凋亡率

培養(yǎng)24 h，正常組、TNF-α組、IL-1β組及LPS組細胞的凋亡率細胞分別為（2.11±1.30）%、（9.63±1.48）%、（22.19±1.37）%和（29.78±3.20）%。培養(yǎng)48 h后，4組細胞的凋亡率分別為（2.08± 0.72）%、（6.57±0.87）%、（16.42±2.56）%和（24.62± 3.86）%。TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組在培養(yǎng)24和48 h時增殖數(shù)量的比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點細胞的凋亡率有差異（F=230.326，P=0.000）；②TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組的細胞凋亡率有差異（F=80.928，P= 0.000），TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組比較，細胞的凋亡率均增加。③TNF-α組、IL-1β組、LPS組與正常組的凋亡率變化趨勢有差異（F=31.471，P= 0.000）。見圖4。

圖3 4組HUVEC的凋亡情況 （倒置熒光顯微鏡，AO-EB染色×100）

圖4 流式細胞儀檢測4組HUVEC的凋亡率

3 討論

燒傷后早期的創(chuàng)傷應(yīng)激及中、晚期細菌感染引發(fā)的膿毒癥，均使眼球及其附屬器發(fā)生嚴重損傷，結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生破壞，甚至致盲[6]。燒傷后不同時期引發(fā)炎癥反應(yīng)的致傷因子不同，如早期以TNF-α和白介素類因子為主導(dǎo)，中、晚期以LPS為主導(dǎo)，因此介導(dǎo)的發(fā)生機制也有所不同[7]。

眼燒傷后早期損傷的關(guān)鍵是血管內(nèi)皮細胞的屏障結(jié)構(gòu)和功能受損，血管通透性增加，血管內(nèi)炎癥細胞聚集、黏附及滲出導(dǎo)致角膜水腫及混濁。緊隨其后的血管增殖期為損傷的毛細血管內(nèi)皮細胞及炎癥細胞釋放大量血管活性物質(zhì)，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促使新生血管形成，影響角膜的透明性[8]。因此內(nèi)皮細胞是眼燒傷后發(fā)生各類并發(fā)癥基礎(chǔ)。也有研究稱，內(nèi)皮細胞是各類炎癥介質(zhì)的效應(yīng)細胞，各類炎癥因子通過與內(nèi)皮表面表達的相應(yīng)受體結(jié)合，啟動其下游的信號，進而介導(dǎo)細胞發(fā)生損傷或者凋亡[9-10]。

本研究采用燒傷后早期代表性的炎癥因子TNF-α、IL-1β，及中、晚期代表性的炎癥因子LPS培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，觀察該細胞增殖和凋亡的變化。結(jié)果顯示，TNF-α、IL-1β和LPS均可降低人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖活性和增殖數(shù)量，且LPS誘導(dǎo)人臍靜脈細胞增殖活性和增殖數(shù)量下降的趨勢大于IL-1β組和TNF-α組；IL-1β組細胞增殖活性和增殖數(shù)量下降的趨勢大于TNF-α組細胞。同樣地，AO-EB染色定性和流式定量檢測細胞的凋亡結(jié)果顯示，TNF-α、IL-1β及LPS可增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡數(shù)量，且LPS誘導(dǎo)人臍靜脈細胞凋亡率高于IL-1β組和TNF-α組；IL-1β組細胞凋亡率大于TNF-α組，這可能是3者與細胞表面各自特異的受體相結(jié)合，啟動下游不同的信號通路有關(guān)。TNF-α能誘導(dǎo)激活多條激酶通路，如NF-κB、JNK、ERK、P38及PI3K的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控包括細胞增殖、分化到凋亡等細胞過程[11]。XU等[12]研究表明，TNF-α可通過與內(nèi)皮祖細胞表面的受體結(jié)合啟動下游的ERK/MAPK和NF-κB信號通路，進而誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞發(fā)生凋亡。同樣IL-1β也是與內(nèi)皮細胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合，通過上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax和下調(diào)Bcl2，誘導(dǎo)細胞色素C的釋放，進一步活化Caspase-3而導(dǎo)致內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡[13]。而LPS可通過激活細胞表面的受體，激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal regulating kinase-1，ASK-1），以及NF-κB和MAPKs級聯(lián)過程[14]。

綜上所述，雖然TNF-α、IL-1β及LPS在致人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖活性和凋亡發(fā)生的趨勢相同，但是各組間仍有差異，提示眼燒傷不同時期的血管內(nèi)皮細胞發(fā)生損傷程度并不相同，這可能與其誘導(dǎo)下游不同信號機制有關(guān)。仍需進一步探討其分子機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

Effect of TNF-α,IL-1β and LPS on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells

Hui Duan
(Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian,Liaoning 116001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of TNF-α,IL-1β and LPS on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)in vitro,so as to further study the mechanism of endothelial cell injury induced by inflammatory cytokines in different period after eye burn.MethodsThe HUVECs were randomly divided into control group,TNF-α group,IL-1β group and LPS group.Cell proliferation activity was assessed by CCK-8.The number of proliferative cells was detected by trypan blue exclusion staining. The apoptosis was assessed by AO-EB staining.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.ResultsCompared to the control group,the cell proliferation activity in the other 3 groups were markedly decreased in a downward trend from TNF-α group,IL-1β group to LSP group.Meanwhile,the results of proliferative cell counting were also similar with CCK-8 results.The cell structures in the control group were normal,and apoptotic cells were observed in the other 3 groups.Compared with the control group,the apoptosis rate ofHUVECs in the TNF-α,IL-1β and LPS groups was significantly increased;and the cell apoptosis rate of the LPS group was markedly higher than that of the TNF-α and IL-1β groups,and the cell apoptosis rate of the IL-1β group was markedly higher than that of the TNF-α group (P<0.05).ConclusionsThe inflammatory cytokines such as TNF-α,IL-1β and LPS in early and late stages after burn can significantly decrease proliferative activity of HUVECs and increase the apoptosis rate in different degrees.This may be related to different signaling pathways activated by different inflammatory mediators.

eye burn;tumor necrosis factor-α;interleukin-1β;lipopolysaccharide;endothelial cell

R779.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.006

1005-8982（2017）09-0030-05

2016-04-21