史 麗，張夢靖，申榮榮，李順德，白 娟，王永杰，何國瑋，崔 悅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，呼和浩特 010019)

同脈縞蠅亞屬種團間的系統(tǒng)發(fā)育關系初探

史 麗*，張夢靖，申榮榮，李順德，白 娟，王永杰，何國瑋，崔 悅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，呼和浩特 010019)

選取2個線粒體基因COI和16S-rRNA，2個核基因Elongation factor 1-α和28S-rRNA，初步探討同脈縞蠅亞屬種團間的系統(tǒng)發(fā)育關系，研究表明，翅斑的減少是趨于原始的性狀；基于線粒體基因COI和16S-rRNA構建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹中，MP樹更與形態(tài)分類的研究結果一致；而基于Elongation factor 1-α和28S-rRNA基因構建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹反映的系統(tǒng)發(fā)育關系完全相同；以同脈縞蠅亞屬18種為代表構建的6個種團的系統(tǒng)發(fā)育關系并沒有呈現(xiàn)出一致的規(guī)律性，不能從分子水平驗證根據(jù)已有的外部形態(tài)特征劃分種團的可靠性。

縞蠅科；同脈縞蠅亞屬；系統(tǒng)發(fā)育；種團

縞蠅主要營菌食性和腐食性生活，在降解有機質(zhì)、保護環(huán)境、維持生態(tài)平衡中起著非常重要的作用；部分屬的成蟲可訪花，有助于植物傳粉(Silva and Mello, 2008)?？c蠅對環(huán)境變化敏感，是陸生生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境變化評價的指示生物之一(Reddersen, 1995)。同脈縞蠅亞屬隸屬于雙翅目縞蠅科Lauxaniidae同脈縞蠅亞科Homoneurinae同脈縞蠅屬，是縞蠅科中具有生態(tài)和經(jīng)濟重要性的一大類群，物種多樣性豐富。我國已知20種團，145種(Shi and Yang, 2009, 2014)。種團的建立是基于翅斑和雄性外生殖器相結合的特征進行人為劃分的，本實驗旨在從分子手段，檢驗已劃分種團的可靠性，并依據(jù)分子數(shù)據(jù)，推導種團間鑒別的關鍵形態(tài)特征，這對于深入分析同脈縞蠅亞科同脈縞蠅屬不同亞屬間的系統(tǒng)發(fā)育關系具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野外采集的標本，直接浸泡于無水乙醇中保存，回到實驗室后，更換一次無水乙醇，然后，置于-20℃冰箱中保存。標本信息見下表1。

表1 物種信息

1.2 實驗方法

1.2.1 標本解剖和鑒定

在光學解剖鏡下，用眼科專用手術剪刀小心剪下腹部相應部分或從胸部和腹部連接處取下整個腹部；將解剖后的腹部置于10% NaOH溶液中，8 h，待腹部大部分肌肉和脂肪溶解后取出，用清水小心漂洗，并將其置于盛有適量水或甘油的培養(yǎng)皿內(nèi)的小脫脂薄棉層上，以待觀察；在觀察結束后，用解剖針將剝離的外生殖器輕輕撥入后腹部，用蘸有適量甘油的小包裹，將之轉(zhuǎn)入外生殖器專用塑料小管中保存。結合相關種類鑒定資料，最終鑒定到種。

1.2.2 DNA提取

采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)TIANGEN(李軒昆，2015)。

1.2.3 PCR擴增與測序

引物合成和雙向測序均由上海生物工程有限公司完成。長度在1 kb以內(nèi)的片段，釆用PCR反應體系(50 μL)擴增，反應程序為：94℃預變性3 min，95℃變性30 s，48℃-55℃退火45 s，72℃延伸1-2 min，擴增35個循環(huán)，72℃終延伸7 min，4℃保存；長度在1 kb以上的片段，釆用PCR反應體系(25 μL)，反應程序為：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，48℃-55℃退火50 s，65℃延伸2-6 min，擴增45個循環(huán)，65℃終延伸10 min，4℃保存(張廣宇，2014)。

表2 用于擴增分子標記的引物

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和分析

選取縞蠅亞科Lauxaniinae雙鬃縞蠅屬Sapromyza和黑縞蠅屬Minettia、斑腹蠅科Chamaemyiidae斑腹蠅屬Chamaemyia和沼蠅科Sciomyzidae沼蠅屬Sciomyza作外群，將同脈縞蠅亞科Homoneurinae同脈縞蠅亞屬Homoneura的種類的序列，用Mega 7.0中的CLUSTALX進行序列比對(均用默認參數(shù)設置)。將比對后的結果轉(zhuǎn)換成Mega格式，用Mega 7.0基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型，計算兩兩個體之間的遺傳距離，使用1000次重復檢測的Bootstrap值表示樹上各節(jié)點的支持率，采用鄰接法(NJ)、最小進化法(ME)、最簡約法(MP)構建同脈縞蠅亞屬種團間系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

采用MEGA 7.0系統(tǒng)發(fā)育分析軟件，構建同脈縞蠅亞屬種團間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.1 基于COI基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖1顯示，系統(tǒng)樹的最頂部聚類的是新北區(qū)分布的種類(philadelphica，fraterna，bispina，incerta，biumbrata)，包括了abnormisgroup[H.(H.)philadelphica和H.(H.)incerta]與singularisgroup[H.(H.)fraterna]，sauterigroup[H.(H.)bispina]，quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]；其中，abnormisgroup[H.(H.)philadelphica]和singularisgroup[H.(H.)fraterna]聚為一支，abnormisgroup[H.(H.)incerta]與quinquenotatagroup聚為一支。中部是印度馬來亞區(qū)分布的種類(dorsacerba，apicitrunctata，fengyangshanica)，包括了singularisgroup [H.(H.)dorsacerba和H.(H.)fengyangshanica]，calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]，這一支的特點是縱脈R4+5上有2個以上的褐色中斑或端前斑。下部是古北區(qū)分布的種類(pictipennis，stackelbergiana，patelliformis，septentrionalis)，包括了tibetensisgroup[H.(H.)pictipennis]，quinquenotatagroup[H.(H.)stackelbergiana]，unguiculatagroup[H.(H.)patelliformis]，sauterigroup[H.(H.)septentrionalis]；其中，tibetensisgroup和quinquenotatagroup聚為一支，而H.(H.)patelliformis單獨為一支，可能是因為其翅前緣黑色短鬃不伸達R4+5，這一特征也為Sapromyza屬的部分種類所特有。從樹的頂端至底端，種團內(nèi)種類的翅斑數(shù)量呈現(xiàn)遞減的趨勢。這4個系統(tǒng)樹中，MP樹更與形態(tài)分類相吻合。

2.2 基于16S-rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2顯示，僅有H.(H.)apicitrunctata和H.(H.)dorsacerba是印度馬來亞區(qū)分布，其余種類均為古北區(qū)分布。頂部一支包括calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]或singularisgroup[H.(H.)dorsacerba]，sauterigroup[H.(H.)remmi]，quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]，singularisgroup[H.(H.)dilecta]；底部一支包括unguiculatagroup[H.(H.)thalhammeri和H.(H.)patelliformis]，sauterigroup[H.(H.)mediospinosa]。而singularisgroup[H.(H.)dorsacerba]或calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]單獨一支，可能是與其印度馬來亞區(qū)分布有關，但證據(jù)不充分。這4個系統(tǒng)樹中，MP樹更與形態(tài)分類相吻合。

圖2 基于16S-rRNA基因的系統(tǒng)樹Fig.2 Cladistic tree based on the 16S-rRNA gene

2.3 基于28S-rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3顯示，系統(tǒng)樹頂部quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]與sauterigroup[H.(H.)remmi]、singularisgroup[H.(H.)dilecta]聚為一支，singularisgroup[H.(H.)dorsacerba]和calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]聚為一支，而sauterigroup[H.(H.)mediospinosa和H.(H.)septetrionalis]、unguiculatagroup[H.(H.)thalhammeri和H.(H.)patelliformis]、tibetensisgroup[H.(H.)pictipennis]分別聚為一支。與COI和16S-rRNA基因的系統(tǒng)樹相比，所選四種方法的系統(tǒng)樹呈現(xiàn)的系統(tǒng)發(fā)育關系完全相同，且有一定的規(guī)律性，比如翅斑減少這一特征更為原始，或許在自然界中，昆蟲翅斑增加，呈現(xiàn)擬態(tài)或保護色，更容易繁衍生息。

2.4 基于Elongation factor 1-α基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4顯示，singularisgroup[H.(H.)dilecta]和quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]的系統(tǒng)發(fā)育關系最近，calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]與sauterigroup[H.(H.)interstincta，H.(H.)mediospinosa，H.(H.)remmi]和unguiculatagroup[H.(H.)patelliformis]的關系最遠。與28S-rRNA基因的系統(tǒng)樹相比，所選4種方法的系統(tǒng)樹呈現(xiàn)的系統(tǒng)發(fā)育關系也是完全相同，且有一定的規(guī)律性。但是，由于這個基因比前述3個基因更難擴增，因此，可選昆蟲種類明顯少。

3 結論與討論

選取4種基因，對同脈縞蠅亞屬內(nèi)種團間的系統(tǒng)發(fā)育關系進行初探，結果表明，翅斑的減少是趨于原始的形狀；基于線粒體基因COI和16S-rRNA構建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹中，MP樹更與形態(tài)分類的研究結果一致；而基于Elongationfactor 1-α和28S-rRNA基因構建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹反映的系統(tǒng)發(fā)育關系完全相同；以同脈縞蠅亞屬18種為代表構建的6個種團的系統(tǒng)發(fā)育關系并沒有呈現(xiàn)出一致的規(guī)律性，不能從分子水平驗證根據(jù)已有的外部形態(tài)特征劃分種團的可靠性。

圖3 基于28S-rRNA基因的系統(tǒng)樹Fig.3 Cladistic tree based on the 28S-rRNA gene

圖4 基于Elongation factor 1-α基因的系統(tǒng)樹Fig.4 Cladistic tree based on the Elongation factor 1-α gene

標本野外采集過程中，使用了乙酸乙酯，可能存在使用過量的問題，且蟲體接觸到了乙酸乙酯，因此，盡管實驗采用了當年采集的新鮮標本，提取DNA后，測序結果并不如預期的那么理想，這大大的限制了原實驗計劃中的樣本的選擇。Elongation factor 1-α基因片段較難擴增成功，需要在引物設計和PCR擴增條件方面進行改進。文中涉及的Homoneura(H.)incerta、Homoneura(H.)fraterna、Homoneura(H.)bispina在Miller(1977)的新北區(qū)同脈縞蠅亞屬種團劃分的研究論著中，分別隸屬于incertagroup、fraternagroup和bispinagroup中；而Homoneura(H.)dilecta、Homoneura(H.)remmi在Papp(1978)關于古北區(qū)同脈縞蠅種團劃分的研究論文中，分別隸屬于notatagroup和minorgroup；這兩位學者的種團劃分標準主要是依據(jù)雄性外生殖器各部分的特征。同脈縞蠅屬是縞蠅科中最大的屬，而同脈縞蠅亞屬是這個屬中最大的亞屬，世界已知600余種，如果能選擇合適的特征形狀，正確劃分種團，將為同脈縞蠅亞屬世界區(qū)系的修訂奠定基礎。

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Preliminary study on phylogeny of species groups in subgenusHomoneura

SHI Li*, ZHANG Meng-Jing, SHEN Rong-Rong, LI Shun-De, BAI Juan, WANG Yong-Jie, HE Guo-Wei, CUI Yue

(College of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China)

Based on two mitochondrial genes (COI and 16S-rRNA) and two nuclear genes (Elongation factor 1-alpha and 28S-rRNA), the phylogenetic relationships among six species groups of subgenusHomoneurawere preliminarily studied. The results showed that decreasing in quantity of wing spots is a trend to origin; the phylogeny presented from MP could keep better accord with morphological taxonomy than others among the NJ, ME, MP and ML builted by mitochondrial genes (COI and 16S-rRNA), while all NJ, ME, MP and ML builted by the nuclear genes (Elongation factor 1-alpha and 28S-rRNA) phylogeny reflected the same phylogenetic relationships. The phylogenetic relationships from 18 representative species of 6 species groups of subgenusHomoneuracould not show some consistent regularity, so the reliability of the existing species group constructed with artificial classification could not be verified from the molecular level.

Lauxaniidae;Homoneura; phylogeny; species groups

國家自然科學基金(31260525)；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學生科學創(chuàng)新基金(DC201506)；內(nèi)蒙古杰出青年培育基金(2015JQ03)

史麗，女，1976年生，教授，研究方向為昆蟲系統(tǒng)進化與生物多樣性

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: lirui2003@imau.edu.cn

Received: 2016-12-30; 接受日期Accepted: 2017-02-17

Q963

A

1674-0858(2017)02-0351-06

史麗，張夢靖，申榮榮，等.同脈縞蠅亞屬種團間的系統(tǒng)發(fā)育關系初探[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(2):351-356.