尹 亮，李雙鈴，任 艷，石延茂，袁 美

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

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42個花生品種的SSR標記指紋圖譜構(gòu)建

尹 亮，李雙鈴，任 艷，石延茂，袁 美*

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

以不同地區(qū)的42個花生品種為材料，利用23對SSR引物進行分析。23對SSR引物在42個花生品種中共檢測到92個等位變異，平均每對引物4個等位基因，平均PIC值為0.49。進一步分析表明，8對引物就可以將42個花生品種完全區(qū)分開，8對引物共產(chǎn)生40個等位變異，利用這40個等位變異構(gòu)建了42個花生品種的DNA指紋圖譜。聚類分析結(jié)果顯示，在相似系數(shù)0.74處，可將42個供試品種分為4個類群。本研究結(jié)果為花生品種保護和育種實踐提供了理論依據(jù)。

花生；SSR；DNA指紋圖譜；聚類分析

花生(ArachishypogaeaL.)是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物。近年來，隨著大量花生新品種的推廣與應(yīng)用，以及在育種過程中高頻率使用少數(shù)骨干親本，造成花生品種遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄，遺傳多樣性降低，使以形態(tài)性狀鑒定為主的傳統(tǒng)品種鑒定方法已經(jīng)很難滿足現(xiàn)在的生產(chǎn)需要。以分子標記為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)為品種鑒定提供了新的快捷途徑。目前，用于DNA指紋圖譜構(gòu)建的分子標記包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR和STS等[1]。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相比，DNA指紋圖譜技術(shù)具有簡單、快速、易于自動化等優(yōu)點，已在水稻[2]、玉米[3]、大豆[4]、棉花[5]、高粱[6]等農(nóng)作物品種鑒定及遺傳分析中得到廣泛使用。

在花生品種鑒定研究方面，已有多家單位構(gòu)建了特定類型或部分區(qū)域的花生主栽品種的DNA指紋圖譜。翁躍進等[7]利用AFLP技術(shù)對從國際半干旱所引進的9份花生抗旱品種繪制指紋圖譜；李雙鈴等[8]利用MseI和EcoRI酶切和9對引物組合構(gòu)建了10個山東花生主栽品種的AFLP指紋圖譜。近年來，隨著花生SSR標記引物的不斷開發(fā)[9-13]，其以數(shù)量豐富、共顯性遺傳、信息含量高、結(jié)果重現(xiàn)性好、檢測手段簡便易行等優(yōu)點，現(xiàn)已成為構(gòu)建花生品種DNA指紋圖譜的主要分子標記。國內(nèi)相關(guān)研究報道，已利用SSR分子標記分別構(gòu)建了20個南方花生品種[14]、40個珍珠豆型花生品種[15]、山東審定的46個花生品種[16]以及河南審定的90個花生品種[17]的指紋圖譜。此外，任小平等[18]利用SSR熒光引物構(gòu)建了100份花生的指紋圖譜。本研究利用SSR標記構(gòu)建了不同地區(qū)的42個花生品種的DNA指紋圖譜，并對SSR標記多態(tài)性進行分析，為品種保護和育種實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用來自山東、四川、河南、河北、廣東、福建等省的42個品種為材料(表1)。所有花生材料均種植于山東省花生研究所萊西試驗農(nóng)場。

1.2 DNA提取

選取花生幼嫩健康葉片，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取花生葉片基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度，并將DNA稀釋為30ng/μL。

1.3 SSR標記分析

選取經(jīng)本研究組初篩具有多態(tài)性的23對SSR引物(表2)對42份花生品種進行檢測。SSR引物序列均來源于Peanut Marker Database網(wǎng)站(http://marker.kazusa.or.jp/peanut/#)，引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)使用MDBIO(青島)的Taq DNA聚合酶，反應(yīng)體系參照說明書。PCR反應(yīng)條件為：95℃下變性3min；95℃下30s，55℃下30s，72℃下30s，30個循環(huán)；72℃下延伸3min。PCR產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，方法參考鄭永勝等的方法[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別以0和1記載各品種SSR等位變異，在相同遷移率位置上，有帶記為1、無帶記為0，位點數(shù)據(jù)缺失記為9，組成原始矩陣。利用SSR數(shù)據(jù)處理宏程序DataTrans 1.0對數(shù)據(jù)進行格式轉(zhuǎn)換，并使用PowerMarker V3.25對SSR標記進行分析，計算出每個SSR標記的主基因頻率、基因型數(shù)、等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、雜合度以及PIC值。使用NTSYS-pc 2.10e軟件的SAHN程序和UPGMA方法對供試材料進行聚類分析，生成聚類圖并計算出各品種間的遺傳相似系數(shù)。

表1 試驗材料及來源

表2 引物及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

對23對SSR引物的電泳圖譜進行分析(圖1)，在42個花生品種中共檢測到92個等位變異，其中每個標記等位基因數(shù)3～8個，平均每個標記4個等位基因，其中AHGS1446和TC23H10分別檢測到8個和7個等位變異；引物PIC值為0.27～0.76，平均0.49，PIC值超過0.5的引物有10對，其中AHGS1446、TC23H10、GNB827的PIC值超過0.7，GNB613和Seq11G07的PIC值最低，為0.27；引物基因多樣性指數(shù)為0.32～0.79(表3)；主基因頻率為0.29～0.83；IPAHM455、PM183、Seq2G03、Seq3A08、Seq16F01、Seq18C05在1個品種中存在雜合位點，GNB317、GNB613、Seq19B12在2個品種中存在雜合位點。綜合分析比較各參數(shù)，PIC值變化趨勢與基因多樣性指數(shù)變化趨勢一致，PIC值越高則該引物對于不同品種的鑒別能力越強。

圖1 引物AHGS1446和AHGS2535在42個花生品種中的擴增結(jié)果Fig.1 DNA fragments amplified by SSR primers AHGS1446 and AHGS2535 among 42 peanut varieties注：A：AHGS1446；B：AHGS2535；1～42：對應(yīng)供試材料編號，編號與表1相同。Note: A: AHGS1446; B: AHGS2535; 1～42: The code of varieties corresponding with those in Table 1.

表3 SSR引物擴增等位基因數(shù)及多態(tài)性信息

表4 8個SSR標記構(gòu)建的42個花生品種的指紋圖譜

2.2 42個花生品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

采用23對SSR引物對42個花生品種進行指紋分析，遠雜9102、鄭農(nóng)花12、冀花2號在引物AHGS1446檢測圖譜中有特征譜帶，中花9號、中花15在引物IPAHM352檢測圖譜中有特征譜帶，仲愷花1號在引物PM183和Seq3A01檢測圖譜中均有特征譜帶，山花10號、遠雜9102在引物TC23H10檢測圖譜中有特征譜帶。除上述少數(shù)品種外，其他品種都不具有特征譜帶，因此需要利用引物組合進行鑒定。通過分析，僅需要8對引物AHGS1446、AHGS1661、GNB827、IPAHM455、PM183、Seq3A01、TC23H10、TC25G11進行組合，即可將42個花生品種完全區(qū)分開。利用上述8對引物擴增結(jié)果構(gòu)建42個花生品種的DNA指紋圖譜(表4)。

圖2 42個花生品種的UPGMA聚類分析 Fig.2 UPGMA clustering of 42 peanut varieties

2.3 42個花生品種特異性分析

利用23對引物擴增得到的92條多態(tài)性條帶進行聚類分析，得到供試材料的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖2)。結(jié)果表明，所有供試品種間差異位點數(shù)均≥2，其中山花8號與山花10號、豫花15與冀0212-4、鄭農(nóng)花12與鄭農(nóng)花13相似系數(shù)較高，僅有2對引物可以將其分開。在相似系數(shù)0.74處，可以將42個花生品種分為4個類群。第I類群包含17個花生品種，分別為花育56、花育45、山花8號、山花10號、花育33、豫花15、冀0212-4、豫花9620、鄭農(nóng)花13、鄭農(nóng)花12、濰花9號、冀0607-17、豫花9306、天府23、豫花9925、中花8號和徐花9號。第II類群包含17個花生品種，分別為花育31、山花12、鐵花15、山花15、?；?號、濮花30、駐29150、遠雜9102、天府20、山花9號、中花9號、濮花22、冀花2號、濮花28、中花15、山花7號和豐花1號。第III類群包含2個花生品種，分別是中花12和中花5號。第IV類群包含6個花生品種，分別是仲愷花1號、泉花865、閩花6號、泉花327、仲愷花10號和仲愷花12。

3 討論與結(jié)論

SSR(Simple Sequence Repeat)，簡單序列重復(fù)，又稱為微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)或短串聯(lián)重復(fù)(STR)，是一種真核生物基因組中普遍存在的重復(fù)序列。Zhao等[20]研究表明，在9274對已開發(fā)的SSR分子標記中，1323對具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為14.5%。SSR標記因其在基因組分布廣泛、多態(tài)性高以及共顯性遺傳等優(yōu)點，是構(gòu)建DNA指紋圖譜的理想技術(shù)。本研究首先從實驗室已篩選出的200余對具有多態(tài)性的SSR引物中選出23對擴增穩(wěn)定、帶型簡單清晰的SSR引物對42個不同地區(qū)花生品種進行遺傳分析。結(jié)果表明所有品種均有2個或2個以上差異位點，其中遠雜9102、鄭農(nóng)花12、冀花2號、中花9號、中花15、仲愷花1號、山花10號7個品種可以用單一引物進行區(qū)分，其他品種用8對引物進行組合就可以全部區(qū)分開，并構(gòu)建了42個花生品種DNA指紋圖譜。從聚類分析結(jié)果來看，同一地區(qū)及同一育種單位培育的花生品種相似系數(shù)較高，這與各地區(qū)、各育種單位在育種過程中高頻使用少數(shù)骨干親本有關(guān)，導(dǎo)致花生品種遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄[21-22]。本研究結(jié)果為品種保護和育種實踐提供了理論依據(jù)。

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Construction of Molecular Fingerprint for 42 Peanut Varieties Using SSR Markers

YIN Liang, LI Shuang-ling, REN Yan, SHI Yan-mao, YUAN Mei*

(Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China)

42 peanut varieties from different area of China were used as materials. The varieties were analyzed by using 23 pairs of polymorphic SSR primers. A total 92 alleles were amplified from 23 SSR loci. The average of alleles is 4, and the average of polymorphic information content (PIC) is 0.49. Further analysis showed that, only 8 pairs of primer can fully distinguish 42 peanut varieties. A total 40 alleles were amplified from these 8 pairs of primers. The fingerprint clustering analysis of 42 peanut varieties was constructed by 40 alleles. Cluster analysis revealed that 42 peanut varieties could be classified into four groups at a 0.74 genetic similarity coefficient.This result provide theoretical basis for peanut varieties protection and breeding improvement.

peanut; SSR; DNA fingerprinting; clustering analysis

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.01.002

2017-02-16

國家自然科學(xué)基金(31471533)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃(2013AA102602-7)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2016B02)

尹亮(1983-)，男，山東膠南人，山東省花生研究所助理研究員，碩士，從事花生遺傳育種研究。

*通訊作者：袁美(1972-)，女，研究員，博士，主要從事花生生物技術(shù)研究。E-mail: yuanbeauty@163.com

S565.2024; Q755

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