■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

豬腹瀉性病毒病熒光定量PCR鑒別診斷方法研究進(jìn)展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

熒光定量PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、快速高效、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到廣大獸醫(yī)相關(guān)工作者的關(guān)注，在動(dòng)物疾病診斷中應(yīng)用越來越廣泛，本文綜述了豬腹瀉性病毒病熒光定量PCR鑒別診斷方法的研究進(jìn)展情況，以期為今后豬腹瀉性病毒病的診斷和防控工作提供參考。

豬腹瀉性病毒病；熒光定量PCR；鑒別診斷

腹瀉是當(dāng)前威脅養(yǎng)豬業(yè)的一類重要疾病，導(dǎo)致豬腹瀉的原因很多，包括營(yíng)養(yǎng)性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉和寄生蟲等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一種因素，病毒性腹瀉傳播快、危害大、無特效藥物治療，且發(fā)生與流行在近年呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]，引起豬發(fā)生腹瀉的病毒主要有流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒及豬繁殖與呼吸綜合征病毒[2]等。核酸檢測(cè)技術(shù)是通過對(duì)疾病相關(guān)的核酸分子研究，了解疾病的發(fā)生、發(fā)展情況，為疾病的診斷及防控工作提供參考。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，核酸檢測(cè)技術(shù)在獸醫(yī)臨床中的地位顯得更為重要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種的核酸檢測(cè)技術(shù)。它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，不再需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知模板定性檢測(cè)或定量分析。因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、快速高效、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，在獸醫(yī)臨床診斷中應(yīng)用越來越廣泛，本文綜述了豬腹瀉性病毒病熒光定量PCR診斷方法的研究進(jìn)展，以期為今后豬腹瀉性病毒病的診斷和防控工作提供參考。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

1.1 熒光定量PCR技術(shù)原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定的熒光信號(hào)(閾值)時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)，即Ct值。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

1.2 熒光定量PCR技術(shù)分類

實(shí)時(shí)熒光定量PCR包括染料法和探針法兩種，探針法是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，染料法則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，常用的染料有SYBR GreenⅠ、SYBR Gold、Power SYBR Green等。探針法特異性好，染料法操作簡(jiǎn)便，成本低。

2 在豬腹瀉性病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 豬流行性腹瀉病毒診斷

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)可導(dǎo)致豬流行性腹瀉，主要特征是嘔吐、脫水和水樣腹瀉，多發(fā)生于冬、春季節(jié)。各日齡的豬均可感染PEDV發(fā)病，其中哺乳仔豬受到的危害最嚴(yán)重。董世娟等[3]建立檢測(cè)PEDV的TaqMan熒光定量PCR方法，建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值和模板起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)在108～101copies/μL有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)的平方為0.997，該法可檢測(cè)6.368copies/μL的模板量。于長(zhǎng)青等[4]建立了基于SYBR GreenⅠ的PEDV熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法擴(kuò)增效率為100.4%，相鄰擴(kuò)增曲線之間間距均勻，所有產(chǎn)物的熔解曲線具有單一整齊的峰，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有優(yōu)良的線性關(guān)系，最低可準(zhǔn)確檢測(cè)520拷貝/μL的模板量，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于3%。曹貝貝等[5]建立了檢測(cè)PEDV的SYBR Green I熒光定量RTPCR方法。該法對(duì)常見的病毒均未檢測(cè)到熒光信號(hào)，而僅對(duì)PEDV檢測(cè)為陽(yáng)性，其靈敏度為57copies/μL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1%。

2.2 豬傳染性胃腸炎病毒診斷

傳染性胃腸炎病毒(TGEV)可引起豬傳染性胃腸炎，該病是一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征高度傳染性疾病，秋始、冬春為該病高發(fā)期。各種不同品種和月齡的豬都能感染TGEV發(fā)病，2周齡受到的危害最為嚴(yán)重，一旦感染后，其死亡率可高達(dá)100%。5周齡以上的豬感染后雖然死亡率不高，但生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率低。王建中等[6]參照GenBank登錄的TGEV S基因序列設(shè)計(jì)引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)TGEV的熒光定量PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法具有良好的特異性，對(duì)其他病原的檢測(cè)結(jié)果為陰性，其檢測(cè)敏感性可達(dá)43.07copies/μL，是普通RT-PCR檢測(cè)方法的100倍。方振華等[7]將TGEV N基因部分片段克隆并連接到pGEM-T Easy載體上，得到重組質(zhì)粒，以此為標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立TGEV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。該法檢測(cè)靈敏度可達(dá)10copies/μL，具有良好的特異性和重復(fù)性。李繼良等[8]根據(jù)TGEV的N基因設(shè)計(jì)引物，建立了基于SYBR GreenⅠ的TGEV熒光定量PCR檢測(cè)方法，該法的擴(kuò)增效率為101%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)為0.9997，可準(zhǔn)確檢測(cè)的最低核酸模板濃度為490copies/μL，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于3%。

2.3 豬輪狀病毒診斷

豬輪狀病毒(PoRV)可引起豬的腹瀉，1～4周齡仔豬最易感，發(fā)病率在80%以上，死亡率為7%～20%，育成豬和成年豬通常為隱性感染[9]。主要臨床表現(xiàn)為厭食、嘔吐、水樣腹瀉，導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重脫水和酸堿平衡紊亂，繼發(fā)細(xì)菌性感染后，病死率升高。陳小金等[10]根據(jù)GenBank中登錄的A群豬輪狀病毒(PoRV)毒株序列，針對(duì)VP7基因設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，建立了檢測(cè)A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法，結(jié)果顯示，該法1.3×108～1.3×102copies/ μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)的平方為0.999，最低檢測(cè)限為1.3×101copies/μL，對(duì)豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均低于2%。高婉俊等[11]建立了檢測(cè)G9型Po RV的Taq Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法的相關(guān)系數(shù)的平方為0.991，對(duì)其他常見的Po RV(G5)、TGEV、PEDV、PRRSV和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)等豬病原檢測(cè)均陰性，具有良好的特異性，最低可以檢測(cè)到的病毒滴度為103TCID50，比普通RT-PCR方法靈敏度高約1,000倍，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于0.87%，穩(wěn)定性高，重復(fù)性好。

2.4 豬偽狂犬病毒診斷

豬偽狂犬病毒(PRV)不但能引起母豬繁殖障礙（如流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔），還可引起仔豬的拒食、嘔吐、腹瀉、呼吸困難、口吐白沫，有共濟(jì)失調(diào)、轉(zhuǎn)圈和抽搐等神經(jīng)癥狀，感染率和死亡率可達(dá)100%。田青等[12]根據(jù)PRVg B基因保守序列，設(shè)計(jì)引物和Taq Man探針，建立了檢測(cè)PRV的熒光定量PCR方法。該法可檢測(cè)到相當(dāng)于10copies/μL的病毒DNA，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高約100倍，敏感性較強(qiáng)，該方法檢驗(yàn)CSFV、PRRSV和PCV2呈現(xiàn)陰性結(jié)果，特異性強(qiáng)，變異系數(shù)小于1%，具有良好的重復(fù)性。 張志等[13]針對(duì)PRV疫苗株基因組缺失的3.5kb片段，設(shè)計(jì)3套引物和探針，建立了一種新的快速鑒別PRV野毒株和疫苗株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該法的檢測(cè)極限可達(dá)10copies/μL，并與CSFV、PRRSV、PPV和PCV2等不存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)分別（1.70±1.07）%和（2.22±1.02）%，重復(fù)性好。陳如敬等[14]根據(jù)PRV gE基因序列，設(shè)計(jì)引物，建立基于SYBR GreenⅠ染料的PRV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該法檢測(cè)豬PRV gE基因在7.53×10-1～7.53×10-6copies/ μL線性關(guān)系較好，從生成的熔解曲線可見，建立的方法僅對(duì)豬PRV檢測(cè)出現(xiàn)單一特異峰，其熔解溫度(Tm值)為(92.9±0.1)℃，PCV2、PPV、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌均未見特異性峰值，該法組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為0.31%～1.14%和0.42%～1.74%。

2.5 豬瘟病毒診斷

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病。不同年齡、性別、品種的豬均易感，一年四季均可發(fā)生。根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為急性型豬瘟、慢性型豬瘟、非典型性豬瘟和遲發(fā)型豬瘟，急性型與慢性型豬瘟均有腹瀉的臨床表現(xiàn)，主要為急性型豬瘟病初便秘，隨后出現(xiàn)糊狀或水樣并混有血液的腹瀉，大便惡臭。慢性型豬瘟食欲時(shí)好時(shí)壞，便秘和腹瀉交替發(fā)生。謝金文等[15]建立了能鑒別CSFV強(qiáng)毒感染與弱毒疫苗的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法，其Tm值分別為84.5±0.5℃和88.5±0.5℃，該法特異性強(qiáng)，對(duì)其他相關(guān)病毒無特異性擴(kuò)增，敏感性高，最低檢出量為5×RID50的細(xì)胞毒基因組拷貝，重復(fù)性好，并且擴(kuò)增效率高、線性范圍廣、檢測(cè)時(shí)間短。岳鋒等[16]根據(jù)GenBank中CSFV 5'NTR的保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和TaqMan探針，以CSFV全長(zhǎng)基因重組質(zhì)粒pGEM-CSFV為標(biāo)準(zhǔn)品，建立TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)的平方為0.999，敏感性高，最低檢測(cè)限為1×101copies/μL，特異性強(qiáng)，與PCV2、PPV、PRV和PRRSV無交叉反應(yīng)性，重復(fù)性好，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%。杜冬華等[17]根據(jù)CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差異，建立了能同時(shí)檢測(cè)CSFV野毒株和疫苗株的雙重Taq Man real-time PCR鑒別檢測(cè)方法。結(jié)果表明，建立的CSFV雙重Taq Man real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與1×101～1×106copies/μL之間的E2基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系，靈敏度達(dá)10copies/μL，且特異性和重復(fù)性很好。

2.6 豬圓環(huán)病毒2型診斷

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、母豬繁殖障礙、斷奶豬和育肥豬呼吸道疾病、豬皮炎腎病綜合征、豬腹瀉綜合征以及仔豬的中樞系統(tǒng)疾病等多種疾病。其中引起的豬腹瀉綜合征主要表現(xiàn)為腹瀉與正常排便交替出現(xiàn)，用藥效果不明顯，反復(fù)遷延。郭慧娟等[18]建立了一種檢測(cè)PCV2的TaqMan熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，該法與豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬流感病毒、PRRSV、PRV、CSFV等均無交叉反應(yīng)，最低可檢測(cè)4.53×102copies/μL的模板量，比PCR檢測(cè)方法高100倍，其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍是102～109copies/ μL，重復(fù)性好。于新友等[19]采用PCR擴(kuò)增PCV2 ORF2基因242bp片段，并克隆入pMD18-T載體中，以純化的重組質(zhì)粒為模板作熒光定量PCR擴(kuò)增，建立了PCV2熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.2×10-1copies/μL，與PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、乙型腦炎病毒(JEV)核酸均不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，具有很好的特異性和重復(fù)性。郝立沙等[20]根據(jù)GenBank中PCV2保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和Taq Man探針，制備標(biāo)準(zhǔn)品，建立PCV2的熒光定量檢測(cè)方法。結(jié)果表明：該方法在1×101～1×108copies/μL的模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999，敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍，對(duì)PPV、PRV、CSFV、PRRSV均為陰性，沒有交叉反應(yīng)，批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2.50%，在臨床檢測(cè)中，比常規(guī)PCR方法檢測(cè)PCV2的陽(yáng)性檢出率高出38%。

2.7 PRRSV診斷

PRRSV可引起豬繁殖與呼吸綜合征，各日齡豬均可感染，母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上，仔豬可表現(xiàn)為呼吸困難、腹瀉等，仔豬腹瀉多發(fā)生于出生2d以后，糊狀下痢，有的排出灰色或黑色焦油狀稀便，部分便中帶血，發(fā)病率50%以上，死亡率30%以上，無明顯的季節(jié)性，吳海港等[21]根據(jù)PRRSV的ORF7保守序列分別設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV的方法。該法擴(kuò)增效率為97%，具有良好的線性關(guān)系。利用建立的方法檢測(cè)PCV2、PPV、PRV、CSFV、JEV，結(jié)果均為陰性，特異性性好。靈敏度試驗(yàn)表明該方法檢測(cè)極限為5copies/μL。溫青娜等[22]根據(jù)歐洲型PRRSV N基因、美洲型PRRSV M基因和高致病性PRRSV nsp2基因的各自保守序列設(shè)計(jì)特異性的引物和不同熒光標(biāo)記的TaqMan熒光探針，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，建立了能夠檢測(cè)歐洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法的重復(fù)試驗(yàn)表明其批內(nèi)和批間的變異系數(shù)最高值分別為1.84%和1.76%，靈敏性試驗(yàn)表明其檢測(cè)下限為10copies/μL，特異性試驗(yàn)表明與其他一些豬源病毒無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，臨床試驗(yàn)表明，該方法能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出臨床組織樣本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸，該法還可以檢測(cè)出歐洲型PRRSV目的基因。

2.8 其他病毒診斷

熒光定量PCR方法還用于豬博卡病毒[23]、豬嵴病毒[24]和豬捷申病毒[25]等多種豬腹瀉相關(guān)病毒的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果都表明熒光定量PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、高靈敏和高特異的核酸擴(kuò)增方法。

3 小結(jié)

熒光定量PCR方法作為一種快速基因擴(kuò)增方法，自出現(xiàn)以來，受到了廣泛的關(guān)注，在國(guó)內(nèi)外疾病診斷、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域都取得了重大成就，在動(dòng)物疾病病因的確診方面發(fā)揮的巨大的作用，檢測(cè)敏感性高，可檢測(cè)潛伏期的病原，起到了對(duì)豬場(chǎng)疾病的預(yù)警作用，檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確，可及時(shí)分析豬的病因，采取合適的治療措施，從而及時(shí)有效控制疫情，使養(yǎng)殖場(chǎng)損失降到最低。但熒光定量PCR技術(shù)同樣存在一些不足，①在對(duì)模板進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，由于各單位所用的標(biāo)準(zhǔn)品各不相同，產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線也不同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有偏差。②在對(duì)RNA模板的樣品進(jìn)行定量時(shí)，不用廠家的逆轉(zhuǎn)錄酶的效率不同，可能導(dǎo)致結(jié)果不一致。③由于進(jìn)行封閉檢測(cè)，不通過電泳檢測(cè)結(jié)果，所以不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，尤其是用染料法檢測(cè)時(shí)易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。④對(duì)操作人員要求高，一旦出現(xiàn)問題，不能分析原因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各國(guó)專家學(xué)者不斷研發(fā)出新型的熒光定量PCR儀器，降低了儀器成品，開發(fā)了一些便攜式熒光定量PCR，方便攜帶，成本低廉，并不斷降低試劑的成本，提高試劑檢測(cè)的敏感性，如果再制定一系列統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測(cè)人員開展相應(yīng)的培訓(xùn)，熒光定量PCR檢測(cè)方法必定在豬腹瀉性病毒病的基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮重要的作用?！?/p>

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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-08-17)。