吳劉成，杜利莉，王 靜，殷海琳，馬 超，蔣茂榮，邵義祥△

(1 南通大學(xué)杏林學(xué)院，江蘇南通 226009；2 南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001)

miR-204對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)特性的影響*

吳劉成1，2，杜利莉1，王 靜1，殷海琳1，馬 超1，蔣茂榮2，邵義祥2△

(1 南通大學(xué)杏林學(xué)院，江蘇南通 226009；2 南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001)

目的 研究microRNA-204(miR-204)對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法 在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染miR-204模擬物和抑制劑后48 h，實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-204表達(dá)變化。流式細(xì)胞儀分析miR-204對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡的影響。采用Transwell遷移小室分析法檢測(cè)miR-204對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光PCR分析：miR-204模擬物和抑制劑效果顯著，與正常對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；流式細(xì)胞儀分析：與正常對(duì)照相比，miR-204 模擬物組G1期細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.01)，而miR-204 抑制劑的作用則相反，G1期細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)；miR-204模擬物組明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.01)，而抑制劑組明顯抑制細(xì)胞凋亡(P<0.01)。Transwell遷移小室分析：miR-204 模擬物組穿過Transwell遷移小室的細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，而抑制劑組則相反，細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.01)。結(jié)論 miR-204對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用，能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

乳腺腫瘤；細(xì)胞凋亡；微RNAs；miR-204；MDA-MB-231；細(xì)胞生物學(xué)特性

乳腺癌是嚴(yán)重危害生命健康的惡性腫瘤之一，是女性第2位最常見的惡性腫瘤[1]，且乳腺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]。目前，已經(jīng)有開發(fā)相關(guān)的靶向藥物用于臨床治療，但療效并不樂觀，分子靶向治療被認(rèn)為是一種有效途徑[3]。微小RNA(miRNA)的出現(xiàn)為研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的策略和思路。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-204(miR-204)過表達(dá)則可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[4]。顯然miR-204對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，而在乳腺癌中研究的還比較少。因此，本試驗(yàn)構(gòu)建miR-204的模擬物及抑制劑，并轉(zhuǎn)染作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，研究對(duì)該細(xì)胞的行為學(xué)變化，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 使用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó))；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；ABI stepone 實(shí)時(shí)熒光PCR (Real-Time PCR) System (ABI公司，美國(guó))；低溫冷凍離心機(jī) (Eppendorf公司，德國(guó))。1640培養(yǎng)基，胎牛血清(HyClone公司，美國(guó))；Trizol (Invitrogen公司，美國(guó))；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(碧云天生物科技公司，中國(guó))；riboFECTTMCP 轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó))；SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR(Roch公司，瑞士)；Omniscript?Reverse Transcription kit (Qiagen公司，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 按照常規(guī)的細(xì)胞凍融方法操作，以緩凍速溶為原則，將凍存細(xì)胞從-80 ℃冰箱中取出，迅速放入37 ℃的水浴，使其快速融化，之后加入完全培養(yǎng)基。放入CO2培養(yǎng)箱，第2天更換培養(yǎng)基，每隔1～2天或者培養(yǎng)基變?yōu)辄S色時(shí)更換培養(yǎng)基。

1.2.2 miR-204轉(zhuǎn)染細(xì)胞方法 轉(zhuǎn)染前1 d細(xì)胞接種至6孔板中，密度為1×105，采用含有10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到50%～80%。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照riboFECTTMCP 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)組：正常對(duì)照組加入500 μL的磷酸鹽緩沖液(PBS)；陰性對(duì)照組加入陰性對(duì)照mimic及riboFECTTMCP Reagent；抑制劑組加入miR-204抑制劑及riboFECTTMCP Reagent；模擬物組加入miR-204 mimic及riboFECTTMCP Reagent。之后將6孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)miR-204表達(dá)水平 本試驗(yàn)檢測(cè)miR-204采用U6作為內(nèi)參，其中RT反應(yīng)中的頸環(huán)引物和Real-time PCR反應(yīng)中的頸環(huán)引物，均由廣州銳博生物有限公司設(shè)計(jì)并合成。細(xì)胞總RNA提取。轉(zhuǎn)染48 h，然后棄掉培養(yǎng)基，使用預(yù)冷PBS緩沖液洗2次；6孔板中加入1.0 mL Trizol，水平放置片刻；用槍頭吹打幾次，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，反復(fù)吹打至無明顯沉淀；室溫孵育5 min；加入0.2 mL三氯甲烷；渦旋振蕩器上震蕩15 s；室溫孵育5 min；4 ℃,12 000 r/min,15 min；吸取大約0.5 mL上清液；加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒混勻；室溫孵育10 min；4 ℃，12 000 r/min，10 min；棄去上清液；加入1.0 mL 75%乙醇；輕微混勻，4 ℃,7 500g,5 min，棄去上清液；重復(fù)上一步驟；靜置5～10 min，晾干；用RNase-free水重懸；55～60 ℃水浴10～15 min，超微量分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度。PCR反應(yīng)體系及條件：RNA template (2 μg),Bulge-LoopTMmiRNA RT Primer(62.5 nmol/L) 2.0 μL，加RNase-free water至14 μL,以上體系混勻后，瞬時(shí)離心，70 ℃放置10 min后，再加入以下試劑進(jìn)行RT反應(yīng)，10×Buffer RT 2 μL，dNTP Mix (5 mmol/L each dNTP) 2 μL，RNase 抑制劑 (10 U/μL) 1 μL，Omniscript Reverse Transcriptase 1 μL，total reaction volume 20 μL，瞬時(shí)離心，37 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，于-20 ℃保存。Real-time PCR反應(yīng)體系及條件。20 μL 反應(yīng)體系：2×SYBGreen Master Mix 10 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Forward Primer (5 μmol/L) 2 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Reverse Primer (5 μmol/L) 2 μL，cDNA 2 μL,加ddH2O 至20 μL。試劑混勻后短暫離心置于ABI stepone Real-time PCR 儀，程序如下：95 ℃ 5 min；(95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s收集熒光)×45；55.0～90.0 ℃每上升0.3 ℃讀熒光值生成熔解曲線。每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析擴(kuò)增效率和特異性，并得到各反應(yīng)管的循環(huán)閾值(Ct)，miR-204的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方程進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)方法 分別在6孔板中轉(zhuǎn)染試劑48 h后，按照碧云天生物科技公司試劑盒說明書操作，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞遷移檢測(cè)方法 在6孔板中細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑48 h后，更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，饑餓24 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌再重懸，向Transwell上室中加入200 μL細(xì)胞懸液(2×105)，下室中加入500 μL完全培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[5]操作。

2 結(jié) 果

2.1 miR-204 抑制劑和模擬物轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 4組轉(zhuǎn)染效率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=198.9，P=0.000)。與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組miR-204表達(dá)水平率略有上升，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.637，P=0.062)；抑制劑組miR-204水平明顯下降(t=11.60，P=0.000)；模擬物組miR-204水平明顯上升(t=14.10，P=0.0000)，見圖1。

圖1 4組miR-204表達(dá)水平

A:正常對(duì)照組；B:陰性對(duì)照組；C:抑制劑組；D:模擬物組。

圖2 細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)各組人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖

2.2 細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖 G1期、S期及G2/M期，3個(gè)時(shí)期中的4組百分比細(xì)胞計(jì)數(shù)的均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FG1期=106.98，F(xiàn)S期=25.80，F(xiàn)G2/M期=28.24，P<0.01)。G1期：與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目增多，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，抑制劑組細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.01)，模擬物組細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)。S期：與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目減少，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，抑制劑組細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，模擬物組細(xì)胞數(shù)目略有增多，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。G2/M期：與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目增多，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，抑制劑組細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，模擬物組細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.01)，見圖2、3。

圖3 miR-204對(duì)各組人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響

2.3 細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡 4組百分比細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)的均數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=118.3，P<0.01)。與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.267，P=0.086),抑制劑組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少(t=12.77，P<0.01)，模擬物組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多(t=7.086，P<0.01)，見圖4、5。

A:正常對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：抑制劑組；D：模擬物組。

圖4 細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)各組人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

圖5 miR-204 對(duì)各組人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力 4組遷移細(xì)胞數(shù)目的均數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.77，P<0.01)。與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)目增多，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.011，P=0.369)，抑制劑組細(xì)胞遷移數(shù)目增多(t=6.411，P<0.01)，模擬物組細(xì)胞遷移數(shù)目減少(t=7.115，P<0.01)，見圖6、7。

A:正常對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：抑制劑組；D：模擬物組。

圖6 Transwell小室檢測(cè)各組人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移

圖7 miR-204 對(duì)各組人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響

3 討 論

miRNA是一種非編碼小RNA分子(約含22個(gè)核苷酸)，存在于植物、動(dòng)物和一些病毒中，功能主要是RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控基因表達(dá)[6]。成熟的miRNA是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的重要組成部分，該沉默復(fù)合體還包括核糖核酸酶和許多相關(guān)的蛋白質(zhì)[7]。miR-204定位于人類第9號(hào)染色體73424891和73425000位之間。有研究表明miR-204在腫瘤組織中存在異常表達(dá)，并與腫瘤增殖[8]、侵襲轉(zhuǎn)移[9]、化療抵抗[10]及不良預(yù)后[11]密切相關(guān)。然而，miR-204在不同的腫瘤中起著不同的作用。比如，miR-204在急性淋巴白血病[12]和前列腺癌[13]腫瘤中高表達(dá)，起癌基因作用，促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。而在鼻咽癌[9]和子宮內(nèi)膜癌[10]等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，起抑癌基因作用，抑制腫瘤的發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，miR-204促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，與Wang 等[14]報(bào)道的結(jié)果一致，抑制細(xì)胞的增殖，這與Xiong等[15]報(bào)道的結(jié)果相似，抑制細(xì)胞的遷移能力，這與Imam等[16]等報(bào)道的結(jié)果相似。研究結(jié)果提示，miR-204在乳腺癌細(xì)胞中起抑癌基因的作用，能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移并促進(jìn)其凋亡，具有作為診治乳腺癌分子靶標(biāo)的潛能。但是miR-204調(diào)控乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制還不是很清楚，還有待于更進(jìn)一步的研究?？傊琺iR-204可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療過程中發(fā)揮重要作用，靶向miR-204治療也可能為乳腺癌的治療提供新思路。

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Effect of miR-204 in cell biological characteristics of breast cancer MDA-MB-231 cell*

WuLiucheng1，2，DuLili1，WangJing1，YinHailin1，MaChao1，JiangMaorong2，ShaoYixiang2△

(1.XinglinCollege，NantongUniversity，Nantong，Jiangsu226009，China；2.LaboratoryAnimalsCentre，NantongUniversity，Nantong，Jiangsu226001，China)

Objective To study the effect of microRNA-204 (miR-204) on the biological characteristics of breast cancer cells.Methods Real-time PCR was used to detect the expression of miR-204 in human breast cancer cell MDA-MB-231 after transfection of miR-204 mimics and inhibitor for 48 h.Flow cytometry was used to analyse the effect of miR-204 on the proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells.The effect of miR-204 on the migration of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell migration assay.Results Real-time PCR analysis showed that miR-204 mimics and inhibitors had significant effect compared with normal control group(P<0.01).Flow cytometry analysis showed that compared with normal control group，the number of G1phase cells of miR-204 mimics group was significantly decreased(P<0.01),while the number of G2/M cells of miR-204 mimics group was significantly increased(P<0.01).In contrast,the number of G1phase cells of miR-204 inhibitor group was significantly increased(P<0.01),while the number of G2/M cells of miR-204 inhibitor group was significantly decreased(P<0.01).miR-204 mimics group significantly promoted apoptosis,while the inhibitor group significantly inhibited apoptosis(P<0.01).Transwell migration analysis showed that the number of cells of miR-204 mimics group were significantly reduced,while the number of cells was significantly increased in the inhibitor group(P<0.01).Conclusion We find miR-204,which can promote cell apoptosis and inhibit cell proliferation and migration,is a negative factor in the breast cancer cell line MDA-MB-231.

breast neoplasms;apoptosis;MicroRNAs;miR-204;MDA-MB-231;cell biological characteristics

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.004

江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201513993009Y)。 作者簡(jiǎn)介：吳劉成(1980-)，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事人類疾病動(dòng)物模型方面研究?！?/p>

，E-mail:shaoyx@ntu.edu.cn。

Q291

A

1671-8348(2017)14-1881-04

2016-11-23

2017-01-11)