周 行，沈 杰

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲學(xué)系，北京 100193)

農(nóng)業(yè)昆蟲的功能基因組學(xué)研究：回顧與展望

周 行，沈 杰*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲學(xué)系，北京 100193)

昆蟲種類豐富，數(shù)量龐大，與人類生活關(guān)系密切，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)成為不可忽視的一部分?；蚪M學(xué)測序技術(shù)的迅速發(fā)展大大促進了昆蟲功能基因?qū)W。本文綜述了農(nóng)業(yè)昆蟲功能基因組學(xué)在生長發(fā)育、多型現(xiàn)象、抗藥性、化學(xué)信號感受機制、代謝組學(xué)以及腸道微生物等方面的最新研究進展，并對農(nóng)業(yè)昆蟲在未來研究中新思路和新技術(shù)的應(yīng)用做出了展望。

基因組；功能基因組學(xué)；農(nóng)業(yè)昆蟲

昆蟲具有強大的環(huán)境適應(yīng)能力，是地球上種類最為豐富的動物群體，已有超過180萬種昆蟲被鑒定和命名。隨著人類社會的農(nóng)業(yè)發(fā)展，昆蟲和人類生活的關(guān)系日益密切，人類從數(shù)量龐大的昆蟲群體中獲得了大量的經(jīng)濟資源和生態(tài)效益。例如，家蠶Bombyxmori是我國絲綢行業(yè)的重要支柱，我國近年絲綢行業(yè)營業(yè)收入每年達1200億元以上。此外各種顯花作物的授粉也主要是由昆蟲完成。但是，有害昆蟲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失也不容忽視，即使通過一系列的防治措施，農(nóng)林牧產(chǎn)品仍有20%損失是由農(nóng)業(yè)害蟲為害所產(chǎn)生的。隨著2000年果蠅Drosophilamelanogaster基因組測序和基因圖譜繪制完成(Adamsetal., 2000)，昆蟲學(xué)的研究開始進入基因組時代。截止于2015年底，已報道完成基因組測序的有15種與農(nóng)業(yè)相關(guān)的昆蟲，包括豌豆蚜Acyrthosiphonpisum(Taguetal., 2010)、褐飛虱Nilaparvatalugens(Xueetal., 2014)、亞洲飛蝗Locustamigratoria(Wangetal., 2014)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Youetal., 2013)4種主要農(nóng)業(yè)害蟲、倉儲害蟲赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Richardetal., 2008)和經(jīng)濟昆蟲家蠶(Xiaetal., 2004) 以及一些傳粉昆蟲和專營寄生的天敵昆蟲。此外，還有光肩星天牛Anoplophoraglabripennis、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata、小麥癭蚊Mayetioladestructor、草地夜蛾Spodopterafrugiperda、橘小實蠅Bactroceradorsalis等10多種農(nóng)業(yè)昆蟲的基因組測序組裝工作在緊鑼密鼓的進行當(dāng)中。前面所提到的6種農(nóng)業(yè)害蟲的基因組大小在200-6600 Mb，其中基因組最大的是亞洲飛蝗(6525 Mb)，最小的是赤擬谷盜(204 Mb)，重復(fù)序列、基因間隔以及內(nèi)含子的大小不一造成了昆蟲基因組大小的差異(張傳溪，2015)。赤擬谷盜已發(fā)展為研究遺傳發(fā)育、生態(tài)和食品安全的模式昆蟲(Grünwaldetal., 2013),而家蠶也已經(jīng)成為鱗翅目模式昆蟲，這些基因組數(shù)據(jù)為研究昆蟲在遺傳發(fā)育、取食遷飛、免疫防御等方面提供了重要的信息基礎(chǔ)，促進了以鑒定基因功能為目標(biāo)的昆蟲功能基因組學(xué)的發(fā)展，為農(nóng)業(yè)害蟲的為害機制和防治方法提供了分子水平上的基本依據(jù)。

1 研究農(nóng)業(yè)昆蟲基因組和功能基因組的意義

昆蟲對于農(nóng)作物的威脅主要是直接取食和傳播病原微生物兩種方式，而通過取食對農(nóng)作物造成損失的基礎(chǔ)就是其快速生長發(fā)育和大量繁殖的能力。從傳播植物病害的角度來看，80%以上的植物病害都是都是通過半翅目同翅亞目昆蟲傳播的，其中蚜蟲和葉蟬在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所造成的損失最為嚴重。蚜蟲作為重要的刺吸式害蟲之一，吸取植物汁液的同時，還會傳播諸如TMV、CMV、TuMV等在內(nèi)的100種以上的植物病毒和真菌等病原。1840年造成愛爾蘭大饑荒的馬鈴薯晚疫病能夠瘋狂的蔓延，蚜蟲“功不可沒”(Nichols, 2007)。從昆蟲生殖和發(fā)育的角度來看，蚜蟲也是很好的研究材料，蚜蟲的繁殖力極強，一年能繁殖10-30個世代，世代重疊，生活史復(fù)雜，難以測報和防治。雖然環(huán)境因素是誘導(dǎo)蚜蟲生殖方式轉(zhuǎn)換和翅型分化的主要外界因子，但是在蚜蟲孤雌生殖和翅型分化分子機制方面進展緩慢，或許今后能通過人為抑制其卵巢發(fā)育的關(guān)鍵基因和翅發(fā)育基因來抑制蚜蟲的爆發(fā)為害。此外，以家蠶為材料在研究鱗翅目昆蟲生長發(fā)育方面也已經(jīng)取得了不少進展，為控制諸多鱗翅目害蟲如棉鈴蟲Helibthisarmigera、小菜蛾、小地老虎Agrotisypsilon等提供了重要的理論依據(jù)。昆蟲與內(nèi)共生菌的關(guān)系也是一個熱門研究問題，由于許多農(nóng)業(yè)害蟲為植食性昆蟲，食性單一，無法從植物中直接獲取所必須的氨基酸和少量氮素化合物，所以許多昆蟲體內(nèi)都存在著初級和次級內(nèi)共生菌，而各種昆蟲和內(nèi)共生菌之間是如何進行營養(yǎng)物質(zhì)的共享和交換，兩者代謝途徑又存在哪些交集？隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展這些謎題期待被一一解開。

從控制蟲害傳播的角度來看，許多害蟲具有遷飛能力，而這也是褐飛虱、飛蝗等為害成災(zāi)的重要基礎(chǔ)。其中褐飛虱還存在長短翅翅型分化現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象被研究了數(shù)十年，最近得益于基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)有了突破性進展。2010年到2015年期間，張傳溪團隊研究發(fā)現(xiàn)了胰島素信號通路能夠控制飛虱翅型分化(Xueetal., 2014; Xuetal., 2015)，為昆蟲多型現(xiàn)象發(fā)生的分子機制提供了重要理論基礎(chǔ)?；认x一直是人類歷史上的一大禍害，其中亞洲飛蝗和沙漠蝗具有長距離的遷飛能力，其危害更甚。研究飛蝗遷飛涉及到幾個需要重點關(guān)注飛蝗的發(fā)育同步性和聚集行為的調(diào)控機理?？禈穲F隊針對這些問題開展了組學(xué)研究并取得了一系列重要進展(Maetal., 2011; Yangetal., 2014)。其它害蟲的重要為害特點研究也越來越依賴于基因組和轉(zhuǎn)錄組等信息基礎(chǔ)。

利用天敵昆蟲和害蟲的互作關(guān)系防治害蟲的應(yīng)用越來越廣泛，了解天敵控害的具體機制也需要以各種組學(xué)信息為基礎(chǔ)，發(fā)展其功能基因組學(xué)的研究，以更好的指導(dǎo)防治過程。

2 農(nóng)業(yè)昆蟲的功能基因組學(xué)研究進展

農(nóng)業(yè)昆蟲基因組學(xué)研究起步雖然晚于四大模式動物之一的果蠅，但是近些年在功能基因組學(xué)方面的研究正在進入快速發(fā)展時期并取得了重要昆蟲學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域的系列新發(fā)現(xiàn)。例如：褐飛虱翅型分化分子機制的發(fā)現(xiàn)；蚜蟲和共生菌的氮素營養(yǎng)代謝途徑的揭示；保幼激素和蛻皮激素受體的發(fā)現(xiàn)和相關(guān)信號通路的闡釋等。

2.1 功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用

基因組信息為基因遺傳學(xué)操控體系的構(gòu)建提供了重要基礎(chǔ)，利用轉(zhuǎn)座子插入誘導(dǎo)基因突變首先在果蠅上廣泛應(yīng)用(Spradlingetal., 1999; Bellenetal., 2004; Bellenetal., 2011)，隨后在赤擬谷盜中應(yīng)用，構(gòu)建了眼色突變體(Berghammeretal., 1999; Handleretal., 2001; Lorenzenetal., 2002)，如今已有大量的增強子誘捕品系和胚胎致死品系用于昆蟲遺傳發(fā)育、免疫防御、防治和進化等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。GAL4/UAS外源轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)作為一種高效的二元表達系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于果蠅、斑馬魚Poissonzèbre、擬南芥Arabidopsisthaliana等模式生物的研究中(Brandetal., 1994; Guyeretal., 1998; Scheeretal., 1999)，農(nóng)業(yè)相關(guān)昆蟲中已有赤擬谷盜和家蠶中成功應(yīng)用GAL4/UAS系統(tǒng)，其它果蠅上常用的遺傳操控技術(shù)如基因定點突變、基因重組(FLP/FRT)、鑲嵌體克隆分析(Mosaic Clone Analysis)、RNA干擾(RNA Interference)和Crispr/Cas9基因編輯技術(shù)等也正在農(nóng)業(yè)昆蟲中開發(fā)應(yīng)用(Maetal., 2014; Lietal., 2016)。

RNA水平包括DNA微陣列(基因芯片)(Reymondetal., 2000)、SAGE(serial analysis of gene expression)、miRNA(Marcoetal., 2010)和lncRNA等非編碼RNA；蛋白質(zhì)水平主要是酵母雙雜技術(shù)和AP/MS親和純化質(zhì)譜分析等。在農(nóng)業(yè)昆蟲功能基因組學(xué)研究中，應(yīng)用較多的主要包括一些反求遺傳學(xué)技術(shù)，如突變體的篩選，基因敲除技術(shù)和RNAi技術(shù)(Gordonetal., 2007; Scottetal., 2013)，以及生物信息學(xué)分析，如轉(zhuǎn)錄組RNA-seq，表達譜DGE，蛋白組和代謝組等數(shù)據(jù)分析和功能注釋(Whitfieldetal., 2003; Maetal., 2006; Duceppeetal., 2012)。

RNAi即RNA干擾技術(shù)，利用和靶基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)引起生物體內(nèi)對應(yīng)mRNA的降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制該基因的表達。在2013年有人提出，RNAi是未來防治害蟲的重要手段(Burand and Hunter, 2013)。目前RNAi在農(nóng)業(yè)昆蟲基因功能方面的研究應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛。在蚜蟲上，利用RNAi技術(shù)敲降中腸和唾液腺中的相關(guān)基因可以有效地控制其營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而增加蚜蟲的死亡率和大大縮短其壽命(Muttietal., 2006)，該技術(shù)也是探索褐飛虱翅型分化分子機制方面的重要手段之一。赤擬谷盜具有高效的系統(tǒng)性RNAi機制，對于靶標(biāo)基因的抑制效應(yīng)甚至可以延續(xù)到下一代，因此赤擬谷盜可以作為研究農(nóng)業(yè)昆蟲基因功能的模式生物(Tomoyasuetal., 2004; Brownetal., 2009; Tomoyasuetal., 2008)。在生長發(fā)育和激素調(diào)控方面，利用RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜滯育的發(fā)生和蛻皮激素信號傳導(dǎo)有著密切的關(guān)系(Parthasarathyetal., 2010)。雖然在赤擬谷盜中RNAi能保持其高效性，但是在其他昆蟲體內(nèi)缺少Ago-2、Dcr-2等能夠提升RNAi效率的基因表達，如何在農(nóng)業(yè)昆蟲中普遍提升該技術(shù)的干擾效率也是一個亟待解決的問題。近期沈杰團隊建立了納米材料載體分子高效轉(zhuǎn)染殺蟲生物效應(yīng)分子(包括病毒DNA、dsRNA和Bt蛋白)治理害蟲的新技術(shù)平臺(Heetal., 2013; Liuetal., 2015; Zhengetal., 2016)，為核酸型農(nóng)藥的高效應(yīng)用提供了新技術(shù)基礎(chǔ)。

高通量測序和生物信息學(xué)的發(fā)展使得昆蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組等數(shù)據(jù)信息的獲取更加方便，基因功能的注釋、差異基因的比較和基因表達情況的分析都能給基因功能的研究提供極大的便利。如褐飛虱RNA-seq和DGE的數(shù)據(jù)分析為其生長發(fā)育、翅型分化和性別差異的研究提供了豐富的分子水平的參考依據(jù)(Xueetal., 2010)；通過對飛蝗免疫反應(yīng)的差異轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，飛蝗在感染綠僵菌后，脂肪體內(nèi)和免疫、能量代謝、發(fā)育相關(guān)的基因表達情況會發(fā)生變化，同時血淋巴中調(diào)節(jié)細胞膜透性和細胞免疫的基因也會被激活(Zhangetal., 2015)。當(dāng)然，在擁有這些數(shù)據(jù)基礎(chǔ)后，探索昆蟲各種生物現(xiàn)象具體機制的過程還少不了基本分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。

2.2 生長發(fā)育和生殖

在調(diào)控昆蟲生長發(fā)育和變態(tài)方面的激素主要有蛻皮激素(molting hormone, Ecd)和保幼激素(juvenile hormone, JH)，兩者協(xié)同作用調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的級聯(lián)反應(yīng)和相互作用。關(guān)于蛻皮激素受體和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制已經(jīng)研究的比較深入，而這得益于蛻皮激素受體EcR的發(fā)現(xiàn)以及Ashburner模型的提出(Ashburneretal., 1974)，在Hsp90、Hsc70、和Chd64等伴侶分子的輔助下，蛻皮激素通過與EcR和異源二聚體配體USP在細胞核內(nèi)形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體20E-EcR-USP，調(diào)控HR3、E75、BR-C、E93、bFTZ-F1等轉(zhuǎn)錄因子的表達，這些轉(zhuǎn)錄因子再進一步調(diào)控下游效應(yīng)基因如蛋白酶的表達(Riddifordetal., 1999)，隨后觸發(fā)天冬氨酸凋亡酶編碼基因Dronc和Drice，凋亡激活因子hid和reaper的表達，最終導(dǎo)致昆蟲蛻皮和變態(tài)過程中的細胞凋亡和自噬(Spindleretal., 2009)。最近還有發(fā)現(xiàn)miRNAs let-7，miR-100和miR-125能夠被20E誘導(dǎo)表達用以調(diào)控果蠅的發(fā)育過程(Chawlaetal., 2016)。

由于保幼激素受體一直未能準(zhǔn)確鑒定出來，所以其具體分子作用機制還有待探索。早前Wilson等(1986)通過JH處理突變果蠅發(fā)現(xiàn)methoprene-tolerant(Met)突變體具有更強的JH耐受性，后來JH被證明能夠強烈且特異性地結(jié)合Met(Miuraetal., 2005)，兩者之間存在著相互作用，這些發(fā)現(xiàn)是證明Met為JH受體的重要證據(jù)。但在此之前的研究證明，Met基因缺失的突變體只是在果蠅成蟲的生殖階段存在一定的影響，會導(dǎo)致成蟲產(chǎn)卵延后、生殖力下降等，胚后發(fā)育一切正常(Pursleyetal., 2000)，與隨后的推測存在矛盾。目前比較可信的推測是JH存在兩個受體，Met和Germ cell-expressed(Gce)，只有存在雙突變時才會出現(xiàn)JH完全缺失的致死現(xiàn)象(Abdouetal., 2011;Bernardo and Dubrovsky, 2012)。JH與受體結(jié)合后啟動Kr-h1基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響昆蟲的生長發(fā)育(Zhou and Riddiford, 2002 )。蛻皮激素信號和保幼激素信號發(fā)生相互作用的階段很有可能發(fā)生在Kr-h1對下游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控階段。

揭示蚜蟲孤雌生殖現(xiàn)象機理目前進展困難，目前主要技術(shù)還是利用分子遺傳標(biāo)記和生殖方式轉(zhuǎn)換過程中的基因表達ESTs來推測，尚需進一步在功能基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)上再做突破。保幼激素信號通路可能決定了雌蚜生殖方式轉(zhuǎn)換(Ogawa and Miura, 2014)，但是其具體機制還尚未揭示。在研究孤雌蚜卵子的發(fā)生過程實驗中發(fā)現(xiàn)Spol1基因活性發(fā)生改變(Srinivasanetal., 2014)，而這一改變很有可能參與到了生殖方式轉(zhuǎn)變的分子調(diào)節(jié)過程。

2.3 多型現(xiàn)象

蚜蟲與褐飛虱都存在翅型分化的現(xiàn)象，長翅型具有較強的遷飛能力，這是其能夠跨區(qū)域為害的重要原因之一。而飛蝗雖然具有很強遷飛能力，但是繁殖力與蚜蟲比較卻差了許多，這就需要保證其遷飛群體的數(shù)量基礎(chǔ)：從散居型蝗蟲轉(zhuǎn)換為群居型。

2.3.1 褐飛虱的翅型分化

褐飛虱是較早引入組學(xué)分析來研究翅型分化的物種，通過褐飛虱長短翅型表達譜的對比分析，篩選出了700多個與生殖、脂類代謝和肌肉合成等相關(guān)的基因(Xueetal., 2010)。隨后比較將要分化為長短翅的褐飛虱若蟲的差異表達基因，篩選出1000多個差異基因，其中包含了Notch和Wnt/Wingless兩個與翅發(fā)育相關(guān)信號通路的部分基因(Huetal., 2013)。通過分析褐飛虱與水稻成熟時期發(fā)現(xiàn)，褐飛虱長翅型的出現(xiàn)于水稻黃熟期，而此時稻株營養(yǎng)條件變差，胰島素信號通路能夠感受糖類和氨基酸濃度的變化，長翅型的發(fā)生和胰島素信號通路可能存在一定的相關(guān)性。通過dsRNA干擾褐飛虱胰島素受體實驗發(fā)現(xiàn)，胰島素受體NlInR2被干擾后，長翅型比例達到了90%以上，而NlInR1被干擾后長翅型基本上全為長翅，隨后胰島素信號通路其他相關(guān)基因NlFoxo、NlChico、NlAkt對褐飛虱翅型分化都有一定的調(diào)節(jié)作用(Xueetal., 2014; Xuetal., 2015)。褐飛虱Lim-homeobox基因家族中的ApterousA(apA)后來也被證明能夠調(diào)節(jié)成蟲翅的長短和翅毛的形成(Liuetal., 2015)。

2.3.2 亞洲飛蝗散居型與群居型的轉(zhuǎn)換

在飛蝗散居型與群居型轉(zhuǎn)換的問題上，環(huán)境是如何引起其內(nèi)在基因表達的分子機制方面的研究一直是一個空白(Pener and Simpson, 2009)。兩種類型的飛蝗在其編碼和非編碼RNA的表達模式上有著很大的差異，這說明在遺傳和表觀遺傳水平上的調(diào)控，對兩型的轉(zhuǎn)換至關(guān)重要(Kangetal., 2004; Maetal., 2006; Weietal., 2009)。通過兩種類型飛蝗差異表達基因的分析發(fā)現(xiàn)，兒茶酚胺代謝途徑在群居型飛蝗中的表達上調(diào)程度最高，同時RNAi干擾實驗證明了參與多巴胺生物合成和釋放的基因pale、henna和vat1是調(diào)控兩型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵基因(Maetal., 2011)。這說明了多巴胺在調(diào)節(jié)兩型轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵作用。隨后，又有發(fā)現(xiàn)證明，MircoRNA-133在表觀水平能夠抑制群居型飛蝗的形成，而MircoRNA-133主要是通過與pale、henna基因編碼區(qū)域和3′端的非翻譯區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式來調(diào)控多巴胺的合成釋放(Yangetal., 2014)。微孢子寄生飛蝗后，其后腸中過氧化物酶和抗菌肽的合成減少，富集的活性氧物質(zhì)會導(dǎo)致其酸堿環(huán)境的失衡，腸道環(huán)境酸化，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，排泄物中的誘集素減少，同時多巴胺的合成也會受到抑制，使得群居型飛蝗向散居型轉(zhuǎn)變(Shietal., 2014; Tanetal., 2015)。

2.4 抗藥性

在害蟲的化學(xué)防治過程中，昆蟲所產(chǎn)生的化學(xué)農(nóng)藥抗性問題越來越突出，但是關(guān)于抗藥性問題的研究一直處于生理生化水平上，如代謝抗性解毒酶及蛋白(細胞色素P540、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶GST、非專一性酯酶EST等)，靶標(biāo)抗性解毒酶及蛋白(乙酰膽堿酯酶AChE、神經(jīng)突觸鈉離子通道、γ-氨基丁酸受體氯離子通道等)等生理活性的研究，而這些物質(zhì)是如何提升昆蟲抗藥性的分子機制還有待解析。各種農(nóng)業(yè)昆蟲基因組測序完成后，抗藥性機制將從分子水平得以進一步的揭示。通過克隆分析，一些可能對昆蟲抗藥性存在影響的候選基因已經(jīng)被篩選出來，而這些基因在調(diào)控各種解毒酶及蛋白合成和活性方面的功能也逐漸得到證實。

2.4.1 抗藥性的分子基礎(chǔ)

許多研究表明，基因的過量表達是昆蟲形成抗藥性的重要原因之一。昆蟲體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細胞色素P450基因有CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP18、CYP28、CYP49和CYP301等(Amenyaetal., 2008)，其中CYP6家族中的CYP6A1、CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B1和CYP6D1等基因與昆蟲抗藥性有關(guān)(Carinoetal., 1994; Brunetal., 1996; Maitraetal., 2000; Montietal., 2012)，這些基因在具有抗藥性的昆蟲體內(nèi)表達量會高于正常水平，這一現(xiàn)象有可能是mRNA轉(zhuǎn)錄增強或mRNA穩(wěn)定性增加而導(dǎo)致的(Brandtetal., 2002; Karunkeretal., 2008)。家蠅CYP6D1基因的轉(zhuǎn)錄抑制實驗發(fā)現(xiàn)，CYP6D1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的提高是其對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的根本原因，而這種轉(zhuǎn)錄增加有可能是受到常染色體I、II上的順式調(diào)控元件所控制(Liu and Scott, 1998)，棉鈴蟲CYP6B7的過表達實驗則表明其機制有可能是調(diào)節(jié)基因的突變所引起(Amenyaetal., 2008)。除此之外，Devonshire和Vaughan等人的發(fā)現(xiàn)也指出EST和GST基因過量表達有可能是由于基因擴增而引起的(Vaughanetal., 1997; Devonshireetal., 1998; Bassetal., 2014)。

結(jié)構(gòu)基因的突變也可能會增強昆蟲的抗藥性，被報道的P450家族基因越來越多，其原因很有可能與合成P450的基因突變有關(guān)。結(jié)構(gòu)基因的突變能夠引起昆蟲抗性，以增加個體在種群中的適合度。酯酶基因發(fā)生的突變可以引起酶活性位點氨基酸的替換，使昆蟲獲得水解殺蟲劑的能力。通過比較4種不同家蠅品系的MdaE7基因發(fā)現(xiàn)，家蠅針對有機磷殺蟲劑具有抗性的情況存在著G-D和W-L兩個突變位點，其中的G-D突變也是銅綠蠅Luciliacuprina對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的原因(Claudianosetal., 1999; Taskinetal., 2004)。對家蠶的體外定點突變實驗發(fā)現(xiàn)，G/A151D和W271L突變降低了羧酸酯酶原有的活性，而增加了其有機磷的水解活性(Cuietal., 2011)。除了解毒酶活性的突變，通過靶標(biāo)基因的突變也能產(chǎn)生抗藥性。目前發(fā)現(xiàn)的60多種對有機磷農(nóng)藥存在抗性是基于CarE和AChE基因突變產(chǎn)生的。

2.4.2 抗性基因的篩選

轉(zhuǎn)錄組是一種相當(dāng)有效的途徑，能用來發(fā)現(xiàn)新基因或者新的基因功能，基因芯片在表達譜的比對效率上表現(xiàn)驚人(Zhuetal., 2011)。通過對32種基因型桃蚜轉(zhuǎn)錄組的基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，對殺蟲劑存在敏感性的品系體內(nèi)183個基因的表達量出現(xiàn)了上調(diào)，這些基因主要和能量代謝、解毒酶的合成、蛋白的跨膜運輸基以及表皮蛋白合成有關(guān)。通過鈉離子通道突變獲得抗藥性品系中，17個編碼解毒酶、肽酶以及表皮蛋白的基因出現(xiàn)了過量表達。而具有多種抗性途徑的品系中只有7個基因出現(xiàn)了上調(diào)，一些解毒作用相關(guān)的基因反而出現(xiàn)了下調(diào)(Silvaetal., 2012)。這些結(jié)果表明敏感性品種在轉(zhuǎn)錄水平上具有很高的可塑性，產(chǎn)生抗藥性的可能性也會更高，反而一些高抗性品種的轉(zhuǎn)錄水平可塑性卻越來越低。轉(zhuǎn)錄組和基因芯片等數(shù)據(jù)分析技術(shù)的應(yīng)用能夠更好更方便的尋找調(diào)控昆蟲抗性形成的基因，幫助我們揭示抗藥性產(chǎn)生的分子機理。

2.5 嗅覺感受機制

昆蟲尋覓食物主要依靠其靈敏的嗅覺，針對昆蟲感受外界化學(xué)信號分子的研究已經(jīng)有了大量的進展，豐富的氣味分子結(jié)合蛋白(OBPs)被發(fā)現(xiàn)，氣味分子的受體(ORs)以及與信號傳遞的分子也逐漸從各種昆蟲體內(nèi)分離出來。

昆蟲感受氣味的分子基礎(chǔ)在于其擁有氣味分子結(jié)合蛋白(OBPs)、氣味分子降解酶(ODEs)、嗅覺受體蛋白(ORs)、促離子型受體(IRs)和感覺神經(jīng)膜蛋白(SNMPs)等多種氣味結(jié)合分子和信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。其中OBPs是連接外界環(huán)境和ORs之間的橋梁(Leal, 2005)，能夠?qū)⑼饨鐨馕斗肿舆\輸至ORs，此時ORs以異聚體的形式被氣味分子激活，并將信號繼續(xù)向下傳導(dǎo)(Laughlinetal., 2008)，隨后氣味分子被釋放并由ODEs降解(Lealetal., 2005; Sanes and Plettner, 2016)，從而終止信號。除此之外，可能還存在其他的分子陷阱來終止氣味信號的傳導(dǎo)(Kaissling, 2009)，在蛾類昆蟲中發(fā)現(xiàn)信號是被酯酶所終止(Chawla and Sokol， 2012)，其具體的分子機制還有待探索。

OBPs在提升昆蟲嗅覺靈敏度方面作用顯著，它能夠促進疏水分子穿過親水的感受器淋巴。通過分析幾種虐蚊基因組發(fā)現(xiàn)，編碼合成OBPs的基因存在50多個，而這50個OBP基因僅僅只是整個昆蟲群體中的一小部分(Leal, 2013)，那么種類繁多的OBP基因很有可能決定了昆蟲對于外界不同氣味分子的敏感性，同時ORs在昆蟲體內(nèi)也存在一定的多樣性(Wanneretal., 2010)，關(guān)于昆蟲對于氣味分子選擇性的問題，目前來說可能存在兩種假設(shè)，一種是由受體ORs多樣性決定，一種是由OBPs和氣味分子結(jié)合體多樣性來決定。

2.6 代謝及內(nèi)共生現(xiàn)象

代謝組學(xué)是以轉(zhuǎn)錄組和蛋白組為基礎(chǔ)，用來研究昆蟲發(fā)育、變態(tài)以及免疫反應(yīng)等生理過程中物質(zhì)能量代謝的重要手段之一(Binoetal., 2004; Pujoletal., 2012)，是遺傳學(xué)和生物化學(xué)之間的重要橋梁。農(nóng)業(yè)昆蟲由于食性和代謝特點等緣故無法直接獲取一些必需的營養(yǎng)物質(zhì)，對于其代謝組學(xué)的研究往往需要結(jié)合寄主植物和腸道微生物。

某些葉甲和鳳蝶能夠取食草酸含量很高的寄主植物(Miyagietal., 2010)，比較兩者代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在兩種昆蟲體內(nèi)乳酸會迅速向丙酮酸轉(zhuǎn)化，最后生成丙氨酸，在此過程中產(chǎn)生的NADH能夠參與到后續(xù)的能量代謝途徑三羧酸循環(huán)TCA和糖酵解途徑中(Miyagietal., 2013)，這一發(fā)現(xiàn)是對經(jīng)典能量代謝過程的重要補充。核磁共振技術(shù)在薊馬代謝組中的應(yīng)用揭示了薊馬產(chǎn)生趨避植物抗性的關(guān)鍵物質(zhì)(Leissetal., 2009)。代謝組和昆蟲腸道微生物的結(jié)合解釋了取食植物莖稈的昆蟲在自身不具備消化一些大分子物質(zhì)(纖維素、木聚糖等)能力的情況下，是如何同化糖類等營養(yǎng)物質(zhì)的(Wenzeletal., 2002; Milleretal., 2008)。

腸道中的共生菌作為必需氨基酸的重要來源(Baumann, 2005)，一直是研究的熱點問題，蚜蟲內(nèi)共生菌基因組的測序也已完成，所以目前將其作為研究昆蟲與內(nèi)共生菌營養(yǎng)代謝的模式昆蟲是最好的選擇(Douglas and Prosser, 1992; Shigenobuetal., 2000; Wilsonetal., 2010)。通過對蚜蟲共生菌和其他身體組織的轉(zhuǎn)錄組及信號通路的對比分析發(fā)現(xiàn)，在共生菌中26個與氨基酸生物合成相關(guān)的基因表達量出現(xiàn)了上調(diào)，其中的7個基因參與到了蚜蟲必需氨基酸的合成。氨基酸氮元素的補給是將胺態(tài)氮經(jīng)過谷氨酸循環(huán)同化為谷氨酸鹽，谷氨酸鹽循環(huán)是整個蚜蟲與內(nèi)共生菌共氮素代謝的橋梁(Hansen and Moran, 2011)。通過利用蚜蟲和內(nèi)共生菌的16s rDNA、F-ATPase復(fù)合體β亞基序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹比較發(fā)現(xiàn)，兩者在進化上存在平行的關(guān)系(Martinezetal., 2001)。腸道微生物除了在代謝方面和昆蟲存在依存關(guān)系外，在調(diào)控昆蟲行為方面也有一定的作用，如上述提到的腸道微生物結(jié)構(gòu)的變化引起飛蝗群居型和散居型轉(zhuǎn)變。

2.7 天敵昆蟲及其與寄主的關(guān)系

除捕食性天敵外，利用寄生性天敵防治害蟲已經(jīng)成為生物防治的重要手段之一。寄生蜂之所以能成功寄生害蟲，在于其所攜帶的一些能夠影響害蟲防御反應(yīng)的物質(zhì)，如毒液、多DNA病毒(polydnavirus， PDV)等(陳學(xué)新等，2013)。2010年，3種金小蜂基因組的測序工作已經(jīng)完成，并揭示了寄生蜂在調(diào)控寄主免疫和發(fā)育等生理過程中的可能存在的分子機制，這一成果為害蟲生物防治提供了最基本的工具和其所需要的遺傳學(xué)背景(Werrenetal., 2010)。隨后研究發(fā)現(xiàn)，金小蜂DNA甲基化的現(xiàn)象與其發(fā)育過程存在動態(tài)變化的關(guān)系(Wangetal., 2013)，而這一現(xiàn)象很有可能同寄主發(fā)育過程存在一定的關(guān)聯(lián)。寄生蜂的毒液在進入寄主體內(nèi)后能夠引起ESC(Enhancer of split comlex)家族基因表達量的上調(diào)，導(dǎo)致寄主神經(jīng)細胞死亡，發(fā)育停滯，同時促進寄主體內(nèi)抗菌肽的產(chǎn)生等一系列生理反應(yīng)(Martinsonetal., 2014)。

3 展望

雖然目前農(nóng)業(yè)昆蟲在功能基因組學(xué)方面的研究深度還有欠缺，如生長發(fā)育的分子調(diào)節(jié)、蚜蟲生殖方式轉(zhuǎn)換機制，氣味信號的終止方式、遷飛行為的預(yù)測等。但是隨著越來越多農(nóng)業(yè)昆蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等組學(xué)研究的深入，更多模式昆蟲的確立，將會給農(nóng)業(yè)昆蟲在各種領(lǐng)域內(nèi)的研究帶來極大的便利。在抗藥性方面，通過對昆蟲體內(nèi)整套遺傳信息進行研究，構(gòu)建遺傳連鎖圖片，采用基因芯片分析，對篩選抗性主效基因和發(fā)現(xiàn)抗性機制都有巨大的幫助；將為害蟲抗性監(jiān)測和新型藥劑的研制提供更加科學(xué)有效的指導(dǎo)。在生長發(fā)育方面，JH受體的確定和信號傳導(dǎo)途徑以及Ecd和JH之間是如何構(gòu)建起交互作用等問題，在遺傳操作技術(shù)和突變體體系構(gòu)建的基礎(chǔ)下也能迎刃而解。果蠅在發(fā)育生物學(xué)上的研究已經(jīng)相當(dāng)深入，加之昆蟲間的信號傳導(dǎo)通路存在較高的保守性，這為農(nóng)業(yè)昆蟲在生長發(fā)育方面的研究提供了有價值的參考。

昆蟲表觀遺傳水平的研究也越來越受到重視，如染色體免疫共沉淀技術(shù)，DNA甲基化、miRNA和lncRNA等非編碼RNA的調(diào)控在農(nóng)業(yè)昆蟲功能基因組學(xué)上的研究和應(yīng)用也越來越多，包括褐飛虱在內(nèi)的一些昆蟲都對體內(nèi)非編碼RNA進行了測序和分析，飛蝗miRNA對群居型和散居型轉(zhuǎn)換現(xiàn)象調(diào)控作用是非編碼RNA調(diào)控昆蟲生物現(xiàn)象相關(guān)研究的重要進展，而這一發(fā)現(xiàn)也為農(nóng)業(yè)昆蟲各種生物現(xiàn)象的研究提供了一個新的方向，RNAi技術(shù)與納米材料的結(jié)合將會給昆蟲基因功能的研究提供極大的便利。此外蚜蟲的孤雌生殖和翅型分化的分子機理、新型不飛行天敵昆蟲品系的培育與應(yīng)用等基礎(chǔ)和應(yīng)用領(lǐng)域預(yù)期將出現(xiàn)突破性進展。害蟲與天敵是如何協(xié)同進化，寄生性天敵所攜帶的毒液、PDV及畸形細胞等是如何調(diào)控寄主免疫和發(fā)育行為的具體分子機制，將會得到進一步的揭示。利用天敵-害蟲-環(huán)境三者間的互作關(guān)系來實現(xiàn)生物防治的可持續(xù)化，也將會是生物防治研究人員的重要目標(biāo)。

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Research on functional genomics of agriculture insects:Review and prospect

ZHOU Hang,SHEN Jie*

(Department of Entomology, China Agricultral University,Beijing 100193,China)

Insects that have most variety of species and massive populations in the world are tightly related to the daily life of human beings. They have already been a part of agriculture that cannot be ignored. The rapid progress on genome sequence have greatly promoted the insect functional genomics. In this review, we summarized the latest and main progresses on development, polytypism, insecticide resistance, chemoreception, metabolomics and intestinal microflora in agricultural insect functional genomics, also made expectation about application of new methods and new techniques in future research.

Genome; functional genomics; agricultural insects

國家自然科學(xué)基金(31372255)

周行，男，1991年生，湖北武漢人，博士研究生，研究方向為昆蟲遺傳發(fā)育與基因組學(xué)，E-mail: zhouhangCAU@163.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: shenjie@cau.edu.cn

Received: 2016-12-19; 接受日期Accepted：2017-01-09

特邀稿件InvitedReview

Q963;S433

A

1674-0858(2017)02-0239-10

周行，沈杰.農(nóng)業(yè)昆蟲的功能基因組學(xué)研究：回顧與展望[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2017,39(2):239-248.