祁 雪，王傳堂，王秀貞，吳 琪，孫全喜，王志偉，邵俊飛，唐月異*，關(guān)淑艷*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2. 山東省花生研究所，山東 青島 266100；3. 威海市文登區(qū)土壤肥料工作站，山東 文登 264200)

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原位胚拯救技術(shù)獲得花生屬區(qū)組間雜種的研究

祁 雪1，王傳堂2，王秀貞2，吳 琪2，孫全喜2，王志偉2，邵俊飛3，唐月異2*，關(guān)淑艷1*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2. 山東省花生研究所，山東 青島 266100；3. 威海市文登區(qū)土壤肥料工作站，山東 文登 264200)

花生野生種尤其是不親和野生種，具有高產(chǎn)、抗逆等優(yōu)異基因，但長(zhǎng)期以來(lái)得不到有效利用。為選育高油酸抗逆花生新品種，以高油酸品種花育963為母本、不親和野生花生作父本雜交，采用原位胚拯救技術(shù)直接收獲花生不親和種間雜種F1。利用MITE轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記對(duì)雜種進(jìn)行真實(shí)性鑒定。結(jié)果表明，其中有35粒樣品同時(shí)具有雙親條帶，為真雜種，真雜種率為44.3%。近紅外分析表明，真雜種油酸含量顯著低于高油酸花生，為雜種真實(shí)性提供了旁證。

花生；雜種鑒定；轉(zhuǎn)座子；分子標(biāo)記；AhMITE1

花生(ArachishypogaeaL.)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)與油料作物，也是優(yōu)質(zhì)植物蛋白的重要來(lái)源[1]。近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的日益提高，對(duì)花生品種的品質(zhì)和抗性等提出了更高要求，因此花生的遺傳育種受到高度重視。

花生區(qū)組外的野生種，被稱為不親和野生種，野生種具有栽培種不具備的高產(chǎn)因子以及抗逆(耐旱、耐冷、耐熱、抗葉部病害)[2]等優(yōu)異基因。但不親和野生種與栽培種的雜交存在不親和障礙，其表現(xiàn)為受精延遲、受精率低、果針生長(zhǎng)受阻、即使果針能夠入土由于胚在早期敗育最終也只能形成有敗育種子遺跡的空果。因此，要獲得雜交種，必須借助其他手段。目前，國(guó)際半干旱所利用體外胚培養(yǎng)技術(shù)，獲得栽培種與A.glabrata區(qū)組間雜種[3-4]。經(jīng)鑒定，發(fā)現(xiàn)雜種繼承了野生種的很多抗性基因[4]。此外，栽培種與Procumbentae、Heteranthae、Erectoides等區(qū)組間野生種的雜交也已經(jīng)成功[5]。山東省花生研究所在以往培養(yǎng)栽培種自交果針的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上[6]，授粉后立即用激素處理栽培種四粒紅×A.glabrataBenth. PI 262801授粉花基部，取果針離體培養(yǎng)，成功獲得了發(fā)育良好的種子[7-9]。根據(jù)形態(tài)和同工酶等特征確定其為真雜種[10]。

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子(MITE)是由Bureau和Wessler首次在玉米中發(fā)現(xiàn)并命名的[11]。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)MITE廣泛分布于其他真核生物基因組中。MITE的結(jié)構(gòu)與非自主原件結(jié)構(gòu)相似，具有TIR和TSD的結(jié)構(gòu)。但它的拷貝性和序列一致性又使其區(qū)別于非自主原件，故稱其為新的DNA轉(zhuǎn)座子。目前MITE分子標(biāo)記已應(yīng)用于水稻[12]、煙草[13]等植物。在花生方面，Shirasawa等[14]根據(jù)AhMITE的特征，利用其兩端序列開(kāi)發(fā)504對(duì)引物，用于雜種鑒定。王潔等[15]對(duì)這504對(duì)引物進(jìn)行篩選，其中193對(duì)引物擴(kuò)增效果良好，145對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性比率75.13%。王輝等[16]利用轉(zhuǎn)座子AhMITE分子標(biāo)記對(duì)栽培種及高世代材料進(jìn)行分析，其中31對(duì)引物擴(kuò)增效果比較好，每對(duì)引物可擴(kuò)增1～3條帶，擴(kuò)增產(chǎn)生57條帶，其中54條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率94.49%。尹亮等[17]篩選出10對(duì)引物對(duì)12份材料進(jìn)行鑒定，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出真雜種。上述研究證明了MITE分子標(biāo)記的可靠性。

分子標(biāo)記用于花生雜種鑒定的報(bào)道較多，但多基于SSR。本研究通過(guò)原位胚拯救技術(shù)獲得了花生不親和種間雜種F1，并利用MITE轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記和近紅外技術(shù)對(duì)其真實(shí)性進(jìn)行鑒定，為原位胚拯救技術(shù)的有效性提供了分子水平的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以高油酸花生品種花育963為母本，花生區(qū)組外野生種A.paraguariensis為父本，搭配雜交組合。雙親于2015年5月種植于山東省花生研究所萊西試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)雜交圃。

1.2 原位胚拯救技術(shù)獲得雜種

人工雜交程序參考《中國(guó)花生品種及其系譜》[18]。搭配IAA 2mg/mL + BAP 2mg/mL+GA 2mg/mL和BAP 4mg/mL激素組合，用浸有激素的脫脂棉球敷于花生授粉花基部，以調(diào)節(jié)激素平衡獲取雜交種子。

1.3 花生樣品近紅外光譜采集與油酸含量預(yù)測(cè)

自雜交圃母本上收獲的雜交果剝?nèi)ス麣?，?duì)單?；ㄉN子樣品進(jìn)行編號(hào)，利用近紅外分析儀對(duì)完整單粒花生樣品進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品掃描3次，取平均值。采用本課題組建立的花生單粒自然風(fēng)干種子主要品質(zhì)指標(biāo)近紅外模型預(yù)測(cè)油酸含量。

1.4 SDS法提取花生基因組DNA

用刀片切取花生碎末0.1g于1.5mL離心管中，加入200μL提取液(1mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，10%SDS)，用磨樣器磨樣后于55℃水浴鍋中加熱30min。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，充分混勻，12000 r/min離心20min。取100 μL上清于新的離心管，加入等體積的異丙醇，充分混勻，12000 r/min離心10min。棄上清，沉淀于管中晾干后加入50μL TE緩沖液溶解，保存于-20℃冰箱以備后用。

1.5 轉(zhuǎn)座子標(biāo)記引物的篩選

雜種鑒定選用9對(duì)引物(表1)，均來(lái)自Shirasawa等的報(bào)道[14]。利用這9對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性分析，選用條帶清晰穩(wěn)定，有明顯差異的引物用于F1代雜種鑒定。

1.6 雜種F1鑒定

以F1種子提取的DNA為模板，篩選出的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)具有父母本擴(kuò)增條帶的樣品為真雜種。PCR擴(kuò)增體系(20μL)：2×Taq PCR Master Mix 10μL，正反向引物各0.5μL，ddH2O 8μL，DNA模板1μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min結(jié)束反應(yīng)。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交種的獲得

如表2所示，兩個(gè)激素組合共處理了240朵花，收獲了79粒種子。

表1 本文所用引物序列

表2 兩個(gè)激素組合處理花朵數(shù)、收獲種子數(shù)及莢果數(shù)

2.2 親本間AhMITE1轉(zhuǎn)座子多態(tài)性分析篩選

利用兩個(gè)親本材料對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)合成的9對(duì)AhMITE1引物進(jìn)行篩選，選取擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，片段大小在100～500bp之間，父母本擴(kuò)增產(chǎn)物之間存在顯著差異的引物對(duì)F1代雜種進(jìn)行鑒定。AhTE0254擴(kuò)增條帶明顯，且雙親均是一條帶，片段大小明顯不同，故選用此引物篩選F1代真雜種。

附圖 采用轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記鑒定F1雜種Fig. Identification of peanut F1 hybrids with transposon molecular markers注：M：Trans 2K DNA maker(全式金)；Fp：母本(花育963)；Mp：父本；1～79：雜種種子樣品。Note: M:Trans 2K DNA maker (Trans Gen); Fp: female parent (Huayu 963); Mp:male parent;1～79: hybrid samples.

2.3AhMITE1轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記鑒定花生F1代雜種

用篩選出的引物(AhTE0254)檢測(cè)79粒F1代雜種種子，F(xiàn)1代真雜種同時(shí)具有父母本條帶，呈共顯性，而假雜種只存在母本條帶。發(fā)現(xiàn)其中35粒同時(shí)具有父母本條帶，為真雜種。44?；ㄉ鷥H有母本條帶為假雜種，真雜種率44.3%(附圖)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雙仁果的兩粒花生的檢測(cè)結(jié)果是一致的，即同是真雜種或者同是假雜種。

2.4 近紅外光譜分析花生油酸含量

由近紅外掃描結(jié)果得知雜交樣品中油酸含量顯著低于高油酸花生的樣品為41個(gè)(表3)，分子標(biāo)記鑒定的真雜種數(shù)量為35個(gè)。其中個(gè)別花生樣品經(jīng)檢測(cè)并不是真雜種，由于最初建立近紅外模型時(shí)，選用的材料均為飽滿的花生種子樣品，而本試驗(yàn)收獲的個(gè)別雜種種子較秕(表3中油酸含量粗體顯示的種子樣品)，可能造成這部分種子通過(guò)近紅外預(yù)測(cè)的油酸含量偏低，但總體上兩者結(jié)果基本一致。因此，近紅外掃描結(jié)果可作為初步篩選真假雜種的一種方法，減少后期分子標(biāo)記雜種鑒定的工作量。

表3 近紅外掃描分析單?；ㄉN子油酸含量 (只列出油酸含量顯著低于母本的種子)

注：a代表雙仁果雜交種，且相鄰的兩個(gè)為同一莢果的不同種子。b代表單果仁雜交種。粗體編號(hào)的種子不飽滿，通過(guò)近紅外掃描估計(jì)的油酸含量并不準(zhǔn)確。

Note: a represents individual single seeds from two-seeded pods. Adjacent numbers, for example 1a&2a, 3a&4a, were from individual two-seeded pods. b represents the seeds from one-seeded pods. Bold serial numbers were poorly-filled seeds, whose oleic acid contents estimated by NIRS were inaccurate.

3 討 論

遺傳標(biāo)記指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段、某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它在作物遺傳育種中有著非常廣泛的應(yīng)用。遺傳標(biāo)記包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記及分子標(biāo)記等四種類型[21]，前三種遺傳標(biāo)記主要根據(jù)物種的外部形態(tài)特征，染色體的數(shù)目及大小和物種的貯藏蛋白，同工酶等進(jìn)行區(qū)分，但這三種標(biāo)記本身存在一些缺點(diǎn)，如多態(tài)性差、標(biāo)記數(shù)目不足以及易受到外界條件的影響等。DNA分子標(biāo)記是以核酸為研究對(duì)象，不受以上條件影響，且鑒定周期短，準(zhǔn)確率高。分子標(biāo)記應(yīng)用于花生的研究報(bào)道已有很多，但多是利用SSR標(biāo)記，其擴(kuò)增產(chǎn)物通常需要用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。本研究中AhMITE1轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記被用于鑒定花生F1代雜種，它是一種基于PCR的分子標(biāo)記，僅需要通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳即可檢測(cè)出雜種真假，操作簡(jiǎn)便快捷。實(shí)驗(yàn)所選用的材料是高油酸花生品種花育963和油酸含量較低的不親和野生種，采用近紅外光譜掃描分析單?；ㄉ退岷?，發(fā)現(xiàn)真雜種的油酸含量顯著低于高油酸花生，而假雜種油酸含量與母本高油酸品種花育963相仿，與分子標(biāo)記的結(jié)果基本吻合。因此認(rèn)為，近紅外光譜分析可作為篩選真假雜種的手段。

總之，本研究運(yùn)用原位胚拯救技術(shù)獲得了栽培種與不親和野生種A.paraguariensis的雜交種子，并采用簡(jiǎn)便易行的轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記技術(shù)鑒定出真雜種，并得到近紅外分析結(jié)果的支持，證明了通過(guò)原位胚拯救技術(shù)克服花生屬雜交不親和障礙的有效性。可以預(yù)期，原位胚拯救技術(shù)的應(yīng)用，將加速花生不親和野生資源的利用進(jìn)程，為培育突破性的花生品種創(chuàng)造條件。

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Production of Peanut Intersectional Hybrids throughinsituEmbryo Rescue Technique

QI Xue1, WANG Chuan-tang2, WANG Xiu-zhen2, WU Qi2, SUN Quan-xi2,WANG Zhi-wei2, SHAO Jun-fei3, TANG Yue-yi2*, GUAN Shu-yan1 *

(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China; 3. Wendeng Soil and Fertilizer Working Station, Weihai 264200, China)

TheArachisspecies, especially incompatible ones, though with many elite genes like high yield factors and stress tolerances, have been underutilized. To breed high oleic acid peanut cultivars with stress tolerances, Huayu963, a high-oleic peanut variety, was crossed with an incompatible species. Putative F1hybrid seeds were obtained throughinsituembryo rescue technique. MITE transposon molecular markers were utilized to identify true hybrids. The results showed that 35 seeds were true hybrids as they owned all the bands from both parents. The percentage of true hybrids was 44.3%. Near infra-red spectroscopy analysis found that oleic acid content of the true hybrids was significantly lower than that of high oleic peanut, which supported the hybridity of these seeds.

peanut; hybrid identification; transposon; molecular marker;AhMITE1

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.01.004

2016-12-01

國(guó)家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-14)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(2014CGPY09)

祁雪(1992-)，女，吉林延邊人，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事花生生物技術(shù)研究。

*通訊作者：關(guān)淑艷(1971-)，女，教授，博士，主要從事生物技術(shù)與作物遺傳育種研究。E-mail: 458194095@qq.com

S565.2035.1; Q321+.3

A

唐月異(1979-)，女，助理研究員，博士，主要從事花生分子育種研究。E-mail: yueyit@126.com